Attivazione Optogenetic di zebrafish neuroni somatosensoriali con Chef-tdTomato

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di attivare singoli neuroni somatosensoriali nelle larve di pesce zebra. Ciò si ottiene preparando prima un cavo ottico e collegandolo al laser blu ADPS . Il secondo passo consiste nell'iniettare il transgene in uno o due embrioni in stadio cellulare.

Successivamente esamina gli embrioni grassi che esprimono il pomodoro C-H-E-F-T-D nei neuroni somatosensoriali e montali inus. Il passaggio finale consiste nell'erogare un breve impulso di luce blu per l'attivazione di un singolo neurone e registrare il comportamento risultante. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti che utilizzano l'opzione due della radice del canale è che questo approccio potrebbe essere utilizzato per suscitare risposte comportamentali da singoli neuroni attivati fino ad almeno quattro giorni dopo il ricovero.

Anche se questo metodo viene utilizzato per fornire informazioni sulla funzione di specifici neuroni somatosensoriali nelle larve di pesce zebra. Questo approccio potrebbe anche essere adattato per studiare i comportamenti suscitati da qualsiasi popolazione neuronale di zebrafish, come i neuroni interni o i motoneuroni. Questo approccio genetico potrebbe essere utilizzato per attivare neuroni specifici in vivo, caratterizzare lo sviluppo funzionale, valutare gli effetti di mutazioni o blocchi fenomenologici di proteine specifiche sul comportamento e mappare le reti neuronali a valle che portano a risposte comportamentali distinte.

Per iniziare questa procedura, creare un'unità di stoccaggio per il cavo ottico fondendo il collo affusolato di un bicchiere. Pipetta la pasta sopra un fochè e brucia per creare un angolo di 150 gradi. Quindi, utilizzando un tronchese o una lama di rasoio, tagliare con cura il cavo ottico in due pezzi.

Ogni pezzo dovrebbe avere un'estremità esposta e un'estremità con un adattatore FC PC. Quindi spelare il cavo ottico fino al rivestimento rimuovendo la guaina in fibra, le fibre di rinforzo e il rivestimento da 5,0 centimetri dell'estremità tagliata del cavo. Successivamente, inserire il cavo ottico nella pipetta per pasta preparata.

Assicurarsi che il cavo possa muoversi facilmente all'interno e all'esterno del puntale della pipetta utilizzando un tagliavetro diamantato o una pinza a punta fine. Intacca la fibra di vetro e rompi l'estremità per creare un taglio netto all'estremità della fibra. Quindi, riavvolgere il cavo ottico nella pipetta per pasta.

Quindi posizionare manualmente il cavo ottico nella pipetta per pasta utilizzando un micro manipolatore al microscopio, CODIFICARE manualmente da 24 a 48 embrioni HPF utilizzando un paio di pinze, quindi anestetizzare le larve utilizzando 0,02% di trica utilizzando un microscopio da dissezione fluorescente. Identificare le larve con l'espressione del neurone Ron Beard o del neurone trigemino Gli embrioni con espressione sparsa in cellule facilmente identificabili sono ottimali, ma i singoli neuroni saranno presi di mira per l'attivazione con un cavo in fibra ottica, quindi è accettabile un'ampia gamma di densità di espressione. Trasferire le larve in un nuovo piatto con acqua fresca di embrione blu PTU.

Conservare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius al buio fino alla fase sperimentale desiderata. In questa sezione, preparare l'1,5% di maltasi bassa e acqua distillata doppia e conservare in un blocco termico a 42 gradi Celsius per evitare che si solidifichi. Utilizzando una pipetta di vetro per la pasta, trasferire una delle larve pre-screening in un tubo di agarosio a basso punto di fusione all'1,5% con meno acqua blu dell'embrione possibile.

Quindi trasferire la larva in una goccia di agarosio su una piccola capsula di Petri. Al microscopio da dissezione, posizionare la lava con il lato dorsale rivolto verso l'alto quando l'aros si è solidificato. Usa una lama di rasoio sottile per tagliare via gli aros da entrambi i lati della lava.

Riempi l'area circostante l'aros con acqua blu embrionale. Successivamente, fai due tagli diagonali su entrambi i lati del tuorlo, facendo attenzione a non intaccare la lava. Successivamente, stacca l'agrow dal tronco e dalla coda della lava.

Ora monta la telecamera ad alta velocità sul cannocchiale da dissezione e collega la telecamera al computer. Quindi accendi il computer e la telecamera ad alta velocità. Aprire il software di imaging video e regolare le impostazioni della fotocamera.

Quindi, collegare insieme il cavo ottico, il laser e lo stimolatore. Quindi accendi lo stimolatore e impostalo su un massimo di cinque volt e la durata dell'impulso di cinque millisecondi. Successivamente accendere il laser.

Successivamente, utilizzare il microscopio da dissezione fluorescente per posizionare la punta del cavo ottico vicino a un corpo cellulare neuronale con espressione di pomodoro C-H-E-F-T-D. Eroga un impulso di luce blu per attivare il neurone sensoriale. Quindi registra le risposte utilizzando una telecamera ad alta velocità.

Impostare a 500 o 1000 fotogrammi al secondo, e ripetere l'esperimento con almeno un minuto tra le attivazioni per evitare l'assuefazione, per rilasciare la parte lava precedente, l'Aris con il forcipe, e fare attenzione a non innermare l'animale. Quindi trasferiscilo in acqua fresca di embrioni blu. Gli animali possono essere lasciati sviluppare ulteriormente e la procedura può essere ripetuta nelle fasi più avanzate.

L'embrione potrebbe anche essere rimontato per l'imaging confocale ad alta risoluzione della cellula attivata al fine di correlare il comportamento con la struttura cellulare. La lava del pesce zebra qui schematizzata è parzialmente montata in Aris a basso contenuto di malto all'1,5%, rappresentato dalle linee tratteggiate che circondano la sua parte rostrale. Un neurone trigemino e un neurone della barba di Rohan sono raffigurati in cellule rosse della bocca sono delineate dalle linee tratteggiate nell'illustrazione.

Ecco un filmato che mostra che l'attivazione di un singolo neurone della barba di Rohan che esprime il pomodoro C-H-E-F-T-D in una lava di circa 35 HPF suscita una risposta comportamentale. Questo filmato mostra l'attivazione del pomodoro C-H-E-F-T-D che esprime i neuroni della barba di Rohan in una lava da 60 HPF, e questo filmato mostra l'attivazione dei neuroni della barba di Rohan dell'espressione del pomodoro C-H-E-F-T-D in una lava a quattro DPF Una volta padroneggiata. Questo approccio genico può essere eseguito in meno di un'ora.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come attivare i singoli neuroni e i pesci larvali della Bilancia in vari momenti. Non dimenticare che lavorare con i laser può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre le dovute precauzioni di sicurezza durante l'esecuzione di questa procedura.