Name: Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine plasmatiche Retinol Binding (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 32 s
Description: Scopri come produrre proteina RBP di alta qualità per studiare in tempo reale il trasporto di retinolo mediato dal recettore STRA6. Questo metodo ottimizza espressione, ripiegamento e purificazione per analisi funzionali accurate.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Supportato da National Institutes of Health di sovvenzione R01EY018144.

1. Produzione, ripiegamento, e Purificazione HPLC di Holo-RBP <ol><li> Trasforma BL-21cells con il vettore pET3a ospitare il cDNA per RBP umano con la sua etichetta 6x sulla N-terminale. Crescono le trasformate BL-21 celle in un agitatore a 37 ° C in media ml 40 LB con carbenicillina fino OD a 600 nm raggiunge 0,5. Indurre l&#39;espressione della proteina RBP con l&#39;aggiunta di 1 mM IPTG a. Crescere i batteri a 37 ° C un altro 5 ore. </li><li> RBP prodotto in E. coli è presente soprattutto nei corpi di inclusione insolubili. Per arricchire corpi inclusi, cellule pellet a 10.000 xg per 20 min. Seguito da sonicazione le cellule su ghiaccio in 5 ml di PBS con inibitori della proteasi, seguiti da 2 cicli di gelo e disgelo. Pellet giù i corpi di inclusione a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e mantenere il pellet in ghiaccio. </li><li> Solubilizzare l&#39;inclusione corpo pellet per sonicazione in 10 ml 7,5 M guanidina cloridrato. Aggiungere un volume di mezzo (5 ml) di tampone Tris 25 mM, pH 9,0 e DTT ad una finale concentration di 10 mM. Agitare vigorosamente soluzione in un vortex per una notte a temperatura ambiente per ridurre completamente e denaturare le proteine. </li><li> Centrifugare la soluzione proteica per rimuovere il materiale insolubile a 18.000 xg per 20 min a 4 ° C. Dopo la rotazione, trasferire il surnatante in una nuova provetta e posizionare il tubo in ghiaccio. </li><li> Preparare quattro volumi (60 ml) di tampone di ripiegatura (25 mM Tris, pH 9,0, 0,3 mM cistina, cisteina 3,0 mM, EDTA 1 mM). Degassare il buffer ripiegatura. Preparare anche 600 microlitri 10 mM in etanolo retinolo sotto fioca luce rossa. Conservare al buio in ghiaccio. Sia la soluzione tampone di ripiegamento e retinolo devono essere preparati al momento. </li><li> Raffreddare sia la soluzione proteica e il buffer ripiegamento su ghiaccio per almeno 30 min. Temperature più alte riduce probabilmente la qualità della ripiegato RBP. Aggiungere 1 ml di tampone di ripiegamento goccia a goccia e 10 ul di soluzione retinolo, mentre a sua volta soluzione proteica è vigorosamente miscelato in un becher su ghiaccio. Ripetere questa operazione fino a quando tutti buffer di ripiegamento e retinolovengono aggiunti. Tenere agitazione la reazione in ghiaccio, al buio per 5 ore. </li><li> Centrifugare la reazione di ripiegatura a 24.000 xg per 30 min a 4 ° C. È essenziale eliminare gli aggregati subito dopo la reazione di ripiegatura. </li><li> Concentrare la soluzione supernatante utilizzando Amicon Ultra 15 concentratore (MWCO 10 K) a circa 10 ml. Non concentrare la soluzione ripiegato più di questo livello. Concentrarsi troppo porterà alla aggregazione proteica e riduce la resa finale e la qualità della RBP correttamente piegato. Diluire il campione concentrato con PBS freddo a 100 ml. Lo scopo di questa fase è quello di rimuovere i componenti della reazione di ripiegatura che interferiscono con la purificazione nickel. </li><li> Centrifugare la soluzione ancora una volta a 24.000 xg per 20 min a 4 ° C. È importante rimuovere qualsiasi precipitato. Trasferire il supernatante in due provette da 50 ml, ciascuna contenente 1 ml di Ni-NTA slurry che è stato lavato con PBS. Ruotare le provette a 4 ° C per un&#39;ora. Incubazione f una soluzione diluita dio 1 hr può causare la precipitazione di proteine ​​mal ripiegate che devono essere rimossi. </li><li> Centrifugare le provette a 500 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante con attenzione. Galleggiante Tutto deve essere rimosso. Aggiungere PBS freddo a 30 ml per ciascun tubo. Filare di nuovo e rimuovere il surnatante. Ripetere questo processo fino a quando non vedi nulla, ma perle nel tubo. </li><li> Trasferire la resina Ni-NTA ad una colonna vuota. Lavare resina con 20 volumi di colonna di imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM in PBS. Eluire His-RBP in 5 volumi di colonna di 100 mM imidazolo in PBS. Non conservare questa soluzione per un periodo prolungato di tempo, e congelamento riduce la resa e la qualità finale. Per ottenere risultati ottimali, RBP purificare mediante HPLC immediatamente. </li><li> Dializza His-RBP purificato dalla resina Ni-NTA contro 25 mM Tris, pH 8,4, e 120 mM NaCl. Un concentratore può essere utilizzato anche per lo scambio di buffer. Campioni chiari per HPLC mediante centrifugazione a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C a destra prima di ogni corsa. </li><li> Purificare holo-RBP su HPLC utilizzando uno ioneColonna di scambio AX-300 da un gradiente di NaCl passo (220 mM 12 min, 360 mM 15 min, e 1.000 mm 15 min) con 25 mM Tris, pH 8,4 come fase mobile ad 1 ml / min. Con l&#39;aumento della concentrazione di NaCl, holo-His-RBP viene rilasciato mentre apo-RBP e misfolded RBP rimanere legato alla colonna (Figura 1). Se refolding RBP non avviene in modo ottimale, misfolded RBP (es misfolded RBP-I in Figura 1) può predominare l&#39;intera preparazione. </li><li> Ripristinare il corretto piegato olo-RBP dalle frazioni di picco a 360 mM di NaCl. Monitorare attentamente il profilo di eluizione correttamente piegato e misfolded His-RBP. A partire da 1000 mM di NaCl, la maggior parte di misfolded His-RBP dovrebbero essere liberati. </li><li> Le frazioni contenenti holo-RBP sono riunite, concentrate, e dializzata contro PBS a 4 ° C. Verificare la resa finale e la qualità (330 nm/280 nm) da spettrofotometro. Prodotto correttamente piegati dovrebbe avere un rapporto nm/280 330 nm di poco superiore a 1 (Figura 1). </li><li> Per produzionee apo-RBP, aggiungere un volume uguale di eptano al purificato olo-RBP e mescolare delicatamente ruotando la notte a 4 ° C. Centrifugare a 16.000 g per 10 min a 4 ° C e trasferire accuratamente la fase acquosa inferiore in una nuova provetta (evitando il precipitato all&#39;interfaccia). Ripetere il processo per tre volte con una incubazione per 3 ore ciascuno. Controllare l&#39;assorbimento di uno spettrofotometro Nanodrop per assicurarsi che il picco di 330 nm è scesa al livello di fondo. </li></ol> 2. Monitoraggio in tempo reale di STRA6 catalizzata Retinolo rilascio e Retinolo Caricamento in corso <ol><li> Bloccare un nero 96 pozzetti Microfluor-2 piastra (Thermo Scientific) con 200 pl di Blocker Casein (Pierce) notte a 4 ° C per prevenire il bloccaggio aspecifica di holo-RBP alla plastica. Blocker caseina dà l&#39;effetto migliore blocco dei tutte le soluzioni di blocco che abbiamo testato. </li><li> Membrane preparate da cellule esprimenti STRA6 o cellule di controllo sono lavate con PBS e attraverso una siringa Hamilton (GastiGHT # 1710) 6 volte per produrre una sospensione uniforme in PBS. Usiamo tipicamente membrane derivati ​​da 1/100 a 1/20 di cellule cresciute su un piatto di 100 mm per reazione. </li><li> Lavare i pozzetti della Microfluor-2 piastra una volta con 200 microlitri di PBS. Raffreddare la piastra sul ghiaccio prima aggiunta di sospensione di membrana (50 microlitri per pozzetto). </li><li> Monitoraggio in tempo reale di retinolo fluorescenza viene misurata con l&#39;ottica di fluorescenza della Omega Polarstar (BMG Labtech) con il 320EX filtro di eccitazione e il filtro per le emissioni 460-10. Il programma è impostato sulla modalità di lettura Endpoint. La modalità piastra può anche essere usato per misurare il corso di tempo se gli intervalli temporali non sono variati. Il segnale proveniente da ciascun punto di tempo è la media di 10 misurazioni (media orbitale con un diametro di 2 mm) e il guadagno è impostato a 1.800. La piastra viene agitata per 10 secondi a 500 giri al minuto con doppia agitazione orbitale prima di ogni misurazione. </li><li> Per iniziare l&#39;analisi retinolo rilascio, i pozzetti vengono letti una sola volta con l&#39;endpoint di lettura mode prima olo-RBP (tipicamente 1 pM concentrazione finale) viene aggiunto a 0 min. Appena olo-RBP viene aggiunta, la reazione viene monitorata continuamente ogni 5-10 minuti per 1-3 ore. Per avviare il saggio retinolo carico, all-trans retinolo (tipicamente 1 pM concentrazione finale) viene aggiunto ai pozzetti in fioca luce rossa. La piastra viene letta una volta prima apo-RBP viene aggiunto a 0 min. Appena apo-RBP viene aggiunto, la reazione viene monitorata continuamente ogni 5-10 minuti per 1-3 ore. </li><li> Dopo che tutte le misurazioni vengono effettuate, scaricare i dati grezzi (ad esempio mostrato in Figura 2) dal software Omega Data Analysis (BMG Labtech) in Microsoft Excel per l&#39;analisi dei dati. Ciascun punto di tempo genera un file che contiene le letture di tutte le condizioni sperimentali. Ad esempio, se ci sono 20 punti di tempo, consolidare i 20 file in un unico file di Excel per l&#39;analisi dei dati. </li><li> Per l&#39;analisi dei dati, i segnali di fluorescenza prima dell&#39;aggiunta di retinolo o holo-RBP a 0 min sono considerati segnali di fondo und sottratti dai segnali finali fluorescenza a tutti i tempi. Sebbene i segnali di fondo sono bassi rispetto alla fluorescenza in retinolo olo-RBP, sottraendo il fondo elimina l&#39;influenza aspecifica di dispersione della luce dalle membrane e permette di concentrarsi sulla fluorescenza retinolo di holo-RBP o retinolo aggiunta a 0 min. </li></ol> 3. Monitoraggio in tempo reale di STRA6 catalizzata da trasporto di retinolo da Holo-RBP a CRBP-I <ol><li> Retinolo-EGFP è un nuovo trasferimento di risonanza di fluorescenza (FRET), coppia che è stata recentemente istituita 41. STRA6-catalizzata trasporto retinolo da olo-RBP per EGFP-CRBP-I è monitorata in tempo reale misurando retinolo-EGFP FRET. EGFP-CRBP-I proteina di fusione con 6XHis tag (EGFP-CRBP-I) viene prodotto in cellule di mammifero e viene purificata su resina Ni-NTA prima dell&#39;esperimento. EGFP-CRBP-I possono essere memorizzati in PBS con inibitori della proteasi per un breve periodo di tempo a 4 ° C. Alternativamente la proteina di fusione is congelati in -80 ° C in piccole aliquote. </li><li> Prima che le reazioni, preparare una bloccato Microfluor-2 piastra e membrane come descritto sopra. Lavare i pozzetti della piastra Microfluor-2 una volta con 200 microlitri di PBS prima dell&#39;aggiunta di sospensione di membrana (50 microlitri per pozzetto). </li><li> In tempo reale retinolo-EGFP FRET è misurata utilizzando Polarstar Omega con l&#39;eccitazione 320EX filtro e i filtri di emissione 460-10 e 510-10 con simultanei duello di emissione ottica di fluorescenza. Il programma è impostato sulla modalità di lettura Endpoint. La modalità piastra può anche essere usato per misurare il corso di tempo se gli intervalli temporali non sono variati. Il segnale proveniente da ciascun punto di tempo è la media di 10 misurazioni (media orbitale con un diametro di 2 mm) e il guadagno è impostato a 1800 per canale. La piastra viene agitata per 10 secondi a 500 giri al minuto con doppia agitazione orbitale prima di ogni misurazione. </li><li> Per avviare le reazioni, EGFP-CRBP-I (tipicamente 1 pM concentrazione finale) viene aggiunto ai pozzetti. La piastra viene letta sullace si utilizza la modalità di lettura Endpoint prima olo-RBP è aggiunto a 0 min. Appena olo-RBP viene aggiunta, la reazione viene monitorata continuamente dalla misurazione ogni 5-10 minuti per 1-2 ore. </li><li> Dopo tutte le misurazioni vengono effettuate, scaricare i dati grezzi (esempio mostrato in Figura 3) dal software Omega analisi dei dati per Microsoft Excel per l&#39;analisi dei dati come descritto sopra. </li><li> Retinolo-EGFP FRET è calcolata la variazione dinamica del rapporto delle accettore / donatore picchi di emissione 47. L&#39;equazione 41 per calcolare questo rapporto è [(510 t -510 b) / (460 t -460 b)], dove t 510, 510 b, t 460, e 460 b rappresentano le emissioni a 510 nm dopo l&#39;inizio della reazione ( t = tempo di punto), a 510 nm prima retinolo o olo-RBP viene aggiunto (b = sfondo), a 460 nm dopo l&#39;inizio della reazione (tempo t = punto), ed a 460 nm prima retinolo o olo-RBP viene aggiunto (b = sfondo), rispettivamente. </li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Condividiamo qui un protocollo ottimizzato di produzione RBP perché RBP procedure di produzione e di purificazione sono fondamentali per la generazione di RBP correttamente piegato. Data la possibilità di specie RBP misfolded e la presenza di tracce di proteine ​​batteriche anche in HPLC purificato batteri-RBP prodotte, è utile utilizzare RBP nativa da siero per confermare una conclusione relativa a RBP. RBP urina, che è disponibile in commercio, è una miscela complessa di molte specie di RBP tra apo-RBP e olo-RBP ...

La vitamina A è una molecola organica che è essenziale per la sopravvivenza umana e il corretto funzionamento di quasi tutti gli organi umani. Derivati ​​della vitamina A (retinoidi) partecipare a diversi eventi biochimici e cellulari tra cui il rilevamento della luce per 1,2 visione e la regolazione dell&#39;espressione genica e della traduzione di proteine ​​durante lo sviluppo embrionale e nei tessuti adulti 3-6. Sebbene retinolo ha la capacità di diffondere sistemica, evoluzione avvicinò con proteine ​​plasmatiche retinolo legante, una proteina carrier specifico per la vitamina A trasporto nel sangue per ottenere alta efficienza e specificità e per evitare la tossicità associata con diffusione casuale 7-10. Un recettore ad alta affinità che si lega alla RBP e riprende vitamina A è stato ipotizzato nel 1970 11-13. Nonostante le prove accumulate in tre decenni l&#39;esistenza del recettore RBP 14-31, l&#39;ipotesi del recettore è stata discussa per molti anni a causa della existence di una definizione errata di olo-RBP. La corretta definizione di holo-RBP è che è l&#39;alta affinità complesso 1:1 fra retinolo e RBP. Estrazione ripetuta di olo-RBP di solvente organico è necessario per la produzione di apo-RBP. Questa definizione è utilizzata da quasi tutti i laboratori che studiano RBP 7,9,32-35 o il recettore RBP 14-31,36-42. La definizione errata di olo-RBP, che è stato utilizzato per confutare l&#39;esistenza del recettore RBP è la miscela acuta di retinolo libero con apo-RBP. Poiché la funzione del recettore RBP di vitamina A assorbimento da olo-RBP è quello di rilasciare retinolo da olo-RBP, il recettore RBP avrebbe giocato alcun ruolo nella captazione retinolo se retinolo è libero di cominciare (come proposto dalla definizione errata di holo -RBP). La recente identificazione del recettore RBP come una proteina di dominio multitransmembrane chiamato STRA636 e la sua funzione di assorbimento di vitamina A da olo-RBP 36-43 sostiene con forza contro l&#39;ipotesi che RBP nonbisogno di un recettore per fornire vitamina A. dettagliate analisi ha rivelato che STRA6 ha 9 domini transmembrana con l&#39;N-terminale extracellulare e situati C-terminale situati intracellularmente 40. Situato tra transmembrana 6 e 7 è un dominio di legame essenziale RBP 39. STRA6 è accoppiato sia LRAT e CRBP-I di vitamina A assorbimento da olo-RBP, ma né LRAT né CRBP-I è assolutamente necessaria per una maggiore attività STRA6 41. STRA6 capacità di catalizzare rilascio retinolo da olo-RBP è la chiave per la sua attività di assorbimento di vitamina A 41. Facendo affidamento su STRA6 per rilasciare il suo retinolo, vitamina A consegna entro il RBP in grado di trasportare la vitamina A per colpire le cellule nei tessuti periferici, con elevata specificità ed efficienza. L&#39;importanza cruciale di olo-RBP definizione e la preparazione è dimostrata non solo dal dibattito storico sulla esistenza del recettore RBP, ma anche da tre documenti relativi recenti basate su olo-RBP definizioni difdifferenti dalla definizione originale e corretta 44-46. Il primo documento utilizzato l&#39;olo-RBP definizione che è stato utilizzato per disapprovare l&#39;esistenza del recettore RBP per studiare il recettore RBP 44. I documenti secondo e terzo avvicinò con una terza definizione di holo-RBP che ha reso ancora meno probabile per retinolo essere studiati per formare un complesso con adeguata RBP 45,46. Questi studi preparato tre H-retinol/RBP mescolando olo-RBP (nemmeno apo-RBP) con 3 H-retinolo. Poiché questo dosaggio non ha avuto 3 H-retinol/RBP formata e non rimuovere eventuale eccessivo 3 H-retinolo 45,46, non è un saggio per 3 H-retinolo assorbimento da 3 H-retinol/RBP, ma è un libero 3 H-retinolo diffusione dosaggio. E &#39;stato dimostrato in precedenza che STRA6 non aumenta l&#39;assorbimento cellulare di retinolo libero da LRAT 38 o CRBP-I 41. Praticamente tutti retinolo è associato RBP nel sangue e non vi è rilevabile free retinolo. Una delle principali funzioni del recettore RBP è catalizzare rilascio retinolo da olo-RBP durante l&#39;assorbimento retinolo da olo-RBP 41. Se il retinolo è artificialmente rilasciato o è in forma libera per cominciare 45,46, il recettore RBP non è necessaria. I risultati notevolmente diversi ottenuti dal test gratuito diffusione retinolo rispetto alle analisi basate su preparato correttamente olo-RBP dimostrano che una corretta preparazione di RBP è di fondamentale importanza per i suoi saggi funzionali. RBP può essere purificata da siero umano 41, ma il procedimento è complesso e la resa è bassa. Un approccio alternativo è quello di produrre RBP in E. coli. Perché E. coli non ha la capacità di piegamento corretto mammiferi proteine ​​secrete con più di una coppia di legami disolfuro come RBP, è essenziale RBP ripiegare e purificare la proteina correttamente ripiegata. Proteine ​​mal ripiegate non solo si comportano diversamente da correggere RBP piegato in vari metodi,ma anche causare aggregazione di proteine ​​durante la conservazione. Per la stessa ragione, apo-RBP viene prodotta solo da alta qualità olo-RBP. Descriviamo qui un protocollo ottimizzato per la produzione di RBP di alta qualità 100% loaded con retinolo attraverso l&#39;espressione batterica, ripiegamento, e la purificazione HPLC. Purificazione HPLC non solo rimuove RBP piegato in modo non corretto, ma anche significativa la contaminazione batterica che può causare artefatti gravi se RBP è utilizzato in saggi di trasduzione del segnale. Abbiamo anche descrivere due sensibili in tempo reale tecniche di monitoraggio per lo studio dei trasporti retinolo STRA6. Entrambe le tecniche dipendono RBP alta qualità. Per motivi di spazio, le tecniche classiche di vitamina radioattivo a base di retinoidi e HPLC-based A dosaggi di assorbimento non sono descritte qui.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> guanidina cloridrato </td><td> EMD </td><td> 5010 </td><td></td></tr><tr><td> cistina </td><td> Sigma </td><td> C8755 </td><td></td></tr><tr><td> cisteina </td><td> Sigma </td><td> C7352 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Pescatore </td><td> BP118-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Pescatore </td><td> 7786-1 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> EMD </td><td> 3860 </td><td></td></tr><tr><td> retinolo </td><td> Sigma </td><td> R7632 </td><td></td></tr><tr><td> carbenicillina </td><td> Pescatore </td><td> BP2648-5 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> EMD </td><td> 5810 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> EMD </td><td> 6508 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pescatore </td><td> BP358-10 </td><td></td></tr><tr><td> Ni-NTA </td><td> Qiagen </td><td> 1018244 </td><td></td></tr><tr><td> imidazolo </td><td> EMD </td><td> 5720 </td><td></td></tr><tr><td> eptano </td><td> EMD </td><td> HX0295-1 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker caseina </td><td> Perforare </td><td> 37528 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Ultra 15 concentratore (MWCO10 K) </td><td> Millipore </td><td> UFC901024 </td><td></td></tr><tr><td> Microfluor-2 Piastra </td><td> Pescatore </td><td> 14-245-177 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton siringa a tenuta di gas # 1710 </td><td> Pescatore </td><td> 14-824-655 </td><td></td></tr></tbody></table>

analisi in tempo reale di trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine ​​plasmatiche retinol binding

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

La vitamina A è essenziale per la visione e la crescita / differenziazione di quasi tutti gli organi umani. Plasma Retinol Binding Protein (RBP), è il principio e il supporto specifico di vitamina A nel sangue. Qui si descrive una tecnica ottimizzata per produrre e purificare olo-RBP e due in tempo reale tecniche di monitoraggio per studiare il trasporto di vitamina A per il recettore ad alta affinità RBP STRA6. La prima tecnica permette di produrre una grande quantità di alta qualità holo-RBP (100%-caricato con retinolo) per la vitamina A saggi trasporto. RBP di alta qualità è essenziale per saggi funzionali perché misfolded RBP comunicati vitamina A contaminazione batterica prontamente e in preparazione RBP può causare artefatti. In tempo reale, come le tecniche di monitoraggio elettrofisiologico hanno dato un contributo critico agli studi di trasporto di membrana. Il recettore-mediata RBP trasporto retinolo non è stato analizzato in tempo reale fino a poco tempo. La seconda tecnica qui descritta è la ragionel analisi in tempo STRA6-catalizzata rilascio retinolo o il carico. La terza tecnica è analisi in tempo reale di STRA6 catalizzata da trasporto retinolo da olo-RBP di proteina cellulare che si lega al retinolo (CRBP-I). Queste tecniche offrono l&#39;elevata sensibilità e risoluzione nel rivelare recettore della vitamina RBP di un meccanismo di assorbimento.

Presentiamo qui i risultati rappresentativi per olo-RBP produzione e purificazione mediante HPLC (Figura 1), analisi in tempo reale di STRA6 catalizzata rilascio retinolo da olo-RBP e carico retinolo in apo-RBP (Figura 2) e analisi in tempo reale di STRA6-catalizzata retinolo trasporto da olo-RBP per EGFP-CRBP-I (Figura 3). Senza ripiegamento, RBP prodotta in batteri è quasi completamente misfolded per la presenza di numerosi legami disolfur...

Qui si descrive una tecnica ottimizzata per la produzione di alta qualità di vitamina A / complesso RBP e due in tempo reale tecniche di monitoraggio per studiare una nave da trasporto vitamina da STRA6, il recettore RBP.

Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine ​​plasmatiche Retinol Binding

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

Questo protocollo mostra la produzione di proteine leganti il retinolo plasmatico di alta qualità che viene utilizzata per studiare le attività del recettore della proteina legante il retinolo in tempo reale. Ciò si ottiene esprimendo e purificando prima una grande quantità di proteina legante il retinolo dai batteri. La proteina legante il retinolo purificata viene completamente denaturata e lentamente ripiegata in presenza del suo ligando retinolo.Quindi la proteina legante il retinolo correttamente ripiegata viene purificata utilizzando l'HPLC per rimuovere le proteine ripiegate in modo errato e i contaminanti batterici. Una volta ottenuta la proteina legante il retinolo di alta qualità, può essere utilizzata per studiare le attività del suo recettore di membrana nel catalizzare il rilascio di retinolo, il caricamento del retinolo o il trasporto del retinolo alla proteina legante il retinolo cellulare. In tempo reale.Oggi dimostrerò il nostro protocollo migliorato per riformare e purificare i batteri che producono proteine leganti la retina. Questa tecnica è in grado di produrre proteine leganti la retina di alta qualità, essenziali per i saggi funzionali. Dimostrerò le tecniche di recente sviluppo per studiare il recettore per la proteina legante la retina.Il vantaggio principale di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti come le tecniche basate sulla radioattività o sull'HPRC è che consentono di monitorare l'andamento di più reazioni in tempo reale. La parte più difficile di questa procedura è la ritenuta alla fonte RVP, che può determinare sia la qualità che la resa di RVP. Se la proteina non viene prodotta correttamente, il preparato RVP risultante non può essere utilizzato per gli acidi funzionali.Qui introduciamo alcuni miglioramenti che abbiamo sviluppato nel corso degli anni e che garantiranno il successo. Inizia questo protocollo con i corpi di inclusione insolubili da una coltura di 40 millilitri di BL 21 e coli in cui la proteina RBP umana con un tag sei x his aggiunge 10 millilitri di 7,5 molari di guine cloridrato ai corpi di inclusione e sonica. Quindi aggiungere cinque millilitri di triss a 25 millimolari a pH nove e 75 microlitri di DTT a 10 millimolari e ruotare durante la notte.Il giorno successivo centrifugare a 18 g per 20 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere le proteine insolubili. Dopo la centrifuga, trasferire il surnatante in un nuovo tubo e posizionare il tubo sul ghiaccio. Quindi preparare il tampone di ripiegamento su ghiaccio come descritto nel testo allegato.Quindi, spegni le luci della stanza in modo che lavorino sotto una luce rossa fioca mentre mescoli energicamente la soluzione proteica in un becher sul ghiaccio. In alternativa, aggiungere 10 microlitri di soluzione di retinolo per ogni millilitro di tampone di ripiegamento per un totale di 600 microlitri di soluzione di retinolo e 60 millilitri di tampone di ripiegamento. Continuate quindi a mescolare per cinque ore al buio dopo un'altra centrifugazione.Concentrare il surnatante a circa 10 millilitri utilizzando Anacon Ultra 15. Dopo la concentrazione, diluire il campione a 100 millilitri. Utilizzando il PBS freddo.A questo punto è importante rimuovere qualsiasi precipitato. Quindi purificare l'RBP ripiegato su resina NTA di nichel eluire in ole da 100 millimolari in PBS. Concentrare l'EIT utilizzando un concentratore con un cutoff di peso molecolare di 10 kilodalton al volume da un quinto a un decimo del volume originale.Quindi diluire da cinque a 10 volte con tris più cloruro di sodio e ripetere la fase di concentrazione dopo aver concentrato la proteina. Trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millimetri immediatamente prima dell'esecuzione HPLC per pulire la centrifuga dei campioni a 16.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Successivamente, purificare l'RBP cavo su HPLC utilizzando una colonna a scambio ionico con un gradiente di gradini di cloruro di sodio di 220 millimolari per 12 minuti.360 millimolari per 15 minuti e 1000 millimolari per 15 minuti. Utilizzando 25 millimolari triss pH 8.0 come fase mobile a un millilitro al minuto. All'aumentare della concentrazione di cloruro di sodio, viene rilasciato un sibilo cavo RBP.Mentre APO RBP e RBP mal piegato rimangono legati alla colonna. Se il ripiegamento RBP non viene eseguito in modo ottimale, l'RBP mal piegato può dominare l'intera preparazione. Monitorare attentamente il profilo di eluizione del sibilo RBP correttamente piegato e mal ripiegato a 1000 millimolari di cloruro di sodio.La maggior parte del sibilo mal piegato RBP dovrebbe essere rilasciato. Recuperare l'RBP cavo correttamente piegato dalle frazioni di picco a 360 millimolari di cloruro di sodio. Dopo l'HPLC, le frazioni contenenti RBP vengono raggruppate in una provetta conica da 15 millilitri su ghiaccio.Quindi utilizzare il concentratore di cutoff del peso molecolare da 10 kilodalton per concentrarsi dopo che il volume è stato ridotto da cinque a 10 volte. Aggiungere PBS per diluire il campione e concentrarsi nuovamente il giorno successivo. Utilizzare uno spettrofotometro per determinare la resa e la qualità finali come mostrato qui.Il prodotto piegato correttamente dovrebbe avere un rapporto da 330 nanometri a 280 nanometri. Vicino a una proteina ripiegata in modo errato avrà un rapporto inferiore a uno per produrre A-O-R-B-P. Aggiungere un volume uguale di eptano all'RBP cavo purificato e mescolare delicatamente ruotando per una notte a quattro gradi Celsius centrifugare a 16.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifuga, la fase organica superiore e la fase acquosa inferiore sono separate da uno strato bianco. Lo strato bianco è denaturato APO RBP. Per recuperare la fase acquosa, portare la punta di un ago da siringa da 500 microlitri sul fondo del tubo e aspirare accuratamente la soluzione.Evitare il materiale bianco nell'interfaccia e trasferire la soluzione in una nuova provetta. Aggiungere nuovamente l'eptano e ripetere il processo di estrazione tre volte con una rotazione di tre ore a quattro gradi Celsius per ciascuna dopo l'ultima estrazione, controllare l'assorbimento su uno spettrofotometro NanoDrop per assicurarsi che il picco di 330 nanometri sia diminuito al livello di fondo. STR RRA sei catalizzato.Il rilascio di retinolo e il carico di retinolo possono essere monitorati in tempo reale monitorando la fluorescenza del retinolo quando il retinolo è legato, c'è un aumento della fluorescenza a 460 nanometri quando il retinolo viene rilasciato. C'è una diminuzione della fluorescenza per eseguire Questo test inizia aggiungendo 200 microlitri di caseina bloccante a ciascun pozzetto di un micro Fluor nero a 96 pozzetti, incubare su due piastre durante la notte a quattro gradi Celsius per evitare l'adesione non specifica di RBP cavo alla plastica. Il giorno successivo, lavare una volta i pozzetti rivestiti della microflora a due piastre con 200 microlitri di PBS.Quindi, dopo aver aspirato il PBS, raffreddare la piastra con ghiaccio. Aggiungere 100 microlitri di PBS alle membrane appena preparate da una a 5 milioni di cellule che esprimono T RRA sei o cellule di controllo e far passare le membrane attraverso una siringa di Hamilton di tipo gas numero 1710 sei volte per produrre una sospensione uniforme. Quindi, diluire la sospensione della membrana a un millilitro usando PBS.Aggiungere 50 microlitri della sospensione a membrana in ogni pozzetto e quindi riposizionare la piastra sul ghiaccio. Qui. Il monitoraggio in tempo reale della fluorescenza del retinolo viene misurato utilizzando l'ottica a fluorescenza della stella polare omega. Impostare lo strumento come descritto nel testo di accompagnamento con un filtro di eccitazione da 320 e il filtro di emissione da 460 trattino 10.Utilizzando questo strumento, eseguire un test di rilascio del retinolo in cui, dopo una lettura in background, viene aggiunto un RBP cavo e le letture vengono effettuate ogni 10 minuti per una o tre ore. Quindi eseguire un test di caricamento del retinolo in cui tutto il retinolo trans viene aggiunto alla piastra. In condizioni di luce rossa fioca, la targa viene letta una volta e poi viene aggiunto A-O-R-B-P.La reazione viene quindi monitorata continuamente ogni 5-10 minuti per una o tre ore dopo che tutte le misurazioni sono state effettuate. I dati grezzi verranno visualizzati nel software di analisi dei dati Omega. Trasferisci i dati grezzi in Microsoft Excel.Per l'analisi dei dati, il retinolo EGFP è una risonanza di fluorescenza, trasferimento o coppia di tasti, in cui il retinolo funge da donatore e l'EGFP funge da accettore. S stra sei ha catalizzato il trasporto del retinolo da R BP cavo a EEG FP crbp uno viene monitorato in tempo reale misurando il retinolo EEG FP fret prima di eseguire il monitoraggio in tempo reale di EEG FP crbp una proteina di fusione con sei x hiss tag E GFP crbp uno è prodotto in cellule di mammifero purificato su resina di nichel NTA e conservato in PBS con inibitori della proteasi per un breve periodo a quattro gradi Celsius o a temperatura negativa 80 gradi Celsius per periodi più lunghi. Preparare una microflora bloccata, due piastre e membrane come descritto nella sezione precedente di questo video e aggiungere 50 microlitri di sospensione di membrana.Come prima. In questo saggio, impostare la stella polare omega con le stesse impostazioni di prima con un filtro di emissione aggiuntivo da 510 a 10 e un'ottica a fluorescenza a doppia emissione simultanea. EG FP crbp una concentrazione finale micromolare a ciascun pozzetto viene aggiunta per avviare la reazione e viene effettuata una lettura di fondo.Quindi viene aggiunto un millimolare di RBP cavo e le misurazioni vengono effettuate ogni 5-10 minuti per una o due ore dopo che tutte le misurazioni sono state effettuate. Scarica i dati grezzi come prima. Il fret EGFP del retinolo è calcolato dalla variazione dinamica del rapporto tra i picchi di emissione dell'accettore e del donatore.L'equazione per calcolare questo rapporto è mostrata qui, dove 510 T, 510 B, 460 T e 460 B rappresentano emissioni a 510 nanometri dopo l'inizio della reazione a 510 nanometri prima che un retinolo o un RBP cavo venga aggiunto a 460 nanometri dopo l'inizio della reazione, aggiunto 460 nanometri prima che vengano aggiunti rispettivamente il retinolo o l'RBP cavo. Per studiare le attività catalitiche del recettore RBP STRA six, viene prodotto e purificato RBP di alta qualità e quindi utilizzato per monitorare le reazioni catalizzate di stra six in tempo reale. Questa figura mostra un drammatico aumento dipendente dal tempo della fluorescenza del retinolo nelle reazioni contenenti TA sei retinolo e A-O-R-B-P.C'è un piccolo aumento della fluorescenza del retinolo nelle reazioni senza TA sei. Questo esperimento dimostra il caricamento del retinolo catalizzato da stra sei in APO R bp quando è stato valutato il trasporto di retinolo catalizzato da R BP cavo a EEG FP crbp uno. C'è stato un aumento dipendente dal tempo del retinolo EEG FP fret nelle reazioni contenenti TA sei.Ciò suggerisce che lo stra sei accelera notevolmente il trasporto del retinolo dal cavo R BP all'EEG FP crbp uno. Quando si utilizza l'IBP prodotta dai batteri, è importante ricordare che l'IVP di alta qualità è essenziale per l'IBP coinvolta nell'acido funzionale ed è importante confermare il risultato ottenuto dall'RBP batterico utilizzando RVP nativo dal siero. Una volta che la RVP di alta qualità è disponibile, può essere utilizzata per studiare la funzione del recettore RBP in tempo reale utilizzando la tecnica che ho appena descritto.Queste tecniche sono complementari ai classici saggi basati sull'attività o sull'HPRC.

real-time-analyses-retinol-transport-membrane-receptor-plasma-retinol

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Lo scopo di questo studio era di convalidare la riproducibilità di un modello in vitro BBB coinvolge un singenici ratto co-coltura delle cellule endoteliali e astrociti. Il monostrato di cellule endoteliali presentato TEER alta e bassa permeabilità LY. Espressione di proteine ​​TJ specifici, sono state valutate le risposte funzionali ai infiammazione e la funzionalità dei trasportatori e recettori.

Istituzione di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello di Rat barriera emato-encefalica (BBB): A Focus on BBB impermeabilità e Trasporti recettore-mediata

Lo stato metabolico delle cellule epiteliali pigmentate retiniche umane (H-RPE) riflette la loro salute e funzione. Qui viene presentato un protocollo ottimizzato per esaminare il flusso metabolico in tempo reale di H-RPE utilizzando respirometria ad alta risoluzione.

Analisi in tempo reale della bioenergetica in cellule epiteliali pigmentate primarie della retina umana mediante respirometria ad alta risoluzione

Qui, viene descritto un metodo di cromatografia liquida in fase normale ad alte prestazioni per rilevare e quantificare i retinoidi critici coinvolti nella facilitazione della funzione visiva sia nel tessuto oculare che in quello sistemico, nel contesto dell'apporto sistemico di vitamina A per generare il cromoforo fotosensibile essenziale della rodopsina 11-cis-retinale.

Analisi quantitativa dei metaboliti alimentari della vitamina A nei tessuti oculari e non oculari murini mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni

Qui, descriviamo due metodi quantitativi per studiare le interazioni proteina-ligando dei recettori di membrana della vitamina A e dell'opsina del fotorecettore con i rispettivi ligandi fisiologici.

Metodologia per lo studio delle interazioni dei recettori di membrana della vitamina A e della proteina opsina con i loro ligandi nella generazione della proteina retinilidene

Endocitosi regolata regola i livelli di superficie cellulare espressione della maggior parte delle proteine ​​di membrana. Qui utilizziamo riducibili, reagenti biotinilazione impermeant membrana per misurare la velocità endocitico del trasportatore della dopamina (DAT), una proteina di membrana politopica. Il metodo favorisce un approccio diretto per misurare il tasso endocitico della maggior parte delle proteine ​​di membrana plasmatica.

Misurazione delle proteine ​​plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

Questo protocollo descrive una tecnica rapida per quantificare la traslocazione di GLUT4 dal citoplasma alla membrana plasmatica delle cellule mediante citometria di flusso.

Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • Complessi proteina Hsp90 e la riattivazione del Ligand Binding

Multiple-bersaglio tracciatura è un algoritmo casalingo sviluppato per il monitoraggio singolarmente molecole marcate nella membrana plasmatica di cellule viventi. In modo efficiente la rilevazione, la stima e la rintracciabilità nel tempo molecole ad alta densità fornire una user-friendly, strumento completo per studiare la dinamica della membrana su scala nanometrica.

Mappatura diffusione molecolare nella membrana plasmatica da parte di più-Target Tracing (MTT)

Dimostriamo FRET tra polydiacetylene polimero coniugato (PDA) e fluoroforo attaccato alla superficie dei liposomi mobile per il rilevamento di biomolecole. Liposomi PDA conteneva anche molecole recettoriali sulle loro superfici di biomolecole da utilizzare come sonde. Interazioni ligando-recettore portare a cambiamenti nella FRET efficienza tra il fluoroforo e PDA che è alla base del meccanismo di rilevamento.

Monitoraggio in tempo reale delle interazioni ligando-recettore mediante Bonifico Fluorescence Resonance Energy

Thermophoresis microscala (MST) può essere ampiamente usato per la determinazione di affinità di legame senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il protocollo prevede sovraespressione della proteina GFP-fusa, lisi cellulare in condizioni non denaturanti, e la rilevazione di segnale MST in presenza di concentrazioni variabili di ligando.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Scopri come produrre proteina RBP di alta qualità per studiare in tempo reale il trasporto di retinolo mediato dal recettore STRA6. Questo metodo ottimizza espressione, ripiegamento e purificazione per analisi funzionali accurate.

Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine ​​plasmatiche Retinol Binding

Esplora altri video

Analisi in tempo reale di Trasporti retinolo da parte del recettore di membrana di proteine plasmatiche Retinol Binding