Valutazione della Meccanica Respiratoria sistema nei topi utilizzando la tecnica delle oscillazioni forzate
15 maggio 2013
Il presente protocollo fornisce una dettagliata descrizione passo-passo le procedure necessarie per eseguire le misurazioni della meccanica del sistema respiratorio, nonché la valutazione della reattività delle vie aeree alla metacolina inalata nei topi usando la tecnica delle oscillazioni forzate (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canada).
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare le misurazioni dell'oscillazione forzata della meccanica respiratoria nei topi utilizzando l'evento flex, un ventilatore a pistone commerciale controllato da computer. Ciò avverrà attraverso la valutazione della responsività delle vie aeree alla metilcolina inalata. Il primo passo è preparare i reagenti richiesti, l'attrezzatura e il soggetto.
Successivamente il soggetto viene collegato al ventilatore per le misure di ventilazione meccanica e meccanica respiratoria. Utilizzando uno script predefinito, viene effettuata una raccolta di misurazioni automatizzate altamente controllate al basale e dopo la provocazione con metilcolina. L'analisi dei risultati può mostrare iperreattività delle vie aeree, come notato dalle maggiori risposte massime di resistenza ed elastina nei topi esposti al cloro rispetto ai soggetti di controllo.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che fornisce uno strumento accurato con cui misurare la funzione polmonare in modo completo, dettagliato e traslazionale. Ciò si ottiene attraverso l'analisi dei segnali di pressione e volume acquisiti in reazione a forme d'onda del flusso d'aria oscillatorio predefinite applicate all'apertura delle vie aeree del soggetto. Inoltre, molti fattori che influenzano la risposta fisiologica possono essere controllati e standardizzati.
Utilizzando questo metodo, accendere il sistema Flex event FX e avviare il software. Il presente protocollo si applica a una delle due generazioni di eventi flessibili supportate da flexi. Indossa sette software durante la prima sessione di sperimentazione o in qualsiasi momento precedente Apri il modulo di definizione e pianificazione dello studio per predefinire la struttura dello studio.
Fare clic sul pulsante Crea un nuovo studio e seguire la procedura guidata per creare uno studio. Delineare il protocollo e definire i gruppi sperimentali e i soggetti da studiare. Avviare una sessione di sperimentazione aprendo il modulo della sessione di sperimentazione e seguendo la sequenza di avvio.
Per lo studio e la selezione del modello. Assegnare un soggetto al sito di misurazione e confermarne il peso. Procedere con la calibrazione del sistema seguendo i passaggi descritti nel software operativo.
Viene visualizzato un messaggio per collegare la cannula da utilizzare al tubo a Y per la calibrazione. Continuare con la calibrazione della cannula seguendo i passaggi della procedura guidata di calibrazione e verificare che i valori di calibrazione ottenuti rientrino nell'intervallo specificato. Se necessario, ripetere il processo di calibrazione a meno che non sia pronto, annullare le istruzioni per avviare la ventilazione e la registrazione dei dati.
Questi possono essere avviati in un secondo momento. Anestetizzare il soggetto utilizzando dosi adeguate di agenti anestetici. Verificare che il soggetto abbia raggiunto un livello chirurgico di anestesia.
Il soggetto non deve mostrare alcuna reazione a un pizzicotto del dito del piede e la sua respirazione deve essere regolare e non affannosa. Posizionare l'animale supino con una fonte di calore per mantenere la corretta temperatura corporea. Una lampadina da 60 watt posizionata a 45 centimetri dal mouse è adeguata.
Quindi pulire la zona della gola con alcool per esporre la trachea. Praticare un'incisione e separare delicatamente la ghiandola sottomascellare e lo strato muscolare che la ricopre. Sollevare delicatamente la trachea utilizzando un paio di micro pinze.
Quindi passare una sutura sotto di esso. Taglia tra i due anelli di cartilagine più vicini alla laringe. Questo fa una piccola incisione nella trachea senza sezionarla.
Inserire la cannula calibrata nell'incisione e farla avanzare delicatamente attraverso cinque anelli tracheali. In questo esempio, è in funzione una cannula metallica calibro 18 da 1,2 centimetri. È fondamentale fissare la cannula utilizzando la sutura.
L'attacco dovrebbe formare una chiusura ermetica attorno alla cannula. Avvicinare l'animale incannulato al ventilatore. Avviare la ventilazione meccanica selezionando un profilo di ventilazione predefinito o personalizzato nella finestra mobile di ventilazione.
Ora collega l'animale al ventilatore tramite il tubo a Y. Allineare con cura l'animale al ventilatore e assicurarsi che la cannula tracheale sia allo stesso livello del ventilatore. In questo modo si evita una possibile cannula, occlusione o torsione tracheale nel software.
Eseguire una perturbazione di gonfiaggio profondo facendo doppio clic sul nome della perturbazione per verificare l'inserimento e il fissaggio della cannula. A meno che non ci sia una perdita, il sistema manterrà una pressione di 30 centimetri d'acqua per un periodo di tre secondi senza uno spostamento eccessivo del volume. Le tracce di volume e pressione registrate devono essere lisce e prive di segni di offset o deformazioni.
In caso contrario, a questo punto potrebbe esserci una cannula, un'ostruzione o un posizionamento errato. Se necessario, è possibile collegare trasduttori dei segni vitali per il monitoraggio della frequenza cardiaca e della temperatura corporea. La registrazione dei dati di questi segnali può essere avviata in qualsiasi momento, manualmente o automaticamente tramite uno script.
Le misurazioni o i comandi per l'attivazione del nebulizzatore, i marcatori di eventi e così via possono essere automatizzati utilizzando script predefiniti o personalizzati per un processo sperimentale altamente controllato e ripetibile. Sei famiglie di perturbazioni che danno origine a una serie di parametri possono essere utilizzate per descrivere la meccanica del sistema respiratorio al basale e dopo una data sfida. Quando si è pronti per iniziare a misurare, è importante eseguire prima la perturbazione dell'inflazione profonda per reclutare aree polmonari chiuse e standardizzare la cronologia del volume polmonare.
Successivamente, verificare l'assenza di sforzi inspiratori spontanei eseguendo una misurazione di prova. Osservare le tracce del segnale di pressione nella vista del set di dati selezionato. Con curve PV graduali.
I plateau di pressione devono essere ben definiti senza deflessioni verso il basso. Un'oscillazione della pressione verso il basso indicherebbe uno sforzo inspiratorio da parte dell'animale. Ora avvia lo script per la valutazione della responsività delle vie aeree alla metilcolina inalata facendo doppio clic sul suo titolo.
In questo esempio, lo script esegue una sequenza di misurazioni di base in triplice copia. Quindi viene richiesto di caricare il nebulizzatore con soluzione fisiologica. Oppure, in questo esempio, una soluzione di metilcolina carica circa 100 microlitri di soluzione nel nebulizzatore.
La nebulizzazione si avvia automaticamente non appena le informazioni vengono inserite nel software. Poco dopo la fine della nebulizzazione, viene avviata una sequenza di misurazioni ravvicinate della durata di circa tre minuti. Successivamente, viene visualizzato un prompt da eseguire.
Un'altra sfida è fornita e la sequenza di misurazioni può essere ripetuta tra una sfida e l'altra. L'asciugatura dell'interno del supporto del nebulizzatore con un tampone può aiutare a prevenire l'accumulo di goccioline o condensa nella linea inspiratoria. Man mano che i dati vengono raccolti, il software calcola i parametri associati alla perturbazione e fornisce un coefficiente di determinazione basato sull'adattamento dei dati al modello.
Successivamente, è possibile accedere all'esperimento tramite il modulo di revisione e reportistica del software per esportare o analizzare ulteriormente i dati. Al termine dell'esperimento, interrompere la ventilazione e staccare il soggetto. Una volta staccato, sopprimere rapidamente l'animale con un sovradosaggio di pentobarbital sodico, quindi può essere eseguito un lavaggio broncoalveolare o i polmoni possono essere isolati per ulteriori analisi.
Prima di passare all'argomento successivo, sciacquare e asciugare l'adattatore del nebulizzatore y il tubo e la cannula. Passare all'argomento successivo nel software operativo e confermarne il peso. Quindi procedere con i passaggi di calibrazione suggeriti prima di continuare con l'esperimento.
Alla fine della giornata, sciacquare e asciugare l'attrezzatura. Ricorda, prima di chiudere la sessione sperimentale, di pulire anche la valvola espiratoria del sistema secondo le istruzioni del produttore al fine di mantenere le prestazioni del tuo sistema. I seguenti esempi rappresentano una selezione di risultati tipici di esperimenti su topi naïve ed esposti al cloro risultati equivalenti da aj naïve.
I topi sono stati ottenuti al basale e dopo la costrizione dei bronchi indotta dalla metilcolina utilizzando una delle due generazioni di eventi di flessione supportate da sette di usura flessibile. Poiché le misurazioni FOT a banda larga consentono una ripartizione della risposta polmonare nei parametri delle vie aeree e del tessuto parenchimale, forniscono un mezzo per identificare le regioni polmonari interessate. Ad esempio, i topi AJ naïve hanno mostrato un aumento della resistenza di base quando la pressione di fine espirazione è stata aumentata da tre a nove centimetri di acqua.
La variazione della pressione di fine espirazione ha comportato una diminuzione della resistenza delle vie aeree coerente con gli effetti broncodilatatori di un volume polmonare più elevato e della maggiore pressione di gonfiaggio, e un aumento dello smorzamento tissutale, un parametro strettamente correlato alla resistenza tissutale che riflette la viscoelasticità tissutale e possibilmente la resistenza delle piccole vie aeree. Quest'ultimo è noto per aumentare con l'aumentare del volume polmonare. Questo protocollo viene spesso utilizzato per valutare la risposta delle vie aeree alla metilcolina inalata dopo l'esposizione al cloro gassoso.
I topi B.SEA hanno mostrato iperreattività delle vie aeree rispetto ai controlli esposti all'aria. Nel presente esempio, i topi esposti al cloro gassoso hanno mostrato risposte massime maggiori a tutti i parametri FOT. Questi topi hanno anche mostrato uno spostamento statisticamente significativo verso sinistra della curva concentrazione-risposta o ipersensibilità alla metilcolina inalata, che è esemplificato da una riduzione della concentrazione di metilcolina necessaria per causare un raddoppio della resistenza e dell'elastina.
Oltre alla FOT, il sistema di eventi flessibili può registrare altre misurazioni, come le curve di pressione-volume. La parte superiore dell'arto di sgonfiaggio è adattata all'equazione di Salazar Knolls e i parametri associati sono calcolati dal software. Per avere successo con questa tecnica, è importante prestare attenzione ad ogni passaggio di particolare importanza sono la calibrazione del sistema, la resistenza della cannula endotracheale, il posizionamento dell'animale e la standardizzazione dei volumi polmonari.
Se questi passaggi vengono seguiti con precisione, questo metodo ti fornirà una caratterizzazione accurata delle proprietà meccaniche del polmone del topo.
Panoramica
Questo protocollo descrive in dettaglio le procedure per misurare la meccanica del sistema respiratorio e valutare la reattività delle vie aeree alla metacolina inalata nei topi utilizzando la tecnica di oscillazione forzata (flexiVent). Il metodo consente misurazioni accurate e controllate della funzione polmonare.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Fisiologia respiratoria
- Modelli animali
- Tecniche di misurazione
Sfondo
- La tecnica di oscillazione forzata fornisce un metodo non invasivo per valutare la funzione polmonare.
- La metacolina viene utilizzata per valutare l'iperreattività delle vie aeree.
- Il sistema flexiVent consente un controllo preciso dei parametri di ventilazione.
- La standardizzazione delle risposte fisiologiche è fondamentale per la riproducibilità.
Obiettivo dello studio
- Dimostrare le misurazioni di oscillazione forzata della meccanica respiratoria.
- Valutare la reattività delle vie aeree in un setup sperimentale controllato.
- Fornire un protocollo dettagliato per i ricercatori in fisiologia respiratoria.
Metodi utilizzati
- Preparazione dei reagenti e delle attrezzature per l'esperimento.
- Ventilazione meccanica del soggetto utilizzando il sistema flexiVent.
- Misurazioni automatizzate della meccanica respiratoria a baseline e dopo la sfida con metacolina.
- Analisi dei dati per valutare la reattività delle vie aeree e la funzione polmonare.
Risultati principali
- Identificazione dell'iperreattività delle vie aeree nei topi trattati.
- Misurazioni accurate di resistenza ed elastance in risposta alla metacolina.
- Protocolli standardizzati migliorano la riproducibilità dei risultati.
- Dimostrazione dei vantaggi del flexiVent rispetto ai metodi tradizionali.
Conclusioni
- La tecnica di oscillazione forzata è efficace per valutare la meccanica respiratoria.
- Questo protocollo fornisce un approccio completo per i ricercatori.
- Studi futuri possono basarsi su questa metodologia per ulteriori approfondimenti nella fisiologia respiratoria.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
The forced oscillation technique (FOT) provides a translational tool for assessing lung function in preclinical models, enabling mechanistic de-risking of respiratory targets. By delivering quantitative, reproducible measurements of respiratory system mechanics, FOT supports target validation and predictive confidence in early discovery. This approach aids in characterizing disease models and screening compounds for airway hyperresponsiveness, informing go/no-go decisions in respiratory therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying airway resistance and elastance changes in response to methacholine challenge.
- Operational Value: Provides standardized, automated measurements that reduce variability and support reproducible target engagement assessments.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through precise phenotyping of lung mechanics in disease models, aiding portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, dose-responsive data on airway function, enabling reliable compound screening for bronchodilatory or bronchoconstrictive effects.
- Operational Value: Supports assay standardization via predefined ventilation profiles and automated perturbation scripts, ensuring consistency across experiments.
- Scalability: The flexiVent system allows high-throughput, repeatable measurements, facilitating platform reuse in respiratory discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by providing clinically relevant lung function metrics that mirror human pulmonary assessments.
- Mechanistic De-risking: Partitions lung response into airway and tissue compartments, helping identify affected lung regions and mechanism of action.
- Disease Model Characterization: Enables comparison of naive and oxidative-stress models (e.g., chlorine-exposed mice) to validate pathophysiological relevance.
Pipeline & Workflow Integration
FOT integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for respiratory indications where lung mechanics are a key biomarker.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring changes in resistance and elastance following pharmacological or genetic perturbations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, automated lung function readouts that enable reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs including resistance, elastance, tissue damping, and coefficient of determination, facilitating comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by offering translational biomarkers of lung function that predict in vivo responses.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across multiple projects studying airway diseases, fibrosis, or toxicant-induced lung injury.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in lung function assessments.
- Operational Value: Enhances reproducibility through system calibration, standardized ventilation, and automated data acquisition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective, quantitative endpoints for airway hyperresponsiveness.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on lung function profiles, reducing late-stage biological risk.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory physiology, anesthesia, and surgical techniques for tracheal cannulation in mice.
- Dependent on instrumentation such as the flexiVent system, nebulizers, and transducers for pressure, volume, and vital sign monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of ventilation profiles, challenge protocols, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations when applying the technique across different mouse strains, disease models, or exposure paradigms.
- Includes practical limitations such as the need for precise cannula placement, leak-free seals, and controlled anesthetic depth to avoid confounding ventilatory efforts.
