Name: Generazione di linee cellulari umane stabili con tetraciclina-inducibile (Tet-on) shRNA o espressione di cDNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Impara a generare linee cellulari umane stabili con espressione inducibile di shRNA o cDNA tramite sistema Tet-on. Questo metodo permette il controllo reversibile dell'espressione genica per studi di biologia cellulare.

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Ringraziamo tutti i membri del nostro laboratorio per le discussioni utili. Ringraziamo Joanna Lisztwan e Christina Gewinner per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione BBSRC BB/I021248/1 e il Wellcome Trust concessione 090090/Z/09/ZAH è un Wellcome Trust Research fellow presso il Career Development UCL Cancer Institute.

1. Clonazione di pcDNA6_TetR_IRES_blast <ol><li> Come illustrato in figura 3, eseguire un digest parziale del pcDNA6/TR plasmide (V1025-20, Invitrogen) con gli enzimi di restrizione Xba I e Nco I per rimuovere il gene tetR e il promotore della resistenza blasticidina (BlastR) gene. Isolare il vettore frammento di 4,6 kb. </li><li> Per rimuovere la sequenza di poliadenilazione del gene tetR, introdurre mediante PCR un sito Xho I subito dopo il codone di stop del cDNA tetR conservando il sito Xba I alla estremità 5 &#39;del cDNA. Subclonare il frammento risultante in pMigR1 17 usando enzimi di restrizione Xba I e Xho I per generare il plasmide pMigR1_TetR. </li><li> Digerire il vettore pMigR1_TetR con gli enzimi di restrizione Xba I e Nco I per liberare il frammento TetR_IRES. Isolare l&#39;inserto 1,25 kb frammento. </li><li> Legare il 4,6 kb pcDNA6/TR e le 1,25 kb frammenti TetR_IRES. Transform il prodotto legatura in competente E.coli e identificare il costrutto pcDNA6_TetR_IRES_blast desiderato utilizzando le normali tecniche di biologia molecolare. </li></ol> 2. Generazione di linee cellulari che esprimono stabilmente tetR <ol><li> Il giorno 1, Seed 1x10 6 celle per 10 cm di piastra di coltura con il supporto di standard di crescita (ad es DMEM supplementato con 10% FCS). Seed due piastre, una per trasfezione con pcDNA6_TetR_IRES_blast, e l&#39;altro come controllo negativo per la selezione blasticidina. Assicurarsi di utilizzare il passaggio più basso possibile e il mezzo di crescita consigliato. </li><li> Il giorno 2, transfect una piastra con 2 mg di pcDNA6_TetR_IRES_blast utilizzando Fugene 6 (E2691, Promega) seguendo le istruzioni del produttore. Non transfettare la seconda piastra. </li><li> Il giorno 3, aggiungere mezzo standard di crescita contenente 5 mg / ml blasticidina ad entrambe le lastre. Si prega di notare che la concentrazione scelta ottimale può variare per una linea cellulare, e di conseguenza potrebbe need da determinare in anticipo. </li><li> Il giorno 4, dividere le celle a 1/5, 1/25, 1/50 e 1/100 con 10 cm di piatti e terreno di coltura standard contenente 5 mg / ml blasticidina. Assicurarsi di etichettare correttamente piastre contenenti cellule non trasfettate o trasfettate. Preparare due piastre per fase di diluizione. </li><li> Controllare le cellule ogni giorno, in modo che tutte le celle sulle piastre non trasfettate sono morti entro la prima settimana. Modificare i media di selezione ogni 2-3 giorni. </li><li> Dopo 1-2 settimane, blasticidina resistenti colonie dovrebbe iniziare a comparire. Selezionare piastre contenenti 5-50 colonie per assicurare che singole colonie possono essere raccolti. </li><li> Quando le colonie hanno raggiunto un diametro di circa 5 mm (o maggiore), isolare almeno 12 cloni indipendenti utilizzando cilindri di clonazione per raccogliere singole colonie. Trasferire ciascun clone in un pozzo separato di una piastra a 24 pozzetti di coltura. Quando confluenti, dividere le cellule di ogni pozzetto in un singolo pozzetto di una piastra da 6 pozzetti di coltura. </li><li> Continuare a cl culturaquelli in mezzi di selezione. Quando confluenti, le cellule di ogni pozzetto divise in due singoli pozzetti di una piastra da 6 pozzetti di coltura. </li><li> Per ogni clone da testare, congelare un pozzetto di cellule confluenti e cellule raccolto nel pozzetto altro per le prove successive mediante immunoblotting. </li><li> Rileva tetR mediante Western blotting utilizzando l&#39;anticorpo monoclonale murino anti-TET02 anticorpo (Mobitec GmbH). Di includere un lisato della linea cellulare parentale come controllo negativo. </li><li> Selezionare 3 cloni con l&#39;espressione più alta tetR ed espandere ogni cultura clonale. Congelare le scorte di ciascun clone promettente appena possibile. Infine, esaminare i parametri molecolari e cellulari biologici di interesse confrontando le linee cellulari parentali con i tetR-cloni che esprimono. Selezionare il &#39;migliore&#39; clone con l&#39;espressione più alta tetR che non visualizza alcuna modifica nei parametri molecolari e biologiche delle cellule di interesse. </li></ol> 3. Test pilota di pter e pT-Rex DEST30 vettori EsprimiING shRNA o cDNA, rispettivamente, <ol><li> Generare pter plasmide con inserti shRNA come descritto 12. Costruire pT-Rex DEST30 vettore (12.301-016, Invitrogen) contenente il cDNA di interesse utilizzando la tecnologia Gateway (Invitrogen). In caso di espressione di cDNA, l&#39;aggiunta di un tag al cDNA sarà poi facilitare l&#39;individuazione di esogenamente proteina espressa. </li><li> Transitoriamente transfettare la linea cellulare parentale bersaglio con pter o pT-Rex DEST30 plasmidi (che ha espresso shRNAs o cDNA di interesse) con il reagente di trasfezione di scelta. Per il test di shRNA plasmidi di espressione, garantire elevate efficienze di trasfezione possono essere raggiunti. </li><li> Harvest cellule trasfettate e procedimenti per immunoblotting usando gli anticorpi appropriati, in attesa di rilevare un esaurimento o sovraespressione del gene di interesse. </li></ol> 4. Generazione di linee cellulari stabili con tetraciclina-inducibile (Tet-on) Espressione di shRNAs o cDNA utilizzando pter o pT-Rex DEST30 vettori </p&gt; <ol><li> Il giorno 1, seme 1x10 6 celle del &#39;migliore&#39; tetR esprimono clone per 10 cm di lastra, con il supporto di standard di crescita integrato con certificato Tetracycline senza siero (ad esempio da FBS Invitrogen, 16000-014). Seme una piastra per la trasfezione con pter (o pT-Rex DEST30), e una piastra come controllo negativo per doppia selezione. Assicurarsi di utilizzare il più basso possibile passaggio. </li><li> Il giorno 2, transfect una piastra con 2 pg di pter (o pT-Rex DEST30) utilizzando Fugene 6. Non transfettare la seconda piastra. </li><li> Il giorno 3, aggiungere mezzo standard di crescita contenente 5 mg / ml blasticidina e 500 mcg / ml zeocin (o 1 mg / ml G418). </li><li> Il giorno 4, dividere le celle a 1/5, 1/25, 1/50 e 1/100 utilizzando piastre da 10 cm e terreno di coltura standard contenente 5 mg / ml di blasticidina e 500 pg / ml zeocin (o 1 mg / ml G418). Preparare due piastre per fase di diluizione. </li><li> Controllare le celle di tutti i giorni, facendo in modo che entro la prima settimana tutte le cellule sulle piastre non trasfettate sono morti.Cambia il mezzo standard di crescita contenente blasticidina e zeocin (o G418) ogni 3-4 giorni. </li><li> Dopo 2-3 settimane, blasticidina / zeocin (o blasticidin/G418) double-resistenti colonie dovrebbe iniziare a comparire. Selezionare piastre contenenti 5-50 colonie di scegliere singole colonie. </li><li> Quando le colonie hanno raggiunto un diametro di circa 5 mm (o maggiore), utilizzare cilindri di clonazione per raccogliere singole colonie. Isolare almeno 24 cloni individuali. Trasferire ciascun clone in un pozzo separato di una piastra a 24 pozzetti di coltura. </li><li> Cloni cultura in concentrazioni medie di manutenzione contenenti blasticidina (5 mg / ml) e zeocin (250 mcg / ml) [o G418 (0,5 mg / ml)]. Quando confluenti, dividere le cellule di ogni pozzetto in un singolo pozzetto di una piastra da 6 pozzetti di coltura. </li><li> Per ogni clone da testare, dividere un confluente pozzetto di una piastra da 6 pozzetti in tre singoli pozzetti di una piastra da 6 pozzetti. Quando confluenti, congelare le cellule da un pozzetto. Usare gli altri due pozzi per la verifica della tetraciclinae-inducibile espressione. Aggiungere tetraciclina alla concentrazione di 1 ug / ml ad un pozzetto, lasciando la tetraciclina secondo pozzo libero. </li><li> Dopo 24-96 ore di incubazione con le tetracicline, le cellule raccolto e di processo per immunoblotting utilizzando anticorpi appropriati. Brevi tempi di incubazione tetracicline sono raccomandati quando screening per l&#39;induzione di espressione di cDNA, mentre più trattamenti tetraciclina sarà necessario determinare shRNA-mediata deplezione di proteine ​​endogene. </li><li> Selezionare almeno due cloni con l&#39;esaurimento desiderato / sovraespressione ed espandere ogni cultura. Congelare le scorte di ciascun clone promettente appena possibile. Quando cresce Tet-on cloni per gli esperimenti sempre assicurarsi di utilizzare supporti integrati con Tetracycline senza siero e gli antibiotici di selezione relativi a concentrazioni di manutenzione. </li></ol>

<ol><li>Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+repressor+gene+of+the+TN10+tetracycline+resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant.</a> Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).</li>
<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).</li>
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<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li>
<li>McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+using+micro-RNA+designed+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Gene silencing using micro-RNA designed hairpins.</a> RNA. 8, 842-850 (2002).</li>
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<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+using+a+stably+integrated%2C+inducible+small-interfering-RNA+vector%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector.</a> EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).</li>
<li>Hergovich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MST1+and+hMOB1+tumor+suppressors+control+human+centrosome+duplication+by+regulating+NDR+kinase+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation.</a> Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).</li>
<li>Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome-associated+NDR+kinase+regulates+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication.</a> Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).</li>
<li>Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NDR%2FLATS+interactions+with+the+human+MOB+family+reveal+a+negative+role+for+human+MOB2+in+the+regulation+of+human+NDR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases.</a> Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).</li>
<li>Vichalkovski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDR+kinase+is+activated+by+RASSF1A%2FMST1+in+response+to+Fas+receptor+stimulation+and+promotes+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis.</a> Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).</li>
<li>Pear, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Crediamo che Tet-sui sistemi facilitare notevolmente l&#39;analisi della funzione genica, in particolare in sistemi cellulari che sono difficili da manipolare e / o quando il gene manipolato è essenziale per la sopravvivenza cellulare. Inoltre, la capacità di controllare l&#39;espressione genica altamente specifici Tet-sui sistemi offre l&#39;opportunità di studiare funzioni geniche in diverse fasi (per esempio durante la progressione del ciclo cellulare o ben definiti processi di differenziazione). Il metodo qui presen...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Siero bovino fetale (FBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Testato Tet-free </td></tr><tr><td> Blasticidina </td><td> Invivogen </td><td> ant-bl-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invivogen </td><td> ant-Zn-5 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> PAA laboratori </td><td> P31-011 </td><td> 100 mg / ml in media </td></tr><tr><td> anti-TET02 </td><td> Mobitec GmbH </td><td> TET02 </td><td> Utilizzare a 1/1000 a 1/2000 per WB </td></tr><tr><td> pcDNA6/TR </td><td> Invitrogen </td><td> V1025-20 </td><td></td></tr><tr><td> pT-Rex DEST30 </td><td> Invitrogen </td><td> 12301-016 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Tetracycline </td><td> Sigma </td><td> 87128 </td><td> 2 mg / ml in etanolo </td></tr><tr><td> Doxycycline </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td> 2 mg / ml in acqua </td></tr><tr><td> Clonazione di cilindri </td><td> Bellco Glass Inc. </td><td> 2090-00808 </td><td> riutilizzabile </td></tr></tbody></table>

generazione di linee cellulari umane stabili con tetraciclina-inducibile (tet-on) shrna o espressione di cdna

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

Un approccio importante nel campo della biologia cellulare di mammifero è la manipolazione dell&#39;espressione dei geni di interesse in linee cellulari selezionate, con lo scopo di rivelare una o più funzione del gene (s) con sovraespressione transiente / stabile o knockdown del gene di interesse. Purtroppo, per le indagini cellulari diversi biologici questo approccio non è adatto quando le manipolazioni del risultato dell&#39;espressione genica in cellule di crescita / proliferazione difetti o differenziazione cellulare indesiderata. Pertanto, i ricercatori hanno adattato la proteina repressore tetraciclina (tetR), tratto dal E. coli resistenza alla tetraciclina operone 1, per generare sistemi di regolazione molto efficienti e stretto per esprimere cDNA in cellule di mammifero 2,3. In breve, tetR è stato modificato a uno (1) blocco di inizio trascrizione legandosi al Tet-operatore (TO) nel promotore per aggiunta di tetraciclina (Tet-off definito sistema) o (2) si legano al TO in tegli assenza di tetraciclina (Tet-definito sul sistema) (Figura 1). Data l&#39;inconveniente che il Tet-off sistema richiede la presenza continua di tetraciclina (che ha una emivita di circa 24 ore in terreno di coltura cellulare tissutale) il Tet-il sistema è stato più ampiamente ottimizzata, con conseguente sviluppo di molto stretto ed efficienti sistemi vettore di espressione di cDNA come usato qui. Poco dopo la creazione di RNA interference (RNAi) per atterramento gene in cellule di mammifero 4, vettori che esprimono breve hairpin RNA (shRNA) sono stati descritti che funzione molto simile a siRNA 5-11. Tuttavia, questi approcci shRNA-mediati atterramento presenta la stessa limitazione come strategie knockout convenzionali, in quanto l&#39;esaurimento stabile non è fattibile se gli obiettivi di geni sono essenziali per la sopravvivenza cellulare. Per superare questa limitazione, van de Wetering et al 12. Modificato l&#39;espressione shRNA vettore pSUPER 5 </su&gt; p inserendo un TO nella regione del promotore, che ha permesso loro di generare linee cellulari stabili con tetraciclina inducibile deplezione dei loro geni bersaglio di interesse. Qui, si descrive un metodo per generare efficientemente umana stabile Tet-on linee cellulari che guidano affidabile iperespressione inducibile o deplezione del gene di interesse. Utilizzando questo metodo, siamo riusciti generato Tet-on linee cellulari che hanno notevolmente facilitato l&#39;analisi del MST / hMOB / NDR cascata in centrosoma 13,14 e apoptosi segnalazione 15,16. In questo rapporto, descriviamo i nostri vettori di scelta, oltre a descrivere i due passaggi consecutivi di manipolazione che sono necessari per generare efficientemente umana Tet-on linee cellulari (Figura 2). Inoltre, oltre a delineare un protocollo per la generazione di umana Tet-on linee cellulari, discuteremo aspetti critici riguardanti le procedure tecniche e la caratterizzazione di cellule Tet-on.

Un esempio per la caratterizzazione di RPE-1 linee cellulari che esprimono stabilmente tetR è mostrato in Figura 4. Si noti che tutti i cloni RPE-1 esprimono diversi livelli di tetR (confronta corsie 2 e 5), mentre la linea cellulare parentale (che serve come controllo negativo) non esprime la proteina esogena tetR (Figura 4, corsia 1). Questa variazione nell&#39;espressione tetR tra RPE-1 Tet-on cloni cellulari è previsto, poiché l&#39;espressione del tetR esprimere plasmidi è altament...

Un modo rapido e semplice per generare linee cellulari umane di inducibile e reversibile sovraespressione cDNA o shRNA-mediata knock-down del gene di interesse. Questo metodo consente ai ricercatori di linee cellulari altamente affidabile e riproducibile manipolare che sono difficili da modificare con metodi di trasfezione transiente o convenzionali atterramento / knockout strategie.

Generazione di linee cellulari umane stabili con tetraciclina-inducibile (Tet-on) shRNA o espressione di cDNA

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare linee cellulari umane stabili con espressione inducibile da tetraciclina di S-H-R-N-A o di CDNA. Innanzitutto, trasfettare le cellule bersaglio con il plasmide di espressione tatar e selezionare la resistenza al blaster side. Successivamente, isolare singole colonie e verificare la presenza di cellule che esprimono stabilmente la proteina represse del sistema Tet.Successivamente, trasfettare il clone con la migliore espressione di teta con plasmidi progettati per modulare l'espressione del gene bersaglio sotto il controllo dell'elemento di risposta Tet. Sottoporre quindi le cellule trasfettate a selezione doppia, isolare singole colonie e selezionare i cloni Teton desiderati mediante western blotting. Infine, i cloni Teton ottenuti possono essere utilizzati per esaminare l'impatto di specifici bersagli su determinati parametri biologici.La procedura sarà dimostrata da un postdoc in laboratorio. Marty Gomez Martinez generi un vettore che promuova l'espressione del Repressore Tet e del gene di resistenza Blain dallo stesso promotore CMV in due piastre da coltura tessutale da 10 centimetri seminando contemporaneamente sei cellule in mezzo di crescita standard, una piastra per la trasfezione con un plasmide di espressione Tatar e l'altra come controllo negativo per la selezione Blain. Il giorno successivo trasfetta una piastra con due microgrammi di plasmide di espressione TTA utilizzando FU gene six.Seguire le istruzioni del produttore, quindi incubare la coltura tutta la notte accanto a entrambe le piastre. Dopo 24 ore, aggiungere il mezzo di crescita standard contenente la concentrazione ottimale di blastina per la linea cellulare sperimentale in uso, raccogliere le cellule e quindi etichettare le piastre da 10 centimetri per la diluizione seriale ed eseguire la semina di duplicati per diluizione seriale utilizzando il mezzo di crescita standard contenente cinque microgrammi per millilitro di blaster side, assicurandosi di etichettare correttamente le piastre contenenti le cellule non ricavate o quelle transfettate. Monitorare le cellule, osservando in particolare che tutte le cellule presenti sulle piastre non ricavate sono morte entro la prima settimana.Cambiare il mezzo di selezione ogni due o tre giorni dopo una o due settimane, quando compaiono le colonie resistenti al blaster soin. Selezionare le piastre che contengono da cinque a 50 colonie per garantire che sia possibile isolare colonie singole quando hanno raggiunto un diametro di circa cinque millimetri. Isolare almeno 12 ceppi indipendenti utilizzando cilindri di clonaggio per raccogliere colonie singole.Trasferire ciascuna linea cellulare in una singola pozzetta di una piastra a 24 pozzette e coltivare fino a confluenza. Raccogliere e trasferire le cellule da ciascuna colonia in pozzette separate di una piastra per colture cellulari a 6 pozzette. Continuare a coltivare le linee cellulari in mezzo selettivo quando le colture raggiungono la confluenza.Dividere le cellule da ogni pozzetto in due pozzetti singoli di una piastra per colture cellulari a sei pozzetti. Per ciascuna linea da testare, congelare un pozzetto di cellule confluenti. Raccogliere le cellule dal secondo pozzetto per la valutazione dell'espressione della proteina tatar.Eseguire un western blot sui cloni utilizzando un lisato della linea cellulare parentale come controllo negativo per rilevare la proteina tatar. Utilizzare l'anticorpo monoclonale murino anti Tet zero due. Procedere all'espansione dei tre cloni con la più alta espressione di testar.Conservare gratuitamente le linee cellulari di ciascuna clone promettente appena possibile. Ora le cellule clonali sono pronte per l'analisi dei parametri molecolari e cellulari di interesse. Confrontando le linee cellulari parentali con le clone esprimenti tatar, selezionare la migliore clone con l'espressione di tatar più elevata che non presenti alterazioni nei parametri molecolari e biologici cellulari di interesse.Generare plasmidi PTER con inserti HRNA di interesse. Costruire inoltre un vettore PT REX desk 30 contenente il cDNA di interesse utilizzando la tecnologia gateway. Trasfettare in modo transitorio la linea cellulare bersaglio parentale con plasmidi PTER o P T-Rex S 30.Utilizzando i reagenti di trasfezione scelti, quindi raccogliere le cellule trasfettate e valutare l'espressione del gene bersaglio mediante immunoassorbimento. Al primo giorno, seminare due piastre del miglior clone esprimente il tetrato utilizzando mezzo di crescita standard integrato con siero certificato privo di tetraciclina, coltivando in overnight.Il giorno successivo, trasfettare una sola piastra con due microgrammi di plasmide di espressione A-S-H-R-N-A o CDNA utilizzando FU gene six. Al terzo giorno, aggiungere mezzo di crescita standard contenente cinque microgrammi per millilitro di blastina e 500 microgrammi per millilitro di eosina, oppure blastina e G quattro 18. Quindi, al quarto giorno, suddividere le cellule per creare piastre duplicate di diluizioni, utilizzando mezzo di crescita standard per la doppia selezione.Controllare le cellule ogni giorno per verificare la risposta alla morte cellulare in seguito al trattamento con antibiotico e rinnovare il mezzo ogni tre o quattro giorni. Dopo due o tre settimane, quando iniziano ad apparire colonie resistenti al blaster in zein o al blaster in G four 18 doppio resistenti.Selezionare le piastre contenenti da cinque a 50 colonie per prelevare singole colonie e coltivarle fino a quando le colonie non avranno raggiunto un diametro di circa cinque millimetri o superiore. Con cilindri di clonaggio, prelevare e trasferire singole colonie in pozzetti separati di una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti. Coltivare i cloni in mezzo contenente concentrazioni di mantenimento di cinque microgrammi per millilitro di blaster, soin e 50 microgrammi per millilitro.Eosina o blaster soin e G quattro 18. Quando confluenti, suddividere le cellule da ogni pozzetto in un singolo pozzetto di una piastra per colture cellulari a sei pozzetti. Quando confluenti, suddividere le cellule in tre pozzetti di una piastra a sei pozzetti per coltivarle fino a confluenza del 100%.Congelare le cellule da un pozzetto per verificare l'espressione inducibile, aggiungere un microgrammo per millilitro di tetraciclina a un pozzetto, lasciando il secondo pozzetto senza tetraciclina. Incubare in assenza di tetraciclina per 24-96 ore, utilizzando i tempi più brevi per lo screening dell'induzione dell'espressione di CD NA e tempi più lunghi per determinare la riduzione mediata da S-H-R-N-A delle proteine endogene. Successivamente, raccogliere le cellule ed eseguire l'immunoblotting utilizzando gli anticorpi appropriati.Selezionare almeno due cloni con l'abbattimento o la sovraespressione desiderata ed espandere ciascuna coltura. Ricordare di congelare i ceppi di ciascun clone promettente il prima possibile. Questa caratterizzazione iniziale di una linea cellulare di epitelio retinico umano per l'espressione stabile di tatar mostra che tutti i cloni RPE1 esprimono livelli variabili di tatar.Come previsto, la linea cellulare parentale RPE one non esprime la proteina esogena tatar. La variazione nell'espressione di Tet R tra i cloni cellulari RPE one Teton riflette i siti di integrazione del plasmide. Questo esperimento caratterizza cloni cellulari stabili RPE one Teton che esprimono RNA diretti contro la chinasi MST three; tre cloni cellulari sono stati selezionati per ulteriori analisi.Dopo aver visionato questo video, si avrà una buona comprensione di come generare linee cellulari umane stabili con l'espressione non regolamentata dell'RNA o del cDNA oggetto della propria ricerca.

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Contributo del fattore ACF rimodellamento della cromatina per E4orf4 morte cellulare indotta è stata misurata. Il protocollo include la selezione di cloni di cellule in cui il trattamento doxiciclina induce knockdown condizionale della subunità ACF ACF1 e SNF2h, e l'uso del test per misurare DAPI E4orf4 morte cellulare indotta in linee cellulari inducibili.

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Espressione genica basata su un sistema regolabile inducibile Tet-On in vivo: un sistema di espressione genica indotta da tetraciclina per l'attivazione della trascrizione genica bersaglio in un modello murino

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