Isolamento e la differenziazione di cellule stromali vascolari alle celle Beige / Brite

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare gli adipociti primari e indurre la loro differenziazione in coltura in cellule beige o luminose. Il primo passo è sezionare il tessuto adiposo dai topi. Successivamente, il tessuto viene digerito con collagenasi.

Una volta isolata la frazione vascolare dello stroma, le cellule vengono piastre. Il passaggio finale consiste nell'indurre la differenziazione delle cellule in cellule beige o luminose. In definitiva, vengono utilizzati metodi analitici per mostrare un aumento dell'espressione di geni specifici dell'adipocita bruna.

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nei tessuti adiposi bruni, che è il meccanismo molecolare che regola lo sviluppo di cellule luminose o essere. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al trattamento dell'obesità e di altre malattie legate allo stile di vita. Poiché la manipolazione del tessuto adiposo bruno nell'uomo può essere utilizzata come potenziale intervento terapeutico, il primo passo è preparare il mezzo di digestione.

Quindi, dopo l'eutanasia, il tessuto adiposo viene rimosso. Per prima cosa, isola il tessuto adiposo bruno interscapolare o pipistrello tagliando lungo la schiena dell'animale fino al collo. Due lobi di tessuto adiposo bruno si trovano proprio sotto la pelle tra le spalle.

Quindi, rimuovi con cura il sottile strato di grasso bianco che copre il pipistrello. Una volta isolato, posizionare il tessuto direttamente in PBS pulito. Il tessuto adiposo bianco inguinale o wat si trova direttamente sotto la pelle su entrambi i lati.

Si estende all'interno delle cosce e scende verso i testicoli. Rimuovere il fazzoletto e metterlo in PBS pulito. I seguenti passaggi vengono applicati sia al pipistrello che ai campioni umidi.

Rimuove rapidamente tutte le contaminazioni come capelli, muscoli scheletrici e tessuto connettivo dalle sezioni di tessuto. Successivamente, asciugare rapidamente il fazzoletto su un tovagliolo di carta per evitare la diluizione del terreno di dissezione con PBS e posizionarlo su una piastra asciutta. Aggiungere il mezzo di digestione e tritare il fazzoletto in piccoli pezzi.

Successivamente, trasferisci il tessuto in una provetta da 50 millilitri contenente il resto del mezzo di digestione. Posizionare la provetta in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con agitazione costante per 40-50 minuti per digerire. Controllare ogni 10-15 minuti per assicurarsi che la digestione stia andando bene e per prevenire una digestione eccessiva.

Dopo che il tessuto è ben digerito, interrompi la digestione. Aggiungendo cinque millilitri di terreno completo e mescolando bene, le cellule dovrebbero essere quasi completamente omogenee. Quindi, centrifugare il campione a 700 volte G per 10 minuti.

La frazione vascolare stromale dovrebbe ora essere visibile come una pallina brunastra sul fondo del tubo, aspirare lo strato di adipociti maturi oleosi sulla parte superiore e la maggior parte dello strato liquido. Quindi, sciogliere il pellet in 10 millilitri, completare il terreno e mescolare bene. Una volta miscelato, posizionare un colino cellulare su una nuova provetta da 50 millilitri e filtrare la sospensione cellulare.

Trasferire la sospensione cellulare filtrata in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 700 volte G per 10 minuti. Quindi, aspirare il fluido e risospendere il pellet. In 10 millilitri di terreno completo pipettare e mescolare bene, piastrare, le cellule secondo necessità.

Generalmente, cinque topi produrranno due piastre da 10 centimetri di wat inguinale e una piastra di pipistrello. Una o due ore dopo la placcatura. Aspirare due volte il lavaggio medio con PBS e aggiungere il terreno fresco.

Questo passaggio è importante in quanto può rimuovere i globuli rossi, le cellule immunitarie e altri contaminanti. I mezzi di manutenzione e induzione vengono preparati in anticipo. Una volta che gli adipociti primari sono cresciuti fino al 95-97% di confluenza, sostituire il normale terreno completo con il mezzo di induzione.

Dopo 48 ore, sostituire il terreno con un terreno di mantenimento contenente 0,5 micromolari di glitazone RO. Dopo altre 48 ore, passare a un terreno di mantenimento nuovo contenente un micromolare di glitazone RO per altri due o tre giorni. Le goccioline appariranno circa tre o quattro giorni dopo l'induzione, come si vede qui da sei a sette giorni dopo la prima aggiunta del mezzo di induzione.

Le cellule devono essere completamente differenziate in cellule adipose mature e devono essere riempite con goccioline d'olio. Le cellule possono ora essere raccolte e utilizzate per ulteriori analisi. L'imbrunimento degli adipociti primari può essere valutato misurando l'mRNA di geni specifici o selettivi del grasso bruno mediante Q-R-T-P-C-R come si vede qui.

RO glitazone, UCP ha indotto in modo robusto un trattamento con FORSKOLINA di espressione dell'mRNA designato qui come MP A ciclico. Ulteriormente aumentata l'espressione di UCP indotta da RO glitazone uno. Cdia. Anche un altro gene selettivo del grasso bruno è stato aumentato in modo dose-dipendente. Il trattamento con glitazone RO ha anche aumentato l'espressione di FABP 4 e del marcatore adipogenico sia per il grasso bruno che per quello bianco.

Questo effetto di imbrunimento non era semplicemente dovuto a un aumento dell'adipogenesi di per sé. Poiché l'induzione di UCP 1 e l'espressione di CDIA erano ancora significative, anche se i livelli di mRNA erano normalizzati a quelli di FABP four, questo Western blot conferma l'aumento del livello proteico di UCP 1. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i preadipociti e come differenziare queste cellule in cellule beige o luminose in coltura.