Name: Condizionata tattile e Analisi del Movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere ( Apis mellifera L.) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Impara a condizionare le api mellifere a stimoli tattili e analizza i movimenti delle antenne con tecniche di motion capture 2D. Questo metodo permette di studiare i meccanismi di apprendimento associativo e non associativo negli insetti.

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Ringraziamo Joachim Erber per l&#39;introduzione di noi al paradigma dell&#39;apprendimento tattile di api mellifere. Questo lavoro è stato sostenuto dal cluster di 277 CITEC Excellence, finanziato nell&#39;ambito dell&#39;iniziativa eccellenza tedesca.

1. Preparazione delle api <ol><li> Bottinatrici nettare o polline sono catturati in campo sia da un alimentatore di saccarosio o direttamente dall&#39;ingresso alveare mentre tornava da un viaggio foraggiamento. Ogni singola ape viene catturata in una fiala di vetro che viene chiuso con un tappo di schiuma e presi immediatamente in laboratorio per ulteriori manipolazioni. </li><li> In laboratorio, le api catturate sono brevemente raffreddata in frigorifero a 4 ° C fino a quando i primi segni di immobilità. </li><li> Ogni singola ape immobilizzato è montato in un tubo metallico piccola con nastro adesivo tra la testa e il torace e sopra l&#39;addome. Si deve prestare attenzione che la proboscide e le antenne sono liberamente mobili. </li><li> Dipingere gli occhi composti e ocelli delle api fisso con vernice bianca (ad esempio, esente da solventi, Tipp-Ex) da occludere visione. </li><li> Aggiungere una goccia di cera fusa dietro la testa delle api per fissarlo al nastro tra la testa e il torace per evitare movimenti della testa durante le registrazioni. </li><li> Contrassegnare ogni singola ape con un numero sul nastro per una migliore identificazione e posizionare il tubo con l&#39;ape fisso in un ambiente umido per prevenire la disidratazione. </li><li> Alimentare ogni singola ape per 5 secondi con gocce di una soluzione di saccarosio al 30% presentato con una siringa e lasciare tutte le api recuperare per 30 min prima di iniziare con il protocollo condizionata tattile. </li></ol> 2. Condizionamento tattile <ol><li> Prima del condizionamento, ogni singola ape deve essere testato per la risposta estensione proboscide (PER) a uno stimolo di saccarosio 30% applicata alle antenne. In tal modo la punta della proboscide deve attraversare una linea virtuale tra le mandibole aperte. Eliminare tutte le api che non rispondono con un PER allo stimolo saccarosio. </li><li> Per il condizionamento tattile usare un cubo ottone (es. 3 x 5 mm) con una superficie liscia o un motivo inciso, ad esempio, scanalature orizzontali o verticali che formano un reticolo con 150 micron lunghezza d&#39;onda, come stimolo condizionato (CS). Fo lo stimolo incondizionato (US) utilizzare una soluzione di saccarosio al 30% (zucchero domestico, diluito in acqua). </li><li> Il cubo ottone (CS) è collocato in un supporto su un micromanipolatore (ad esempio, Märzhäuser MM33) per garantire l&#39;esatto posizionamento durante la procedura di condizionamento. L&#39;US è presentato al ape con una siringa riempita con una soluzione di saccarosio al 30%. </li><li> Il procedimento di condizionamento costituito da cinque coppie di stimolo tattile (CS) e soluzione di saccarosio (US), con un inter-trial intervallo (ITI) di 5 min. Posizionare una singola ape davanti al micromanipolatore con lo stimolo montato tattile (CS). Posizionare il CS lentamente, in modo tale che la superficie dello stimolo tattile è parallelo alla testa delle api (Figura 1 A e B). La distanza tra l&#39;animale e l&#39;oggetto tattile dovrebbe essere nell&#39;intervallo del raggio antennale lavoro dell&#39;ape testati, cioè l&#39;ape dovrebbe essere in grado di eseguire la scansione dello stimolo tattile in una posizione comoda wesimo entrambe le antenne. Nell&#39;esempio illustrato in figura 1, la distanza di 3 mm. Lasciate che l&#39;ape scansione lo stimolo tattile (CS) per 5 sec. Dopo i primi 3 sec, presentano una gocciolina di saccarosio 30% (US) soluzione con una siringa sotto la proboscide. Usare la punta della siringa per sollevare delicatamente la proboscide. Stimolazione Saccarosio sotto le proboscide susciterà l&#39;incondizionato PER 15. Lasciare l&#39;ape a leccare la ricompensa di saccarosio. Utilizzare un cronometro con un segnale di allarme per mantenere gli intervalli di tempo durante il condizionamento esatti. </li><li> Il PER condizionato viene usato come misura per il successo di apprendimento di un ape. Dopo gli accoppiamenti primo premiati, le api iniziano a rispondere alla presentazione CS per estensione dei loro proboscide, che indica che si aspettano la ricompensa futura. A proboscide massima estensione osservati in qualsiasi momento durante la finestra 3 sec Tempo di presentazione dello stimolo tattile e prima della presentazione saccarosio è segnato come una risposta positiva. Nessuna risposta è negativa contato. Il occurrence della PER Va osservato dallo sperimentatore. La percentuale di api che mostrano il PER in occasione della presentazione CS è tracciata per ogni prova. </li></ol> 3. Registrazioni cinematici <ol><li> Movimenti antennale di un&#39;ape sfruttata sono registrati con una videocamera digitale con un obiettivo macro adatto (per esempio Basler A602f-2 dotato di TechSpec VZM 200, operato a 50 fps tramite una connessione FireWire). La telecamera è posizionata sopra l&#39;animale in una vista dall&#39;alto in basso (Figura 1 A). In figura 1, la risoluzione spaziale delle registrazioni è di 0,02 mm / pixel. </li><li> Calibrare la fotocamera con la registrazione di immagini singole di una scacchiera 10 x 10 mm, con una lunghezza dello spigolo 1 mm da diversi orientamenti nel quadro dell&#39;obiettivo della fotocamera. La calibrazione può essere fatto con la cassetta degli attrezzi di calibrazione fotocamera Matlab 16. </li><li> Posizionare un un&#39;ape fissa sotto la lente della fotocamera. Presentare lo stimolo tattile, fissato ad un micromanipolatore, Per l&#39;animale. Procedere nello stesso modo descritto per il condizionamento tattile, e registrare il movimento antennale mentre l&#39;ape viene scansione dell&#39;oggetto. È importante che l&#39;intera gamma antennale lavoro e lo stimolo tattile sono visibili. Le scelte dei modelli di stimolo testato e numeri di prova dipende dal disegno sperimentale. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Il calcolo dello sfondo dell&#39;immagine è fatto in Matlab. Primo, il valore mediano di grigio nel tempo deve essere calcolato per ciascun pixel. Oggetti statici, come la testa fissa delle api e lo stimolo tattile, costituirà l&#39;immagine di sfondo. Oggetti in movimento, come due antenne, non sarà parte dello sfondo. </li><li> Ogni fotogramma del video registrato deve essere caricato in sequenza, e la differenza tra il frame corrente e lo sfondo dell&#39;immagine deve essere calcolata. Il risultato di questa sottrazione enfatizza quelle parti dell&#39;immagine che si sposta da frame a frame. Ideally, le antenne delle api sono le uniche aree di valori diversi da zero (Figura 1C). </li><li> Per l&#39;ulteriore elaborazione, i due più grandi aree con valori diversi da zero pixel vengono considerati le antenne. Per entrambe le antenne di una maschera binaria deve essere generato contenenti, per ciascun pixel un valore 1, se il pixel appartiene alla antenna e valore 0 altrimenti. Questa maschera serve come base per localizzare le punte antennali tardi. Per ottenere una maschera preliminare per l&#39;intera immagine del grigio-valore di ciascun pixel dell&#39;immagine differenza viene confrontata con una soglia predefinita. Dal momento che ci prendiamo cura di rumore entro la soglia viene scelto per essere piuttosto basso. La maschera preliminare poi porta ancora due tipi di errori: in primo luogo, a causa del rumore di immagine piccole regioni sono ancora parte della maschera. In secondo luogo, le aree che appartengono alla antenna potrebbe non necessariamente essere completamente collegato. Quest&#39;ultimo si verifica soprattutto se lo sfondo ha approssimativamente la stessa luminescenza come antenna. Per eliminare questi artefatti, standardoperazione di trattamento immagini morfologiche vengono applicate, ossia una combinazione di erosione e dilatazione dell&#39;immagine, basandosi sulle funzioni standard Matlab imerode e imdilate rispettivamente (vedi 17 pp 158-205 per ulteriori spiegazioni). Dopo il processo di denoising le ipotesi antenne sono ancora contenute all&#39;interno della maschera stessa. Quindi, come passo successivo la maschera binaria è in cluster per le aree disgiunte che utilizzano lo standard Matlab funzione bwlabel (vedi 17 pp 40-48 per ulteriori dettagli su l&#39;algoritmo di segmentazione di immagini). </li><li> Il numero di pixel per cluster viene contato e le due maggiori gruppi sono selezionati. Il centro di gravità è calcolata a distinguere tra l&#39;antenna sinistra e destra (Figura 1D). </li><li> La punta antennale per ciascuna antenna può essere definita come il pixel in un cluster con il valore massimo nella prossimale-distale direzione (vedi Figura 1D). </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Preparazione delle api: raccogliere e fissare le api dovrebbe essere fatto rapidamente, al fine di mantenere il livello di stress di bassa animale. Lo stress ha un effetto sulla PER-risposta e, quindi, potrebbe avere un effetto indiretto sulle prestazioni di apprendimento delle api 19, 20. Il livello di stress può essere ridotta collocando i flaconi di vetro con le api direttamente su ghiaccio immediatamente dopo il prelievo per immobilizzare rapidamente. Si deve tenere conto che le api bisog...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Bottinatrici di polline, Apis mellifera L. </td><td></td><td></td><td> Orticaria privati </td></tr><tr><td> Fiale di vetro (22 x 45 mm) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> X655.1 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi in ottone, 10 x 30 mm </td><td></td><td></td><td> Auto-prodotto </td></tr><tr><td> Ottone cubo, 3 x 5 mm </td><td></td><td></td><td> Auto-prodotto </td></tr><tr><td> Tipp-Ex (senza solventi) </td><td> Tipp-Ex GmbH &amp; Co KG </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di saccarosio (30%) </td><td></td><td></td><td> Suger domestica diluito in acqua </td></tr><tr><td> Etanolo (70%) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> 9.065,3 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Siringa (1 ml) e l&#39;ago (0,6 x 25) </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> 59,1 </td><td></td></tr><tr><td> Stop Watch </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> L423.1 </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipolatore </td><td> Märzhäuser MM33 </td><td> 00-42-101-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Videocamera digitale </td><td> Basler A602f-2 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Obiettivo Macro per fotocamera </td><td> TechSpec VZM 200 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Matlab R2009b </td><td> The MathWorks </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

condizionata tattile e analisi del movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere (<em&gt; apis mellifera</em&gt; l.)

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Le api da miele (Apis mellifera L.) sono insetti eusociali e ben noti per la loro complessa divisione del lavoro e la capacità di apprendimento associativo 1, 2. Le api operaie trascorrere la prima metà della loro vita all&#39;interno dell&#39;alveare buio, dove sono le larve allattamento o la costruzione della regolare pettini esagonale per il cibo (ad esempio polline o nettare) e la covata 3. Le antenne sono straordinari antenne multisensoriali e svolgono un ruolo fondamentale in diversi compiti tattili mediate 4, tra cui lo sviluppo alveare 5 e riconoscimento di pattern 6. Più tardi nella vita, ogni singola ape lascia l&#39;alveare alla ricerca di cibo. Poi un ape deve imparare a discriminare redditizie fonti di cibo, memorizzare la loro posizione, e comunicare ai propri compagni di nido 7. Api utilizzano diversi segnali floreali come colori o odori 7, 8, ma anche tattili dalla superficie petalo 9 per formare memorie multisensoriali della fonte di cibo. In laboratorio conditions, le api possono essere addestrati in un paradigma di apprendimento appetitivo di discriminare le caratteristiche degli oggetti tattili, come i bordi o scanalature con le loro antenne 10, 11, 12, 13. Questo paradigma di apprendimento è strettamente legato al condizionamento classico olfattivo della risposta estensione proboscide (PER) in api bardati 14. Il vantaggio del paradigma dell&#39;apprendimento tattile in laboratorio è la possibilità di combinare esperimenti comportamentali sull&#39;apprendimento con varie misurazioni fisiologiche, compresa l&#39;analisi del modello di movimento antennale.

Nel seguente esperimento abbiamo studiato come l&#39;apprendimento tattile influenza il comportamento antennale campionamento di api mellifere. Per questo, abbiamo monitorato il movimento della punta antennale in api pretrattati e condizionati prima e durante la presentazione di uno stimolo tattile. Primo, il movimento spontaneo antennale di un gruppo di raccoglitori polline (N = 42) è stata registrata per 1 min. Metà delle api (N = 21) è stata poi condizionata accoppiando cinque volte uno s...

In questo protocollo si mostra come condizione sfruttata api a stimoli tattili e introdurre un 2D tecnica del motion capture per analizzare la cinematica di fine scala modello di campionamento antenne.

Condizionata tattile e Analisi del Movimento di strategie di campionamento antennale di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

Gli obiettivi generali di questa procedura sono mostrare come condizionare le api a stimoli tattili e introdurre una tecnica di motion capture 2D per analizzare la cinematica di scala fine e 10 modelli di campionamento. All'inizio, la procedura richiede la cattura di api in volo libero davanti al loro alveare. Il secondo passo consiste nell'imbrigliare le api in tubi di metallo e occludere i loro occhi con vernice bianca.Successivamente, le api vengono addestrate allo stimolo tattile utilizzando la classica procedura di condizionamento. Il passaggio finale consiste nel registrare il movimento dell'antenna dell'ape condizionata con una videocamera digitale. In definitiva, il motion capture 2D in MATLAB viene utilizzato per analizzare i cambiamenti nel comportamento del movimento di un'antenna nelle api mellifere dopo paradigmi di apprendimento tattile associativo e non associativo.Questo metodo può essere utilizzato per studiare la discriminazione tattile e la percezione in varie specie alterabili. Può differenziare i cambiamenti dovuti all'apprendimento tattile non associativo dai cambiamenti che si verificano dall'apprendimento associativo, come durante il condizionamento. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le api devono essere maneggiate con molta attenzione e la tempistica della procedura di condizionamento tattile è fondamentale.Il metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del rilevamento tattile attivo. Utilizza un comportamento riflesso naturale come comportamento di segnalazione, permettendoci di capire se l'animale può discriminare o meno tra due stimoli tattili. Per iniziare, raccogli le api direttamente dall'ingresso dell'alveare.Cattura ogni ape in una fiala di vetro chiusa con un tappo di schiuma e portala immediatamente in laboratorio per un'ulteriore manipolazione in laboratorio. Brevemente, raffreddare le api in un frigorifero a quattro gradi Celsius fino a quando non iniziano a mostrare segni di immobilità. Per prima cosa, immobilizza ogni ape su un tubo di metallo.Posizionare del nastro adesivo intorno alla testa e al torace e sopra l'addome. Verificare che il probo e un'antenna siano liberamente mobili per occludere la visione dell'ape. Dipingi gli occhi composti e i selli con vernice bianca.Metti una piccola goccia di cera fusa tra la testina e il nastro per evitare che la testina si muova. Durante le registrazioni. Per una più facile identificazione, contrassegnare il nastro di ogni ape mellifera con un numero e posizionare il tubo in un'atmosfera umida per prevenire la disidratazione.Infine, usa una siringa riempita con una soluzione di saccarosio al 30% per nutrire ogni ape per cinque secondi e lasciarla recuperare per 30 minuti. Prima di iniziare il protocollo di condizionamento tattile, prima del condizionamento, testare ogni B per la risposta all'estensione psis o PER. Per fare ciò, applicare uno stimolo al 30% di saccarosio alle antenne per una risposta corretta.La punta della psia deve attraversare una linea virtuale tra le mandibole aperte. Per lo studio vengono utilizzate solo api con un PER corretto. Per il condizionamento tattile, le strutture superficiali metalliche vengono utilizzate come stimolo condizionato o cs.La loro superficie può essere liscia o scanalata per creare una trama diversa. Lo stimolo incondizionato o ecografia è una soluzione di saccarosio al 30%. Posiziona il cubo di ottone in un supporto su un micro manipolatore.Ciò consentirà un posizionamento esatto durante la procedura di condizionamento. Una volta montato lo stimolo tattile, posizionare un'ape davanti al micro manipolatore. Quindi, posiziona lentamente le C in modo che la superficie dello stimolo tattile sia parallela alla testa dell'ape.L'ape dovrebbe essere in grado di scansionare lo stimolo tattile in una posizione comoda con entrambe le antenne. Per iniziare la procedura di condizionamento, lasciare che la perlina esegua la scansione dello stimolo tattile per cinque secondi. Dopo i primi tre secondi, utilizzare una siringa per presentare una gocciolina della soluzione di saccarosio al 30% sotto il probo.Utilizzare la punta della siringa per sollevare delicatamente il probus. Questa stimolazione dovrebbe suscitare il PER incondizionato. Consenti all'ape di leccare il saccarosio.Ricompensa per un secondo. Procedi con la procedura di condizionamento fino a quando l'ape non riceve cinque accoppiamenti. Dopo i primi accoppiamenti premiati, le api dovrebbero iniziare a rispondere alla presentazione CS estendendo i loro psi, indicando che si aspettano la ricompensa imminente.Una psisi completamente estesa osservata in qualsiasi momento durante i primi tre secondi di presentazione dello stimolo tattile prima della presentazione del saccarosio viene valutata come risposta positiva. Infine, viene generata una curva di apprendimento per un gruppo di api. Per questo, per ogni prova viene tracciata la percentuale di api che mostrano il PER durante la presentazione CS.Dopo il condizionamento, viene utilizzata una videocamera digitale con un obiettivo macro adatto per registrare i movimenti dell'antenna. Qui utilizziamo una fotocamera basler a 602 F, dotata di un obiettivo VZM 200 con specifiche tecniche che funziona a 50 fotogrammi al secondo tramite una connessione a filo antincendio, regola la fotocamera in modo tale che l'ape imbrattata e lo stimolo tattile siano visibili. Quindi, calibrare la fotocamera scattando singole foto di una scacchiera calibrata da diversi orientamenti.Utilizza un software specializzato con uno strumento di calibrazione della fotocamera per analizzare le immagini. Una volta calibrato, posizionare una singola B fissa sotto l'obiettivo della fotocamera e presentare lo stimolo tattile. Come illustrato in precedenza.Registra il movimento di sigillatura mentre l'ape sta scansionando l'oggetto. Una volta raccolti i dati, MATLAB viene utilizzato per definire prima lo sfondo dell'immagine, calcolare il valore mediano della scala di grigi nel tempo per ogni pixel. Oggetti statici come la testa fissa dell'ape e lo stimolo tattile costituiranno lo sfondo dell'immagine sottraendo lo sfondo dell'immagine da ogni fotogramma le parti mobili del video.Idealmente, le antenne dell'ape sono isolate come le uniche aree con valori diversi da zero per un'ulteriore elaborazione. Si presume che le due aree più grandi con valori di pixel diversi da zero siano le antenne. Viene creata una maschera per localizzare le punte dell'antenna e per l'intera immagine per ridurre la quantità di errore.Una volta che queste tecniche hanno ridotto il livello di rumore, viene applicata una combinazione di strumenti di erosione e dilatazione dell'immagine. Una funzione di maschera binaria viene utilizzata per raggruppare le aree disgiunte. Il centro di gravità viene calcolato per i due più grandi di questi ammassi al fine di distinguere tra l'antenna sinistra e quella destra.Qui, sono etichettati a colori in rosso e verde. Infine, la punta dell'antenna per ogni antenna può essere definita come il pixel in un cluster con il valore più alto in direzione prossimale e distale, viene creato un istogramma bidimensionale che mostra la distribuzione spaziale di una punta mostrata. Ecco la curva di apprendimento del condizionamento tattile del PER nel forgiatore di polline.La percentuale di risposte positive dopo il primo abbinamento era significativamente più alta rispetto al comportamento spontaneo e la curva di apprendimento mostra saturazione dopo la terza ricompensa. In questo esempio, il movimento della punta anale sia nel gruppo condizionato che in quello naïve è stato registrato per un minuto in presenza o assenza dello stimolo tattile visto. Qui ci sono movimenti spontanei di un tunnel prima della presentazione dello stimolo.L'absa mostra la posizione laterale della punta di un tunnel mentre l'ordinata mostra la posizione distale. La scala dei colori indica la percentuale di tempo che la punta dell'anina ha trascorso in una determinata posizione. Il giallo indica che le posizioni rosse, meno frequenti e nere sono fuori portata.Questi dati mostrano che sia il gruppo condizionato che il gruppo condizionato hanno cambiato il loro modello di movimento antale in presenza di uno stimolo tattile rispetto al loro comportamento spontaneo. Si noti che la regione gialla rettangolare vicino alla superficie dello stimolo indica che la punta del tallone della formica ha trascorso molto tempo a campionare la superficie. Le api del gruppo condizionato hanno trascorso molto più tempo con la punta dell'antenna nell'area dello stimolo rispetto alle api ingenue.Seguendo questa procedura, si possono trovare metodi elettrofisiologici e farmacologici per rispondere a ulteriori domande come: qual è la base neurofisiologica del comportamento tattile attivo nelle api mellifere Dopo il suo sviluppo? Questa tecnica di condizionamento tattile ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del rilevamento attivo del tocco per esplorare vari aspetti della discriminazione dello stimolo tattile, ma anche dell'apprendimento tattile e della memoria in Alpha Pots. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare la ricerca tattile attiva e i movimenti di campionamento e gli insetti.Si noti che l'analisi del movimento può essere espansa all'analisi tridimensionale se almeno un'ulteriore telecamera viene aggiunta in sincronia alla prima.

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