Name: Luso di chemostati in Biologia microbica Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T20:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Scopri l'uso dei chemostati in biologia microbica per controllare la crescita cellulare e studiare la regolazione fisiologica. Questo metodo consente analisi sistemiche dell'evoluzione adattativa.

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Questo lavoro è stato sostenuto da start up fondi dalla New York University. Ringraziamo Maitreya Dunham e Matt Brauer che ha inizialmente sviluppato l&#39;uso di bioreattori Sixfors come chemostati.

Il principio di coltura continuo utilizzando un chemostat può essere realizzato in una varietà di implementazioni. In tutti chemostati è essenziale per avere 1) metodi per mantenere la sterilità di tutti i componenti, 2) una cultura ben miscelato, 3) aerazione adeguata del recipiente di coltura e 4) in modo affidabile Inoltre media e rimozione cultura. Qui, descriviamo l&#39;uso di un bioreattore Sixfors (Infors Inc) come chemostat utilizzando metodi che possono essere facilmente adattato alle configurazioni alternative. 1. Montaggio delle navi chemostato <ol><li> Accendere i Sixfors utilizzando l&#39;interruttore principale. </li><li> Sciacquare accuratamente la nave chemostato, assemblaggio agitatore, e il tubo attaccato con acqua deionizzata (DI). Controllare tutti i tubi e anelli di tenuta e sostituire eventuali pezzi usurati cercando. </li><li> Assicurarsi che la base di supporto albero motore è rivolto verso l&#39;alto nel recipiente di vetro e che la parte superiore dell&#39;albero motore viene agganciato nella sua sede sul gruppo agitatore. Impostare il stirreassembly r nel recipiente di vetro garantendo fondo dell&#39;albero motore è seduto nel supporto dell&#39;albero motore. Utilizzare il morsetto per fissare il gruppo agitatore nel recipiente di vetro. </li><li> Riempire il serbatoio con circa 300 ml di acqua deionizzata. </li><li> Rimuovere i tappi da un ossigeno disciolto (DO 2) sonda e controllare il livello di elettroliti svitando il carter inferiore e fare in modo che il corpo inferiore è riempita a metà con soluzione elettrolitica. Riavvitare il carter inferiore e inserire nella porta sulla nave chemostato. Avvitare fino a stringerla. </li><li> Prendete una sonda pH e rimuoverlo dal suo buffer di memoria (3 M KCl). Rimuovere il tappo sonda pH e allegare al fermentatore 1. Utilizzando la schermata di controllo Sixfors, accedere al menu dei parametri fermentatore e selezionare &quot;calibrare pH&quot;. Posizionare la sonda pH in un buffer standard di pH 7 e la lettura record come Alta Read. Ripetere con pH 4 e la lettura record come Low lettura. Staccare la sonda pH dal fermentatore, lavare con acqua deionizzata e inserire la sonda into la porta sulla nave chemostato. Avvitare fino a stringerla. </li><li> Posizionare il vaso chemostato nel rack. Nota sulla nave che fermentatore (1-6) la sonda pH è stato collegato e calibrato. Mettere il tappo sonda pH sulla sonda pH. Utilizzando un foglio di coprire ermeticamente la parte superiore della sonda DO 2. </li><li> Piegare un foglio sopra le estremità del tubo attaccato alla nave chemostato. </li><li> Ripetere i passaggi 1,2-1,8 per tutte le navi. </li><li> Sterilizzare i vasi da essi autoclave per 15 minuti su un ciclo liquido. </li></ol> 2. Preparazione del supporto <ol><li> Stabilire la gamma di limitazione delle concentrazioni di una sostanza nutritiva crescendo culture lotti in diverse concentrazioni di nutrienti. Il nutriente è limitante nell&#39;intervallo in cui la densità cellulare finale è una funzione lineare della concentrazione iniziale di nutrienti (Figura 4). Seleziona una concentrazione di nutrienti ben all&#39;interno della gamma di limitazione. Esempi di composizione supporti standard per studi con Saccharomyces cerevisiae sono disponibili in 7-11. </li><li> Autoclave una damigiana vuota che viene ricoperto con un tappo di gomma contenente un ingresso e l&#39;uscita dei media dopo la prima garantire che l&#39;estremità del tubo supporto è coperto in un foglio. </li><li> In un recipiente separato preparare 10 L di media. </li><li> Attaccare una tazza di filtro da 500 ml per una bottiglia da 100 ml media. Rimuovere il filtro in cotone con una pinza sterilizzati in etanolo e collegare immediatamente alla porta filtrazione su damigiana media. </li><li> Fissare la damigiana media per una sorgente di vuoto e filtro sterilizzare i media aggiungendo alla coppa del filtro. </li><li> Quando la filtrazione dei media è completa, chiudere la porta di filtrazione con una fascetta di metallo. </li></ol> 3. Calibrazione DO 2 sonde e configurazione chemostato <ol><li> Dopo i vasi chemostato sono stati sterilizzati in autoclave e lasciato raffreddare luogo della nave nel suo corrispondente giacca calore. Collegare la sonda di temperatura, sonda pH, e DO sonda 2. Lasciate che ilnave sedersi con l&#39;alimentazione per almeno 6 ore per consentire DO 2 sonde per polarizzare. </li><li> Posizionare l&#39;estremità di ogni tubo effluenti in un recipiente di raccolta separata. Collegare l&#39;aria attraverso un filtro di autoclave e accendere il flusso d&#39;aria. L&#39;acqua in ogni nave deve fuoriuscire dei tubi effluenti, che indica che tutte le guarnizioni siano adeguatamente formate. </li><li> Regolare l&#39;altezza del tubo effluente secondo il volume di lavoro desiderata (ad esempio 300 ml). Usiamo un righello contrassegnato con posizionamenti tubo calibrato ai diversi volumi di lavoro. </li><li> Collegare la damigiana supporto alla nave chemostato. Utilizzare etanolo al fine di mantenere le estremità del tubo sterile come possibile. Infilare il tubo della pompa attraverso la pompa e pinza aperta. Premere manualmente la pompa fin quando si inizia a fluire nel recipiente chemostat. Rilasciare il tubo dalla pompa, media dovrebbero fluire liberamente nel vaso chemostato. Quando i media raggiunge il tubo effluenti, riattaccare il tubo alla pompa e pinza. </li><li> Inizia running il programma di base con girante impostato a 400 rpm e la temperatura impostata a 30 ° C. </li><li> Per calibrare fare 2 sonde, spegnere alimentazione dell&#39;aria e passare a gas azoto. Attendere almeno un&#39;ora e registrare il valore di misura come &quot;basso read&quot;. Tornare alla alimentazione dell&#39;aria (ossia con concentrazione di ossigeno ambiente), attendere almeno un&#39;ora supplementare e misura record come &quot;high lettura&quot;. </li><li> Avviare la registrazione dei dati utilizzando il software Iris. </li></ol> 4. Inoculazione <ol><li> Utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare la parte superiore del recipiente di coltura. </li><li> Rimuovere la vite sulla parte superiore della nave e pipetta 1 ml di una cultura durante la notte nel vaso chemostato. Stringere nuovamente la vite. </li><li> Indicare il tempo di inoculazione in Iris. </li><li> Attendere circa 24 ore per le culture di raggiungere presto fase stazionaria. Come la cultura cresce, ossigeno disciolto e pH diminuisce. Nel caso di mezzi di glucosio-limitante, ossigeno disciolto tornerà ~ 100% in PHA stazionariaSE. Per altre limitazioni nutrienti ossigeno disciolto rimarrà &lt;100% in fase stazionaria. </li></ol> 5. Avvio Pompe e raggiungimento dello stato stazionario <ol><li> Il tasso di diluizione viene calcolata dividendo la portata (quante con fluido nel recipiente per ora) dal volume di coltura. Ad esempio, utilizzando un volume di 300 ml, un tasso di diluizione di 0,1 significa che 30 ml di supporto vengono aggiunti alla coltura ogni ora. Poiché il sistema è sotto pressione positiva lo stesso volume viene rimossa dal recipiente garantire che la cultura è continuamente diluito. Una gamma di tassi di diluizione (D) può essere usata che non superano il tasso massimo di crescita (μ max) delle cellule, oltre il quale le cellule verranno lavate fuori della chemostato. </li><li> Scegliere le impostazioni della pompa, che specificano il numero di secondi la pompa è accesa e spenta, per stabilire la portata desiderata. La pompa fornisce supporto ad una velocità di circa 0,11 ml / sec. </li><li> Definire un programma con l&#39;int Sixforserface che specifica la fasatura della pompa, la temperatura e la velocità girante. Avviare il programma. </li><li> Svuotare i recipienti di raccolta di liquido e registrare il tempo. </li><li> Dopo almeno due ore, utilizzare un cilindro graduato per misurare quanto i media è stato rimosso dal vaso. Questo sarà uguale al volume che è stato aggiunto al recipiente chemostat. Calcolare il tasso di diluizione (D = V effluenti / V cultura / tempo). Regolare le impostazioni della pompa se il tasso di diluizione calcolato non corrisponde alla percentuale di diluizione desiderata. </li><li> Allo stato stazionario, densità cellulare nel chemostato non cambia nel tempo. Questo può essere misurata senza perturbare la cultura campionando il deflusso. Noi definiamo operativamente il raggiungimento dello stato stazionario come misurazioni della densità delle cellule identiche che sono separati da almeno un raddoppio della popolazione. Raggiungere stato stazionario richiederà circa otto generazioni la cultura dopo l&#39;inizio della diluizione cultura. Allo stato stazionario, le cellule crescono in modo esponenziale (i.e. tasso di crescita costante nel tempo) in condizioni di nutrienti limitato. Il tempo di raddoppio della popolazione (tempo di generazione) è ln (2) / D. </li><li> Continua misurare periodicamente volumi di effluenti per la durata dell&#39;esperimento per garantire che un tasso di diluizione è mantenuta costante. </li></ol> 6. Applicazione 1: Studiare Cells crescendo a diversi tassi in condizioni di stato stazionario <ol><li> Allo stato stazionario nel chemostato, il tasso di crescita della popolazione di cellule è pari al tasso di diluizione. Alterando sistematicamente il tasso di diluizione è possibile coltivare cellule a velocità diverse. Ciò consente lo studio sistematico di parametri fisiologici che variano con il tasso di crescita compreso il volume delle cellule, stadio del ciclo cellulare e la resistenza allo stress. Inoltre, i profili steady-state di mRNA globale, proteine ​​e livelli dei metaboliti possono essere analizzati in cellule in crescita a ritmi diversi. Ci sono due modi per acquisire campioni: </li><li> I piccoli campioni possono essere passivamente obmantenuta inserendo l&#39;estremità del tubo effluente in una provetta da 1,5 ml o 15 ml. Un campione di 1-5 ml può essere ottenuta in pochi minuti (a seconda della portata). Molti parametri fisiologici possono essere misurati da questi campioni. </li><li> Espressione genica, o metabolita analisi richiedono grandi campioni che devono essere ottenuti più rapidamente possibile. Posizionare l&#39;estremità del tubo effluente in un tubo da 15 ml. Allentare la vite che fissa la fine del metallo del tubo effluenti e spingere delicatamente verso il basso. Un campione di 10 ~ ml sarà rapidamente riempire il vostro tubo. Tenete a mente che il volume nel recipiente chemostato è cambiato. Se vengono prese molti campioni consecutivi può essere necessario per ridurre il flusso di mantenere un tasso di diluizione costante. </li></ol> 7. Applicazione 2: Misura precisa delle differenze nei tassi di crescita tra i genotipi in ambienti controllati mediante saggi Concorso basati Citometria a Flusso <ol><li> Chemostati possono essere utilizzati per quantificare con precisione l&#39;effetto della concentrazione di nutrientisulle differenze nei tassi di crescita (cioè fitness) tra i diversi background genetico. Da ceppi co-coltura marcati con proteine ​​fluorescenti differenti il ​​tasso di variazione relativa abbondanza durante la crescita esponenziale è determinata. L&#39;esecuzione di questo test a diverse velocità di diluizione (D) permette lo studio degli effetti della concentrazione di nutrienti (s) sulle differenze di fitness. </li><li> Stabilire culture stato stazionario dei due ceppi di navi chemostato separate con tassi di diluizione identici e un volume di 300 ml. </li><li> Passivamente campione 1 ml di ciascuna nave. Spin le cellule, risospendere in tampone fosfato (PBS), e posto a 4 ° C. Questi campioni contengono campioni di cellule omogenee, che sono controlli per la successiva analisi di citometria a flusso. </li><li> Posizionare il tubo effluenti da una nave in un cilindro graduato autoclave. Allentare la vite che fissa la fine del metallo del tubo effluenti e spingere delicatamente verso il basso per espellere le cellule dal chemostato. Quandoil volume raggiunge 150 ml, di ritorno alla fine metallo del tubo effluenti nella sua posizione originale (300 ml). Ripetere con il secondo recipiente, utilizzando un cilindro graduato differente. </li><li> Utilizzare etanolo al 70% per mantenere la sterilità durante la rimozione vite sulla parte superiore del recipiente chemostat. Mettere imbuto in apertura e versare 150 ml dalla altra cultura nel vaso chemostato. Stringere nuovamente la vite. Ripetere con la seconda sezione, utilizzando il secondo imbuto. Ogni nave chemostato ora contiene una miscela dei due ceppi. </li><li> Ottenere un campione di 1 ml da ogni nave con campionamento passivo ogni 2-6 ore. Spin le cellule, risospendere in PBS e conservare a 4 ° C. Continua il prelievo di campioni per 2-3 giorni con attenzione registrando il tempo di ogni campione è stato preso. </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento, ultrasuoni e diluire campioni a ~ 2 x 10 6 cellule / ml. Citometria a flusso, misurare la proporzione dei due ceppi in ciascun campione. Poiché entrambi i ceppi sono in crescita esponenziale, la differenza di tasso di crescita relativa èdeterminata mediante regressione lineare di ln (strain1/strain2) contro il tempo (misurato in generazioni). La pendenza della regressione è proporzionale alla differenza nel tasso di crescita (cioè il vantaggio fitness) di un ceppo rispetto all&#39;altro. </li><li> Come la coltura mista può richiedere un certo tempo per raggiungere un nuovo stato stazionario, punti di tempo iniziale possono adattarsi male alla regressione. Questo problema viene risolto meglio, consentendo 2-3 generazioni che deve trascorrere prima di iniziare il campionamento o rimuovere i primi punti che sono valori anomali chiare. Invece, una volta un ceppo ha outcompeted dall&#39;altro i dati non sono più utili e questi punti devono essere esclusi. </li></ol> 8. Applicazione 3: Evolution Sperimentale <ol><li> Evoluzione sperimentale eseguita in chemostati seleziona per mutanti che sono aumentati in palestra nell&#39;ambiente di nutrienti limitato. La selezione viene generalmente eseguita su centinaia di generazioni. </li><li> Stabilire una cultura chemostato steady-state utilizzando un ceppogenotipo di nota (e di sequenza del genoma, preferibilmente noto) e un nutriente-limite definito. </li><li> Per mantenere un &quot;fossile&quot; della popolazione che adegua passivamente Campione chemostato ogni 2-3 giorni e memorizzare il campione in 15% glicerolo a -80 ° C. </li><li> Monitorare il serbatoio media e ricostituire con mezzi freschi se necessario. </li><li> Mantenere la coltura in crescita esponenziale per diverse centinaia di generazioni. </li><li> Dopo il completamento della piastra di selezione di un campione di cellule su piastre di agar solido. Dopo che le cellule sono cresciute in colonie, raccogliere un campione imparziale delle colonie con stuzzicadenti e inoculare cloni in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 100 ml di media. Permettere ai campioni clonali di crescere durante la notte, aggiungere 100 ml di 30% di glicerolo e conservare in -80 ° C. </li><li> Caratterizzare cloni per intero sequenziamento del genoma e l&#39;esecuzione di analisi fenotipiche tra cui la valutazione di idoneità, utilizzando un ceppo di riferimento comune fluorescente, come descritto nella domanda 2. &lt;/ Li&gt; </ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Chemostati permettono la coltivazione di microbi in condizioni di steady-state di crescita controllata. Le cellule crescono continuamente ad una velocità costante risultante in un ambiente esterno invariante. Questo è in contrasto con i metodi di coltura batch in cui l&#39;ambiente esterno è in continua evoluzione e il tasso di crescita delle cellule è determinata dalla complessa interazione di ambiente e genotipo. Pertanto, un vantaggio importante di coltura microbi in chemostati oltre colture in lotti è la capacità di...

La crescita delle cellule è regolata da complesse reti di interazione dei fattori genetici e ambientali 1,2. La regolazione multifattoriale della crescita cellulare richiede un approccio a livello di sistema allo studio. Tuttavia, lo studio rigoroso della crescita cellulare regolamentato è contestata dalla difficoltà di controllare sperimentalmente la velocità con cui le cellule crescono. Inoltre, anche nelle condizioni più semplici esperimenti extracellulari sono frequentemente dinamico e complesso come cellule alterano continuamente il loro ambiente mentre proliferano. Una soluzione a questi problemi è fornita dal chemostat: un metodo di coltura di cellule che consente il controllo sperimentale dei tassi di crescita delle cellule in ambienti definiti, invarianti e controllati. Il metodo di coltura continuo utilizzando un chemostat è stato descritto in modo indipendente da Monod 3 e Novick &amp; Szilard 4 nel 1950. Come originariamente concepito, le cellule sono coltivate in un volume fisso di supporto che è constantemente diluita con l&#39;aggiunta di nuovi media e la rimozione simultanea di vecchi media e cellule (Figura 1). Accoppiate equazioni differenziali ordinarie (Figura 2) descrivono il tasso di variazione della densità delle cellule (x) e la concentrazione di una sostanza nutritiva (s) crescita limitativo nel recipiente chemostat. È importante sottolineare che questo sistema di equazioni prevede un unico (diverso da zero) stabile allo stato stazionario (Figura 3) con l&#39;implicazione notevole che allo stato stazionario, il tasso di crescita specifico delle cellule (cioè il costante tasso di crescita esponenziale), è pari al tasso alla quale la coltura è diluito (D). Variando la velocità di diluizione è possibile stabilire popolazioni steady-state di cellule a tassi di crescita diversi e in diverse condizioni di scarsità di nutrienti. Il controllo sperimentale del tasso di crescita utilizzando chemostati è stato fondamentale per lo sviluppo di una comprensione di come i cambiamenti fisiologia cellularecon tassi di crescita 5,6. Tuttavia, questo ex pilastro dei metodi microbiologici divenne sempre più oscuro durante l&#39;esplosione nella ricerca di biologia molecolare nel corso del tardo ventesimo secolo. Oggi, rinnovato interesse nel controllo della crescita in entrambi i microbi e organismi multicellulari e l&#39;avvento di metodi genoma scala per analisi a livello di sistema ha rinnovato motivazione per l&#39;uso di chemostati. Qui, descriviamo tre applicazioni che capitalizzano il controllo preciso dei tassi di crescita delle cellule e l&#39;ambiente esterno che sono unicamente possibile con chemostati. In primo luogo, si descrive l&#39;uso di chemostati per studiare come l&#39;abbondanza di migliaia di biomolecole - come trascrizioni e metaboliti - sono coordinatamente regolato con il tasso di crescita. In secondo luogo, si descrive come chemostati possono essere utilizzati per ottenere stime precise delle differenze di tasso di crescita tra i diversi genotipi in ambienti nutrienti limitata con esperimenti di competizione. In terzo luogo, si descrive come chemostati puòessere usato per studiare l&#39;evoluzione adattativa di cellule che crescono in ambienti poveri di nutrienti costanti. Questi esempi esemplificano i modi in cui i chemostati stanno consentendo indagini sistemi a livello di regolazione della crescita delle cellule, geni da interazioni ambientali e l&#39;evoluzione adattativa.

<table><tbody><tr><td>Infors-HT Sixfors Chemostat</td><td>Risorse tecniche appropriate, Inc.</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bottiglia di vetro 9,5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-887-1</td><td>Per recipiente per media e</td></tr> tubo flessibile <tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>05-867</td><td>Per tubo flessibile e tappo per tubi</td></tr><tr><td>, misura 12, neoprene verde</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-62991-42</td><td>Per tubo flessibile</td></tr><tr><td>e connettore diritto</td> per tubi flessibili <td>Cole-Palmer</td><td>EW-30703-02</td><td>Per media vessel e tubo</td></tr><tr><td>flessibile Generale fascette 4 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9557052</td><td>per recipienti per fluidi e tubi flessibili</td></tr><tr><td>, B000FMWTDE in gomma siliconica</td><td></td><td></td><td>per recipienti e</td></tr><tr><td>tubi flessibili, silicone, 3/8 in OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1Q</td><td>per recipienti per fluidi e</td></tr><tr><td>tubi flessibili, silicone, 7/32 in OD</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-587-1E</td><td>per recipienti per fluidi e tubi flessibili</td></tr><tr><td>Tubi, acciaio inossidabile, 3/16 pollici OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>6100K164</td><td>Per recipienti per fluidi e tubi flessibili</td></tr><tr><td>, acciaio inossidabile, 3/8 pollici</td> OD <td>McMaster-Carr</td><td>6100K161</td><td>Per recipienti per fluidi e connettori per ganci per tubi flessibili</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>Scientific 14-66-18Q</td><td>Per recipiente per fluidi e tubo flessibile</td></tr><tr><td>Morsetto a cricchetto</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-06403-11</td><td>Per recipiente per fluidi e tubo flessibile</td></tr><tr><td>Luer, femmina</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-45512-34</td><td>per recipiente multimediale e tubo</td></tr><tr><td>Luer, maschio</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-45513-04</td><td>per recipiente multimediale e tubo flessibile</td></tr><tr><td>Millipore Aervent MTGR05010 filtro da 62 mm, 0,2 &; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>MTGR05010</td><td>per recipiente per media e tubi flessibili</td></tr><tr><td>PTFE Acrodisc CR 13 mm, 0,2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9131037</td><td>per recipiente per fluidi e tubi flessibili</td></tr><tr><td>Tubo di flusso a lettura diretta per aria</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32047-77</td><td>Per configurazione di azoto gassoso</td></tr><tr><td>Tubo di flusso a lettura diretta per azoto</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-32048-63</td><td>Per configurazione di azoto gassoso</td></tr><tr><td>Dosatore di gas Telai multitubo</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-50</td><td>Per configurazione</td></tr> <tr><td>di azoto gassosoRegolatore, analitico a due stadi</td><td>Airgas</td><td>Y12-N145D580</td><td>per l'installazione del gas di azoto</td></tr><tr><td>Adattatore per tubo flessibile, acciaio inossidabile</td><td>Airgas</td><td>Y99-26450</td><td>per l'installazione del gas di azoto</td></tr><tr><td>Adattatore maschio</td><td>Airgas</td><td>WES544</td><td>per l'installazione dell'azoto gassoso</td></tr><tr><td>Tubi in norprene</td><td>US Plastics</td><td>57280</td><td>Per l'installazione dell'azoto Gas</td></tr><tr><td>Base per treppiede</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03218-58</td><td>Per l'impostazione dell'azoto gassoso</td></tr><tr><td>Cartucce per valvole</td><td>Cole-Palmer</td><td>EW-03217-92</td><td>Per l'installazione dell'azoto gassoso</td></tr><tr><td>Damigiana 10 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-963-2A</td><td>Per la preparazione dei terreni</td></tr><tr><td>Filtri sterili per flaconi sottovuoto Steritop, 1.000 ml, membrana in PES; per collo da 45 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGP-T10-RE</td><td>Per la preparazione dei terreni</td></tr><tr><td>Flacone per terreni da 100 ml, collo</td> <td>da 45 mmFisher Scientific</td><td>FB-800-100</td><td>per la preparazione dei terreni</td></tr><tr><td>cloruro di calcio&middot; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>solfato di magnesio&middot; 7H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>fosfato di potassio monobasico</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>solfato di ammonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423400010</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>cloruro di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr>acido<td>borico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>solfato di rame&middot; 5H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>209198 Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>ioduro di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60400</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>per terreni cloruro ferrico&middot; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-100</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>solfato di manganese&middot; H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td>Media Reagenti</td></tr><tr><td>molibdato di sodio&middot; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>solfato di zinco&middot; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>biotina Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP232-1</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>pantotenato di calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC24330-1000</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>per terreni acido folico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>per terreni inositolo (noto anche come mio-inositolo)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12226-1000</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>niacina (alias acido nicotinico)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>acido p-aminobenzoico</td><td>Fisher</td><td>Scientific AC14621-2500</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>per terreni piridossina HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9755</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>per terreni riboflavina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R4500-25G</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>per terreni tiamina HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP892-100</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>per terreni Leucina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0750</td><td>Reagenti per terreni</td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0155-08-5</td><td>Reagenti per terreni</td></tr></tbody></table>

l&#39;uso di chemostati in biologia microbica sistemi

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Le cellule regolano il loro tasso di crescita in risposta a segnali dal mondo esterno. Con la crescita della cellula, diversi processi cellulari devono essere coordinati tra cui la sintesi macromolecolare, metabolismo e infine, l&#39;impegno per il ciclo di divisione cellulare. Il chemostato, un metodo per controllare sperimentalmente tasso di crescita cellulare, fornisce un potente mezzo di sistematicamente studiare come impatti tasso di crescita processi cellulari - tra l&#39;espressione genica e del metabolismo - e le reti di regolazione che controllano il tasso di crescita delle cellule. Quando mantenuta per centinaia di generazioni chemostati può essere usato per studiare l&#39;evoluzione adattativa di microbi in condizioni ambientali che limitano la crescita cellulare. Descriviamo il principio di culture chemostato, dimostriamo loro funzionamento e fornire esempi delle loro varie applicazioni. Dopo un periodo di inattività dopo la loro introduzione a metà del XX secolo, la convergenza delle metodologie genoma scala con una rinnovata nelteresse nella regolazione della crescita cellulare e la base molecolare della evoluzione adattativa è stimolare una rinascita nell&#39;uso di chemostati nella ricerca biologica.

Uno dei principali vantaggi di chemostati è la capacità di controllare la velocità di crescita delle cellule sperimentalmente variando il grado di diluizione. Nel lievito erba, Saccharomyces cerevisiae, la morfologia di una cellula è informativo della fase del ciclo di divisione cellulare. Popolazioni con tassi di crescita contengono una percentuale maggiore di divisione attivamente cellule come determinato misurando la frazione di cellule unbudded (Figura 5A). Analisi di espressione mRNA globale di cul...

Il tasso di crescita delle cellule è un processo regolato e un determinante fondamentale della fisiologia cellulare. Coltura continua utilizzando chemostati consente il controllo estrinseco di crescita cellulare mediante limitazione nutritiva facilitare lo studio delle reti molecolari che controllano la crescita cellulare e come tali reti evolvono per ottimizzare la crescita cellulare.

L&#39;uso di chemostati in Biologia microbica Sistemi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Gli obiettivi generali della seguente presentazione sono descrivere il principio del chemostato, dimostrarne il funzionamento e fornire esempi di applicazioni che utilizzano i chemostati. Questo viene ottenuto innanzitutto assemblando il reattore del chemostato, inoculandolo e quindi aggiungendo continuamente nuovo mezzo mentre si rimuovono vecchio mezzo e cellule a un tasso costante. Un modello matematico descrive la variazione della densità cellulare e la variazione della concentrazione di un nutriente limitante per la crescita all'interno di ciascun chemostato.L'utilizzo di queste equazioni consente la previsione di un singolo stato stazionario stabile non nullo, in cui le concentrazioni cellulari e dei nutrienti sono costanti e la velocità specifica di crescita delle cellule è uguale alla velocità con cui le cellule vengono rimossi. Combinando il controllo preciso della crescita cellulare e dell'ambiente all'interno dei chemostati con altre tecnologie, è possibile ottenere risultati che permettono indagini a livello di sistema sulla regolazione della crescita cellulare, sui cambiamenti genetici e sull'evoluzione adattativa. Il principale vantaggio di questo metodo di coltura cellulare rispetto ad altre tecniche è che la velocità di crescita è controllata e l'ambiente esterno della cellula rimane costante.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia cellulare e dell'evoluzione, ad esempio qual è la base molecolare della regolazione della crescita cellulare e dell'evoluzione adattativa in ambienti definiti. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché l'allestimento e il mantenimento delle colture in chemostato sono complessi a causa del gran numero di passaggi e componenti coinvolti. Iniziare questa procedura accendendo innanzitutto il sistema six four mediante l'interruttore principale.Successivamente, sciacquare accuratamente il recipiente dell'ematostato, l'insieme di agitazione e i tubi collegati con acqua deionizzata. Controllare tutti i tubi e le guarnizioni ad anello (O-ring) e sostituire le parti usurati o dall'aspetto logoro. Una volta assemblati l'insieme di agitazione e l'albero motore, riempire il recipiente con 300 millilitri di acqua DI.Verificare il livello dell'elettrolita nella sonda per l'ossigeno disciolto, assicurandosi che il contenitore inferiore sia riempito per metà con soluzione elettrolitica. Successivamente, calibrare la sonda del pH. Una volta calibrata, staccare la sonda dal fermentatore.Risciacquare con acqua deionizzata e inserirla nel portello del vaso emostatico. Avvitare fino a quando non è ben stretto. Con le sonde collegate, posizionare il vaso emostatico nel supporto, assicurandosi di annotare sul vaso con quale fermentatore è stata calibrata la sonda del pH. Infine, preparare le sonde e i tubi per l'autoclavaggio posizionando il cappuccio sulla sonda del pH e coprendo la sonda di ossigeno disciolto e tutte le estremità libere dei tubi con della stagnola adatta all'autoclave.Un carrello vuoto chiuso con un tappo di gomma contenente un ingresso per l'aria e un'uscita per il mezzo. Assicurarsi che l'estremità del tubo del mezzo sia coperta con carta stagnola. Collegare una coppa filtrante da 500 millilitri a una bottiglia da 100 millilitri contenente il mezzo.Rimuovere il filtro di cotone dal filtro con pinze, sterilizzate ed etanolo, e collegarlo immediatamente al portafiltro sulla caraffa del mezzo. Collegare la caraffa del mezzo a una sorgente di vuoto ed effettuare la filtrazione. Sterilizzare 10 litri di mezzo appena preparato aggiungendolo alla coppa del filtro.Al termine della filtrazione del mezzo, chiudere il porto di filtrazione con una pinza metallica. Dopo che i vasi emostatici sono stati sottoposti ad autoclave e lasciati raffreddare, posizionare il vaso nella rispettiva guaina riscaldata. Collegare la sonda di temperatura, la sonda pH e la sonda di ossigeno disciolto.Lasciare il contenitore acceso per almeno sei ore per consentire la polarizzazione delle sonde per l'ossigeno disciolto. Successivamente, collegare il carbo del mezzo al contenitore emostatico. Utilizzare etanolo per mantenere le estremità dei tubi il più sterili possibile.Quindi far passare il tubo della pompa attraverso la pompa e aprire la pinza. Successivamente, posizionare l'estremità di ciascun tubo di effluente in un apposito contenitore di raccolta. Collegare la sorgente d'aria attraverso un filtro per autoclave e attivare il flusso d'aria.L'acqua in ogni muscolo dovrebbe fuoriuscire dai tubi di effluente, il che indica che tutte le guarnizioni sono state formate correttamente. Regolare l'altezza del tubo di effluente in modo da raggiungere il volume operativo desiderato di 300 millilitri. Premere manualmente la pompa finché il mezzo non inizia a fluire nel recipiente emostatico.Quindi rilasciare il tubo dalla pompa. Quando il mezzo raggiunge il tubo di effluente, riattaccare il tubo alla pompa e fissarlo con una molletta, assicurandosi che sia stato primeato con il mezzo. Avviare l'esecuzione del programma base con l'impeller impostato a 400 giri/min e la temperatura a 30 gradi Celsius.Successivamente, calibrare le sonde di ossigeno disciolto spegnendo l'alimentazione d'aria e passando al gas azoto. Attendere almeno un'ora e registrare il valore misurato come lettura bassa. Tornare quindi all'alimentazione con aria contenente una concentrazione ambientale di ossigeno e attendere almeno un'ulteriore ora.Registrare questa misurazione come valore di lettura alto. A questo punto, avviare la registrazione dei dati utilizzando il software iris prima dell'inoculazione. Sterilizzare la parte superiore del contenitore di coltura con etanolo al 70%.Quindi aprire la porta del vaso utilizzando un cacciavite e pipettare un millilitro di una coltura ottenuta nell'over-night nel vaso, sostituendo la vite al termine dell'operazione. Una volta che le colture hanno raggiunto la fase stazionaria iniziale, avviare le pompe e stabilire una velocità di flusso desiderata. Specificando il numero di secondi in cui la pompa è accesa e spenta, si determinano la velocità di flusso e il volume della coltura.Determinare la velocità di diluizione. Utilizzando l'interfaccia six fours, definire un programma che specifichi la temperatura di temporizzazione della pompa e la velocità dell'agitatore. Quindi avviare il programma dopo almeno due ore.Registrare il tempo e utilizzare un cilindro graduato per misurare la quantità di mezzo rimossa dal recipiente. La quantità rimossa sarà pari al volume aggiunto al recipiente con clamp emostatico e può essere utilizzata per calcolare la velocità di diluizione, prelevare il flusso in uscita e utilizzarlo per misurare la densità cellulare. La crescita in condizioni di stato stazionario si ottiene quando la densità cellulare non cambia nel tempo.Una volta raggiunto uno stato stazionario, acquisire piccoli campioni prelevandoli dal tubo di effluente per alcuni minuti, lasciando che il liquido fluisca passivamente in un tubo di raccolta. Per le analisi di espressione genica e di metaboliti sono necessari campioni più grandi. Questi possono essere rapidamente ottenuti svitando il dispositivo, tenendo saldamente l'estremità metallica del tubo di effluente e abbassando lentamente il tubo.Quando viene rimossa un'ampia quantità di volume, la portata deve essere ridotta per mantenere la stessa velocità di diluizione. Innanzitutto, stabilire colture in stato stazionario di due ceppi di lievito con velocità di diluizione e volumi identici. Prelevare passivamente un millilitro da ciascun contenitore da utilizzare come controllo per l'analisi successiva mediante citometria a flusso. Centrifugare le cellule per un minuto a 6.000 giri al minuto, risospendere il pellet in un millilitro di PBS e conservare il tubo a quattro gradi Celsius.Successivamente, posizionare il tubo di effluente da un singolo recipiente alla volta in un cilindro graduato da autoclave. Rilasciare la vite che fissa il tubo di effluente e spingere delicatamente verso il basso per espellere 150 millilitri di cellule dal chemostato, quindi riportare l'estremità metallica del tubo di effluente alla sua posizione originale. Al termine, dopo aver sterilizzato l'area, aprire il portello del recipiente nella parte superiore del contenitore del chemostato.Posizionare un imbuto sterile nell'apertura e aggiungere 150 millilitri dall'altra coltura. Quindi chiudere il portello e ripetere con il secondo contenitore. Ogni contenitore ora contiene una miscela 50 50 delle due ceppi; è possibile prelevare campioni ogni due-sei ore per due-tre giorni.Conservare i campioni in PBS e analizzare le proporzioni delle varianti in ciascun campione mediante citometria a flusso. Dopo aver stabilito una coltura in chemostato a stato stazionario utilizzando una variante di genotipo noto con una limitazione nutritiva definita, mantenere la coltura inalterata per diverse centinaia di generazioni, ricaricando il serbatoio di mezzo con mezzo fresco secondo necessità. Mantenere un archivio fossile della popolazione in adattamento prelevando passivamente il flusso in uscita ogni due o tre giorni.Conservare il campione in glicerolo al 15% a meno 80 gradi Celsius. Dopo il completamento della selezione, si è effettuato un campionamento di cellule su piastre di agar solido. Una volta che le cellule sono cresciute formando colonie, selezionare un campione imparziale di colonie utilizzando degli stuzzicadenti e inoculare i cloni in pozzetti individuali di una piastra a 96 pozzetti contenente 100 microlitri di terreno. Lasciare crescere i campioni clonali per tutta la notte.Quindi aggiungere 100 microlitri di glicerolo al 30% in ogni pozzetto e conservare a -80 gradi Celsius fino all'uso per l'analisi genomica. Un vantaggio principale delle chemostati è la capacità di controllare la velocità di crescita delle cellule. La percentuale di cellule di lievito, che presentano gemmazione come mostrato qui sull'asse Y, rappresenta in modo accurato la loro velocità di crescita.Come mostrato qui. Questa percentuale aumenta in maniera quasi lineare all'aumentare della velocità di diluizione. Velocità di diluizione più elevate determinano velocità di crescita più rapide, che possono portare ad aumenti sistematici dell'espressione genica, rappresentati qui da un incremento dell'abbondanza di mRNA con UTR due.Tuttavia, diminuzioni sistematiche dell'espressione genica possono verificarsi anche con un aumento del tasso di crescita, come nel caso dell'ASM uno. La fitness relativa di diversi genotipi può essere determinata conducendo saggi di competizione in chemostati mediante l'uso di cellule marcate con fluorocromo e analisi mediante citometria a flusso; qui viene mostrato un risultato rappresentativo in cui un mutante è stato messo in competizione con un ceppo selvatico marcato con fluorocromo. In questo esempio, il ceppo mutante presenta un vantaggio del 40% nel tasso di crescita per generazione.L'analisi della sequenza del genoma completo può essere utilizzata per identificare mutazioni acquisite in cellule con fitness aumentata, a seguito di selezione a lungo termine in chemostati. Ad esempio, l'analisi di esperimenti indipendenti di evoluzione adattativa in condizioni di limitazione di azoto ha identificato diversi alleli con variante nel numero di copie nel locus gap, che codifica per la permeasi generale degli aminoacidi. Seguendo questa procedura, altri metodi come la spettrometria di massa, la citometria a flusso e il sequenziamento di nuova generazione possono essere utilizzati per rispondere a domande simili riguardo alla regolazione a livello di sistema della crescita cellulare e dell'evoluzione adattativa.Dopo lo sviluppo di questa tecnica, che ha aperto la strada ai ricercatori nei campi dalla microbiologia alla biologia cellulare per studiare come la fisiologia cellulare e i processi molecolari siano influenzati dalla variazione del tasso di crescita cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere un'idea chiara su come impostare e mantenere colture in chemostato, nonché sui diversi modi in cui i campioni devono essere preparati per diverse applicazioni.

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