Name: Naïve Adult Stem Cells isolamento da colture primarie di fibroblasti umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Impara a isolare cellule staminali SKP naive da colture primarie di fibroblasti umani. Questo metodo sfrutta la resistenza allo stress per selezionare precursori multipotenti utili per la medicina rigenerativa.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Alexander von Humboldt (5090371), la Christine Kühne Center for Allergy Research and Education (CK-CARE), e la Bayerischen Staatsministerium (a KD).

1. Isolamento SKP da colture di fibroblasti primari <ol><li> Colture di fibroblasti o di banche di cellule o ottenuti direttamente da biopsie della pelle sono mantenute in coltura in crescita dei fibroblasti mezzo DMEM contenente 15% siero fetale di vitello, glutammina 2 mM, 10 mg / ml di penicillina e 10 mg / ml di streptomicina. </li></ol> Fibroblasti umani GMO3349C e GMO8398A sono stati ottenuti dal Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ) e sono stati utilizzati in questo studio. <ol start="2"><li> Culture di raddoppi di popolazione (PPD), da 20 a 35 sono stati utilizzati per colture SKP ad una confluenza del 80%. Un 10 centimetri tessuto cultura piatto (BD Falcon) contiene circa 1.5x10 6 celle. </li><li> Lavare le cellule con PBS e incubare con 2 ml di soluzione di tripsina (0,25%, Invitrogen) per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Raccogliere le cellule dalla piastra con 5 ml di PBS e trasferire la sospensione cellulare in un tubo falcon 15 ml. </li><li> Incubare le cellule a 4 ° C per 24 hr. </li><li> Preparare terreno di crescita SKP consistente di DMEM-F12, 03:01 (V / V) e 40 ng / ml FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml di EGF (BD Biosciences), B27 siero supplemento libero 2% (Invitrogen), 1 ug / ml Fungizone (Invitrogen) e 25 micron / ml di gentamicina (Invitrogen). </li><li> Agglomerare le cellule a 1200 rpm per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare direttamente in 4 ml SKP mezzo di crescita. Trasferire la sospensione cellulare in un pallone di coltura tissutale 25 centimetri 2 (BD Falcon). </li><li> Incubare il matraccio a 37 ° C e monitorare la cultura per la formazione sfera giorno per 3 a 4 settimane. </li></ol> 2. Sfera Culture Condizioni <ol><li> Cellule di coltura in una beuta 2 25 cm (BD Falcon) a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Agitare il matraccio vigorosamente giorno per evitare cellule di aderire al fondo del pallone. Se necessario, pipettare su e giù con una pipetta sterile 2 ml per staccare cellule aderenti e trasferire la cultura di un pallone nuovo. </li><li> Prime sfere iniziano a costruire entro 3 to 4 giorni. </li><li> Lasciare sfere sedimenti sul fondo del pallone e il cambiamento metà del mezzo ogni 3 giorni. Per mantenere la stessa concentrazione finale di fattori di crescita aggiungere fattori di crescita 2X alla SKP terreno di coltura preparati al momento. </li><li> Tenere il volume costante massimo 4 ml. </li><li> Quando sfere raggiungono una dimensione di ~ 200 millimetri dovrebbero essere diversi passaggi rompendo le sfere di piccole dimensioni di vigorosa pipettando su e giù con una pipetta 2 ml. </li><li> La cultura è diviso in due 25 centimetri 2 boccette (BD Falcon) e sfere culture sono alimenti come descritto al punto 2.4). </li><li> Sfere sono raccolti per marcatori di cellule staminali di screening per giorno da 16 a 21. </li></ol> La procedura da 2.6) e 2.7) descrive la propagazione delle sfere a (1) permette di nutrienti e fattori di crescita compresi nel SKP medie di accedere a tutte le cellule all&#39;interno di ogni sfera e (2) per espandere la cultura sfera SKP prima dell&#39;uso. Tipicamente culture sfera sotto i nostri cucondizioni lture mantengono la capacità di crescere su un periodo di tre mesi e sono diversi passaggi da 3 a 4 volte. 3. Immunocitochimica di marcatori di cellule staminali <ol><li> Culture Sphere sono raccolte in PBS da giorno 16 al 21. Le culture sono pellettato a 1.000 rpm per 5 min. </li><li> Sfere sono risospese in un piccolo volume di PBS. </li><li> Disegnare due cerchi con una penna DAKO di circa 0,5 micron di diametro su vetrini da microscopio (marchio Fisher). </li><li> Aggiungere 50 ml di sospensione sfera in circoli. </li><li> Controllare al microscopio ottico per la presenza di sfere in ciascuna goccia. </li><li> Lasciate asciugare le gocce sotto il cofano. </li><li> O congelare i vetrini a -80 ° C oppure procedere con il protocollo di colorazione immunofluorescenza. </li><li> Per immunofluorescenza, fissare i vetrini con metanolo precedentemente raffreddata (100%) a -20 ° C per 10 min. </li><li> Lavare i vetrini con PBS. </li><li> Bloccare le diapositive con PBS/10% di siero fetale bovino / 0.02% Triton X100per almeno 1 ora. </li><li> Incubare con anticorpo primario (ad esempio anti-Nestin, anti-Oct4, anti-TG30, gli anticorpi anti-Nanog, tabella 3) diluito in tampone di bloccaggio: PBS/10% FBS per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C. </li><li> Lavare 3 volte con tampone di arresto e incubare con l&#39;anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte con il blocco tempi di buffer e 3 con PBS. </li><li> Mount diapositive con Vectashield montaggio medium (Vector Inc.). </li><li> Analizzare i campioni per l&#39;espressione di marcatori di cellule staminali mediante microscopia di immunofluorescenza. </li></ol> 4. L&#39;analisi PCR in tempo reale dei livelli di espressione di marcatori di cellule staminali <ol><li> Prendete circa 2-3 ml culture Sfera da giorno 18 a 21. </li><li> Pellet le sfere a 1200 rpm per 5 minuti e aspirare tutte di media. </li><li> Isolare RNA dalle sfere utilizzando il Minikit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). </li><li> Valutare la purezza dell&#39;RNA mediante spettrometria e gel. &lt;/ Li&gt; <li> Sintetizzare cDNA (Omniscript trascrittasi inversa (Qiagen)) con il totale di RNA cellulari come modello. </li><li> Convalidare i marcatori di cellule staminali da Realtime-PCR utilizzando i primer per marcatori di cellule staminali (indicata nella Tabella 1) in un Power SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems), con una concentrazione di 375 nM di ciascun primer e 50 ng di template in un 20 l volume di reazione. GAPDH è utilizzato come controllo endogeno. </li><li> Per l&#39;amplificazione utilizzare un denaturazione iniziale a 95 ° C per 2,5 minuti seguiti da 40 cicli a 95 ° C per 5 sec e 60 ° C per 20 sec. </li><li> Analizza la corsa con il 2 (ΔΔCt) Metodo 8. </li></ol> 5. Differenziazione Regia in cellule muscolari lisce <ol><li> Sfere da giorno 21 al 26 sono stati placcati in 6 piatti della cultura e (BD Falcon) in SKP medie. </li><li> Le cellule sono stati autorizzati ad aderire e diventare troppo grande dalle sfere in media SKP per 72 ore. </li><li> Cellule muscolari lisce (SMC) differenzianteione iniziato avviato dal sostituito il mezzo con SMC terreno di differenziamento costituito alta glucosio di Dulbecco Modified Eagle Medium (Invitrogen) contenente il 5% FBS, 5 ng / ml di PDGF-BB (Invitrogen), e 2,5 ng / ml di TGF-b1 (Invitrogen) . </li><li> Mezzo è stato cambiato ogni 3 giorni con appena preparato terreno di differenziamento SMC per un periodo di 3 a 4 settimane in culture. </li><li> Lo screening per i marcatori SMC è stata eseguita dopo 3 o 4 settimane di immunoistochimica. </li><li> Cellule sono state fissate con soluzione di paraformaldeide 4% in PBS per 10 min. </li><li> Le cellule sono state permeabilizzate con PBS contenente 0,3% Triton X-100 per 30 min. </li><li> Le cellule sono state incubate con anticorpi contro αSMA (MO851, Dako, 1:100), oppure calponina (M3556, Dako, 1:100) per 1 ora a temperatura ambiente e successivamente trattati come descritto in 3.12) a 3.15). </li></ol>

<ol><li>Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+follicle+dermal+cells+differentiate+into+adipogenic+and+osteogenic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages.</a> Exp. Dermatol. 12, 849(2003).</li>
<li>Watt, F. M., Celso, L. o, C,, Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518(2006).</li>
<li>Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells%3A+turning+over+new+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells: turning over new leaves.</a> Cell. 128, 445(2007).</li>
<li>Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+skin-derived+precursors%3A+from+biology+to+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Vurr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation.</a> Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522(2009).</li>
<li>Toma, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+adult+stem+cells+from+the+dermis+of+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin.</a> Nat. Cell Biol. 3, 778(2001).</li>
<li>Fernandes, K. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dermal+niche+for+multipotent+adult+skin-derived+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells.</a> Nat. Cell Biol. 6, 1082(2004).</li>
<li>Wenzel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%C3%AFve+adult+stem+cells+from+patients+with+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+express+low+levels+of+progerin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Bio.+Open%22%5BJournal%5D)">Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo.</a> Bio. Open. 1, (2012).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25, 402(2001).</li>
<li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skin-derived+precursors+%28SKPs%29+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nature Protocol. 1, 2803(2006).</li>
<li>Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+multipotent+skin-derived+precursors+from+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin.</a> Stem Cells. 23, 727(2005).</li>
<li>Fernandes, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+neurogenic+potential+of+multipotent+skin-derived+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors.</a> Electrophoresis. 201, 32(2006).</li>
<li>Hill, lK. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+vascular+progenitor+cells+capable+of+endothelial+and+smooth+muscle+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function.</a> Exp. Hematol. 38, 246(2010).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Utilizzando il metodo qui descritto, le cellule staminali cutanee naive possono essere isolati da colture di fibroblasti dermici primari. Usando questo approccio, abbiamo recentemente riportato l&#39;isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali adulte provenienti da colture di fibroblasti derivati ​​da pazienti con una sindrome genetica rara, di Hutchinson-Gilford progeria sindrome 7. Come mostrano qui quei precursori cellule esprimono marcatori di cellule staminali sono in grado di auto-rinnovament...

<table><tbody><tr><td>DMEM ad alto contenuto di glucosio</td><td>Invitrogen</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>DMEM a basso contenuto di glucosio</td><td>Invitrogen</td><td>21885-108</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td>Conc. finale: 200 mM</td></tr><tr><td>Penicillina/ Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Conc. finale: 10 mg/ml /10 mg/ml</td></tr><tr><td>soluzione di tripsina (0,25%)</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Miscela di nutrienti (prosciutto)</td><td>Invitrogen</td><td>21765-029</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>BD Biosciences</td><td>4114-TC-01M</td><td>Conc. finale: 40 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>BD Biosciences</td><td>236-EG-200</td><td>Conc. finale: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>PDGFBB</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0043</td><td>Conc. finale: 5 ng/ml</td></tr><tr><td>TGF-b1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9204</td><td>Conc. finale: 2,5 ng/ml</td></tr><tr><td>25 cm2 pallone</td><td>Omnilab</td><td>FALC353109</td><td></td></tr><tr><td>PBS senza CaMg</td><td>Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Roth</td><td>8388.2</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio Vectashield</td><td>Vector Inc.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Minikit</td><td>Qiagen, Valencia, CA</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa omniscript</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix</td><td>BioRad</td><td>172-5201</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290-018</td><td>Conc. finale:1 mg/ml</td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 2. Reagenti e attrezzature specifiche.</td></tr></tbody></table>

naïve adult stem cells isolamento da colture primarie di fibroblasti umani

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Nell&#39;ultimo decennio, diverse popolazioni di cellule staminali adulte sono state identificate in pelle umana 1-4. L&#39;isolamento di precursori multipotenti dermici adulti è stata riportata da F. Miller laboratorio D 5, 6. Questi primi studi hanno descritto una popolazione di cellule precursori multipotenti da adulto derma mammiferi 5. Queste cellule - SKPs denominati, per i precursori della pelle derivate - sono state isolate ed espanse da roditore e la pelle umana e differenziate in progenie sia neurale e mesoderma, compresi i tipi di cellule mai trovati in pelle, come i neuroni 5. Studi immunocitochimiche su SKPs coltura rivelato che le cellule esprimono vimentina e nestina, una proteina filamenti intermedi espressa in precursori neuronali e muscolari scheletriche, oltre a fibronectina e marcatori di cellule staminali multipotenti 6. Fino ad ora, le cellule staminali adulte SKPs di popolazione sono stati isolati da appena raccolti biopsie cutanee dei mammiferi. ve_content &quot;&gt; Recentemente, abbiamo stabilito e riportato che una popolazione di cellule precursori della pelle derivate potrebbe rimanere presente nelle colture di fibroblasti primari stabiliti da biopsie cutanee 7. L&#39;ipotesi che alcune cellule staminali somatiche potrebbero risiedere in colture di fibroblasti primari a raddoppi di popolazione iniziali era compatibili con i seguenti osservazioni: (1) SKPs e colture di fibroblasti primari sono derivate dal derma, e quindi un piccolo numero di cellule SKP potrebbero rimanere presente nelle colture di fibroblasti dermici primari e (2) colture primarie di fibroblasti coltivati ​​da aliquote congelate che sono state sottoposti a temperatura sfavorevole durante la conservazione o il trasferimento conteneva un piccolo numero di cellule vitali che rimanevano 7. Queste cellule rare sono stati in grado di espandere e potrebbero essere diversi passaggi più volte. Questa osservazione suggerisce che un piccolo numero di cellule con elevata potenza proliferazione e resistenza alle sollecitazioni erano presenti in colture di fibroblasti umani 7. Abbiamo approfittato di questi risultati per stabilire un protocollo per il rapido isolamento di cellule staminali adulte provenienti da colture di fibroblasti primari che sono prontamente disponibili presso le banche dei tessuti di tutto il mondo (Figura 1). Questo metodo ha un significato importante in quanto consente l&#39;isolamento di cellule precursori quando i campioni di pelle non sono accessibili mentre colture di fibroblasti possono essere disponibili da parte delle banche dei tessuti, in tal modo, aprendo nuove opportunità per analizzare i meccanismi molecolari alla base di malattie genetiche rare e le malattie di modellazione in un piatto.

Si dimostra che una popolazione di cellule che selettivamente si espandono per generare sfere SKP sotto condizione di una crescita controllata, comprensivi di EGF e FGF2 sono presenti in colture di fibroblasti cutanei primari (figura 1), come abbiamo riportato di recente 7. Colture di fibroblasti da PPD 15 e 25 che in genere corrispondono ai fibroblasti primari ceppi disponibili da banche di cellule sono stati utilizzati in questo studio. Colture di fibroblasti so...

Riportiamo un metodo per isolare precursori pelle-derivato multipotenti (SKP) cellule naïve da colture primarie di fibroblasti umani. Abbiamo dimostrato che queste SKPs derivati ​​da colture di fibroblasti Share proprietà delle cellule staminali a quelle derivate direttamente da biopsie cutanee umane. Queste cellule esprimono il marcatore cresta neurale, nestin, oltre ai marcatori multipotenti quali OCT4 e Nanog.

Naïve Adult Stem Cells isolamento da colture primarie di fibroblasti umani

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule precursori naive multipotenti, derivate dalla pelle, da colture primarie di fibroblasti umani. In primo luogo, si stabilisce una coltura primaria di fibroblasti e si selezionano le cellule precursori naive derivate dalla pelle in base alla resistenza a condizioni di stress come variazioni di temperatura e carenza di nutrienti. Successivamente, si coltivano le cellule in modo da formare sfere in condizioni di crescita controllate, continuando a far crescere ed espandere le colture sferoidali per diverse settimane, dimostrando che queste cellule precursori condividono proprietà simili a quelle delle cellule staminali adulte.In definitiva, le cellule SKP possono essere indotte a differenziarsi in cellule muscolari lisce. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo quando osservai che in OT congelati di strutture di fibroblasti primari sottoposti a stress a causa di variazioni di temperatura durante lo stoccaggio o il trasporto, alcune cellule rimangono in grado di proliferare. Questo suggeriva che un piccolo numero di cellule fosse resistente allo stress e potesse trattarsi di cellule staminali dermiche, dimostrando che la

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Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento e il mantenimento delle colture primarie di fibroblasti della pelle e tessuto polmonare dei roditori selvatici.

Stabilire colture primarie di fibroblasti adulti dai roditori

Un modo rapido, robusto di isolare vitali cellule staminali epiteliali adulte di pelle umana è descritta. Il metodo utilizza la digestione enzimatica della matrice di collagene della pelle, seguita da spiumatura dei follicoli piliferi e l'isolamento delle sospensioni singola cella o frammenti di tessuto per la coltura cellulare.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

Questo articolo presenta un protocollo robusto per l'isolamento e la coltura di cellule staminali neurali cresta di follicoli dei capelli umani.

L&#39;isolamento e la coltura di cellule staminali neurali Crest di follicoli dei capelli umani

Nonostante gli sforzi volti a culture di transizione a feeder liberi condizioni, la derivazione e la cultura di cellule staminali embrionali umane (hESC) rimangono in gran parte dipendente dal co-colture con alimentatori embrionali di topo (MEF). Qui vi mostriamo una nuova metodologia per la rapida rimozione di alimentatori da culture hESC prima della sperimentazione.

Fibroblast rimozione veloce da alta densità Culture staminali embrionali umane

Questo video mostra una tecnica per isolare le cellule progenitrici neurali indotte (iNPC) derivate da fibroblasti umani adulti. Delinea le fasi dell'isolamento delle colonie di iNPC e della loro coltura in pozzetti a piastre multipozzetto rivestiti di laminina in presenza di terreni di coltura adeguati che facilitano la continua proliferazione ed espansione della popolazione di iNPC.

Isolamento di colonie di cellule progenitrici neurali indotte derivate da fibroblasti umani adulti

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte fornisce prospettive affascinanti per la derivazione di trapianto autologo. Tuttavia, la progressione attraverso uno stato pluripotente e laborioso ri-differenziazione impedisce ancora di traduzione clinica. Qui si descrive la derivazione di fibroblasti umani adulti e la loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali indotte e la successiva differenziazione in linee neurali.

Derivazione di adulti fibroblasti umani e la loro conversione diretta in celle espandibile progenitrici neurali

Il comportamento dei fibroblasti è alla base di uno spettro di entità cliniche, ma rimangono scarsamente caratterizzate, in gran parte a causa della loro intrinseca eterogeneità. La ricerca tradizionale sui fibroblasti si basa sulla manipolazione in vitro, mascherando il comportamento dei fibroblasti in vivo. Descriviamo un protocollo basato su FACS per l'isolamento di fibroblasti cutanei di topo che non richiede colture cellulari.

Murino Dermal fibroblasti Isolation di FACS

Una robusta derivazione di cellule pluripotenti indotte da humano (hiPS) è stata ottenuta utilizzando riprogrammazione mediata dei fibroblasti dermici da virus Sendai (SeV) non integrante. La manutenzione delle cellule hiPS e l'espansione clonale sono state eseguite usando condizioni di coltura xeno-free e chimicamente definite con matrice umana laminina 521 (LN-521) e Essential E8 (E8) Medium ricombinante.

Derivazione libera dell&#39;integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall&#39;uomo usando la matrice Laminina 521

Qui descriviamo un metodo clinicamente rilevante, ad alta efficienza e privo di alimentatore per riprogrammare i fibroblasti primari umani in cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando modificate mRNA che codificano per fattori di riprogrammazione e maturo microRNA-367/302 imita. Sono inoltre inclusi metodi per valutare l'efficienza di riprogrammazione, espandere le colonie clonali iPSC e confermare l'espressione del marcatore pluripotenza TRA-1-60.

RNA-ha basato riprogrammazione dei fibroblasti primari umani in cellule staminali pluripotenti indotte

Presentiamo un protocollo per isolare i fibroblasti adulti primari in modo semplice, veloce e affidabile, performabile dai principianti (ad esempio, gli studenti). La procedura combina la digestione del tessuto enzimatico e l'agitazione meccanica con onde ultrasoniche per ottenere fibroblasti primari. Il protocollo può essere facilmente adattato a specifiche esigenze sperimentali (ad esempio, tessuto umano).

Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni

La riprogrammazione cellulare richiede l'introduzione di geni chiave, che regolano e mantengono lo stato cellulare pluripotente. Il protocollo descritto consente la formazione di colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da fibroblasti dermici umani senza metodi virali/integranti, ma utilizzando RNA non modificati (NM-RNA) combinati con fattori di evasione immunitaria che riducono i meccanismi di difesa cellulare.

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Impara a isolare cellule staminali SKP naive da colture primarie di fibroblasti umani. Questo metodo sfrutta la resistenza allo stress per selezionare precursori multipotenti utili per la medicina rigenerativa.

Naïve Adult Stem Cells isolamento da colture primarie di fibroblasti umani

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