Introduzione alla centrifuga

La centrifuga è uno strumento utilizzato in quasi ogni laboratorio di ricerca biomedica in tutto il mondo.

La centrifugazione è un processo mediante il quale si utilizza una centrifuga per separare i componenti di una miscela complessa.

Facendo ruotare i campioni di laboratorio a velocità molto elevate, i componenti di una determinata miscela vengono sottoposti a una forza centrifuga, che provoca lo spostamento delle particelle più dense lontano dall'asse di rotazione e di quelle più leggere verso di esso. Queste particelle possono sedimentare sul fondo del tubo formando ciò che è noto come un pellet, e questo campione isolato, oppure la soluzione rimanente, chiamata sopranatante, può essere ulteriormente processato o analizzato.

Il componente principale di una centrifuga è il rotore, che è la parte mobile che ruota a elevate velocità.

I rotori possono essere fissati in posizione oppure una centrifuga può utilizzare più rotori montati su una parte chiamata albero.

Di solito, il rotore della centrifuga è dotato di un coperchio che viene avvitato saldamente per impedire che i campioni fuoriescano.

Molte centrifughe sono dotate di un'unità di refrigerazione che consente di controllare la temperatura interna durante la centrifugazione.

Dispongono inoltre di manopole o pulsanti per impostare i parametri di ogni run, che possono includere la durata della centrifugazione, la temperatura e l'intensità della rotazione in termini di velocità o forza relativa.

La velocità di rotazione è misurata in giri al minuto (RPM). Il valore RPM è problematico, poiché non è la velocità della centrifuga a causare la separazione delle particelle da una miscela, bensì la forza che agisce su tali particelle.

La forza che agisce su una particella è correlata al raggio del rotore della centrifuga e, poiché centrifughe diverse hanno rotori di dimensioni diverse, forze differenti possono essere applicate alla stessa velocità, ovvero allo stesso valore di RPM.

L'intensità della centrifugazione può essere quantificata anche come forza centrifuga relativa (RCF). L'RCF è generalmente espressa come multiplo dell'accelerazione gravitazionale terrestre.

L'RCF è espressa come prodotto del raggio del rotore per il quadrato della velocità angolare, diviso per l'accelerazione gravitazionale terrestre.

L'RCF può essere correlata all'RPM mediante la seguente equazione, in cui r indica il raggio della centrifuga misurato in centimetri.

L'utilizzo di questa equazione può fare la differenza tra un esperimento fallito e uno riuscito, ma non è necessario applicare questo calcolo per ogni nuova procedura. Le centrifughe sono spesso dotate di nomogrammi che consentono di convertire facilmente l'RCF in RPM. Utilizzare un righello per collegare il raggio della centrifuga a un determinato valore di RPM, al fine di ottenere l'RCF.

Per iniziare a centrifugare i campioni, considera la temperatura. Se stai utilizzando una centrifuga refrigerata, assicurati che la temperatura interna della macchina raggiunga il valore desiderato prima di avviare la centrifugazione, oppure puoi trovare altri modi per raffreddare il rotore.

Immediatamente prima della centrifugazione, verifica che tutti i tappi dei tuoi tubi siano ben chiusi e sicuri.

Quando carichi i tubi, assicurati che ogni campione sia bilanciato da un altro campione posizionato esattamente opposto.

Se hai un solo tubo, prepara un altro tubo che possa fungere da contrappeso.

Se hai tre tubi, puoi disporli a triangolo in modo che siano equidistanti tra loro.

La bilanciatura dei pesi nella centrifuga è fondamentale. I rotori delle centrifughe raggiungono alte velocità e possiedono una grande quantità di energia cinetica. Se non sono bilanciati correttamente, l'intera unità della centrifuga potrebbe essere spostata dalla sua posizione e causare danni seri.

Dopo aver verificato che il rotore e il coperchio siano ben chiusi, avvia la centrifuga e rimani nei pressi fino a quando non avrà raggiunto la velocità desiderata. Se noti un problema, chiama un membro esperto del laboratorio per chiedere aiuto.

Al termine della centrifugazione, dovresti essere in grado di vedere il tuo campione biologico sul fondo del tubo sotto forma di un pellet, separato dal resto della soluzione, chiamata supernatante.

Il supernatante può essere rimosso versandolo delicatamente – un termine elegante per indicare il travaso – oppure può essere aspirato – un termine tecnico per indicare la rimozione mediante aspirazione.

Il campione purificato può quindi essere riportato in soluzione attraverso un processo chiamato risospensione. Le ripetute operazioni di centrifugazione, o di rotazione delle cellule, seguite dall'aspirazione delle cellule e dalla risospensione in tampone, sono spesso indicate come lavaggio delle cellule.

Ora che hai visto alcune nozioni di base della centrifugazione, è il momento di esaminare alcuni dei tipi di centrifughe disponibili e le procedure che puoi eseguire con esse.

Le centrifughe con rotore a angolo fisso sono probabilmente il tipo più comune di questo strumento che incontrerai in laboratorio. Molte centrifughe da banco rientrano in questa categoria.

Queste centrifughe, in cui i tubi sono posizionati in una sede fissa e inclinata, vengono utilizzate nei protocolli di centrifugazione differenziale. In tali protocolli, una serie di centrifugazioni a diverse velocità può essere impiegata per purificare campioni biologici come cellule animali. In genere, questi protocolli prevedono diversi passaggi di lavaggio delle cellule.

A differenza dei rotor a angolo fisso, i rotor a cestello oscillante dispongono di portacampioni flessibili che permettono ai campioni di ruotare verso l’esterno. Questi rotor risultano vantaggiosi in applicazioni come la centrifugazione su gradiente di densità, in cui i campioni biologici migrano in strati distinti del mezzo a gradiente. Questo tipo di centrifugazione è utile per isolare rapidamente un tipo cellulare da un altro, oppure per isolare singoli organelli.

Infine, l'ultracentrifuga è la versione più potente di tutte le centrifughe presenti in laboratorio. Può raggiungere velocità superiori a 70.000 giri al minuto, risultando quindi particolarmente adatta all'isolamento di particelle piccole, come il DNA o i virus.

A causa delle elevate velocità raggiunte da questa centrifuga, è necessario prestare particolare attenzione per assicurare un bilanciamento corretto dei carichi e verificare che sia il rotore sia il coperchio siano ben fissati.

Avete appena guardato l'introduzione di JoVE alla centrifugazione. In questo video abbiamo esaminato: cos'è una centrifuga e come funziona, come utilizzare ed eseguire una centrifuga, alcune precauzioni di sicurezza e diverse applicazioni della centrifugazione. Grazie per aver guardato e ricordatevi di bilanciare sempre i vostri tubi.