Name: Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Impara la microscopia video a cellule vive per studiare la fagocitosi di Candida albicans da parte dei macrofagi. Questo metodo consente l'analisi in tempo reale delle fasi di migrazione, riconoscimento e maturazione del fagosoma.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LPE è una scozzese Senior Fellow clinica e riconosce il sostegno dell&#39;Ufficio Chief Scientist (SCD/03). Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust Progetto Sovvenzione LPE (089.930). NARG è stato finanziato da un programma Wellcome Trust Grant (080.088) e la sovvenzione di attrezzature (075.470) (per DeltaVision), e da un FP7-2007-2013 Grant (HEALTH-F2-2010-260338-Allfun). Vorremmo ringraziare l&#39;Università di Aberdeen impianto di imaging, in particolare Kevin MacKenzie, per il supporto e consigli utili.

1. C. albicans crescita e Condizioni <ol><li> Preparare SC-Ura piastre di agar con l&#39;aggiunta di 6,9 g di base di lievito senza amminoacidi azoto, 1 ml di NaOH 1 M, 10 ml 1% (w / v) di sale hemisulphate adenina e 20 g di agar tecnica (precedentemente descritto in 11). Portare a volume di 900 ml con acqua distillata H 2 O. Autoclave, lasciare raffreddare agar, ma non abbastanza per solidificare, e quindi si aggiungono 50 ml di soluzione salina al 40% di D-glucosio e 50 ml sterile 4% SC-Ura dropout in condizioni asettiche. Mescolare, versare in piastre di Petri e lasciare piastre di agar raffreddare e solidificare. Piastre di agar Conservare a 5 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Streak C. albicans sierotipo A ceppo CAI4 + CIp10 dalle scorte glicerolo conservati a -80 ° C su SC-Ura piastra di agar. </li><li> Incubare la piastra a 30 ° C fino a formare colonie e conservare a 5 ° C. </li><li> Cultura un singolo C. albicans colonia in 5 ml SC-Ura medio (ricetta come in 1.1, ma senza agar tecnico) e incubare una notte a 30° C, 200 rpm per generare fase stazionaria C. albicans. </li></ol> 2. C. albicans colorazione Uso isotiocianato di fluoresceina (FITC) <ol><li> Aggiungere 10 microlitri C. cultura albicans overnight a 990 microlitri di PBS (pH 7,4) ed eseguire una conta cellulare utilizzando un emocitometro. </li><li> Per facilitare la visualizzazione di C. albicans durante saggi di fagocitosi, macchia 1 × 10 8 C. albicans usando 1 mg / ml FITC in 0,05 M tampone carbonato-bicarbonato (pH 9,6) per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Per rimuovere FITC non legato, lavare C. albicans in 1 ml 1 x PBS, centrifugare a 3000 xg per 5 min, rimuovere surnatante e risospendere pellet in 1 ml 1 x PBS. Ripetere 3 volte. </li><li> Risospendere pellet a 1 x 10 6 cellule / mL in 1 x PBS. </li></ol> 3. Preparazione della linea cellulare di macrofagi J774.1 mouse <ol><li> Mantenere J774.1 macrofagi nel 75 cm 2 tessutobeute di coltura in DMEM supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino (FCS), 200 U / ml di penicillina / streptomicina e 2 mM L-glutammina a 37 ° C con 5% di CO 2. La preparazione di macrofagi primari è descritto altrove in dettaglio 12, 13. </li><li> Raschiare J774.1 cellule dal pallone di coltura tissutale e trasferire in una provetta da 50 ml Falcon. Centrifugare a 600 g per 5 min per ottenere un pellet di cellule. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 10 ml di pre-riscaldato terreno DMEM integrato. Contare le celle utilizzando un emocitometro e la piastra 1 × 10 6 J774.1 macrofagi in 2 ml di terreno DMEM integrato in un 35 mm vetro piatto a base di imaging. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Prima di imaging, sostituire DMEM integrato con 2 ml di pre-riscaldato integrato CO 2-media indipendenti (con 10% (v / v) di siero fetale bovino (FCS), 200 U / ml di penicillina / streptomicina e 2 mM L-glutammina) contenente 1 mM LysoTracker Red ND-99.</li></ol> 4. Cella in diretta Video Microscopia Assay fagocitosi <ol><li> La scelta del microscopio dipenderà ciò che è disponibile localmente, ma la configurazione microscopio dovrà prevedere una fase invertita, una camera ambientale riscaldata a 37 ° C e di eccitazione / emissione filtri per le macchie scelti (FITC e TRITC). </li><li> Acceso il riscaldamento microscopio prima dell&#39;esperimento e consentire un tempo sufficiente per la camera di controllo ambientale riscaldare a 37 ° C. Il tempo impiegato per la temperatura della camera di stabilizzare varia per diverse configurazioni microscopio. </li><li> Accendere il microscopio e il computer, e caricare il software di imaging. Montare il piatto di imaging sul palco microscopio e regolare la messa a fuoco per trovare le J774.1 macrofagi. Ottimizzare l&#39;aspetto delle immagini TRITC e DIC regolando la percentuale di luce trasmessa e tempi di esposizione. </li><li> Rimuovere il piatto di imaging e aggiungere 3 × 10 6 FITC-tinto C. albicans a tlui servire. Registrare il tempo che C. albicans è aggiunto al piatto. Ritorna il piatto sul palco e ottimizzare l&#39;aspetto delle immagini FITC, se necessario. Impostare un elenco punti se necessario. </li><li> Iniziare immagini quando tutti i punti sono a fuoco e i canali sono ottimizzati. Cattura FITC, immagini e TRITC DIC ogni minuto per 6 ore. </li></ol>

<ol><li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li>
<li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li>
<li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li>
<li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li>
<li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li>
<li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578(2012).</li>
<li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen%2C+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , In Press (2012).</li>
<li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lytic+expulsion%2Fexocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li>
<li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li>
<li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li>
<li>Erwig, L. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+%28ERM%29+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare. NG è un destinatario di sovvenzioni senza restrizioni per la ricerca di base da Gilead Sciences. LE lavora come consulente per GSK nello sviluppo di farmaci iniziale.

Qui il metodo per l&#39;utilizzo di live-cell video microscopia a studiare fagocitosi dei macrofagi è descritto. Microscopia video offre molteplici livelli di informazioni per l&#39;analisi. Un vantaggio fondamentale è che i dati di assorbimento può essere generato (da un singolo esperimento) per ogni punto temporale durante tutto il periodo di osservazione 6 ore. Ancora più importante, il metodo descritto consente analisi differenziale delle singole fasi di fagocitosi. Abbiamo, per esempio, mostrato che le variazioni assorbimento complessivo di C. glicosilazione albicans e mutanti morfogenesi da linee cellulari macrofagiche e macrofagi primari può essere una conseguenza di cambiamenti nella migrazione dei macrofagi verso cellule bersaglio o tasso di immersione una volta contatto cellula-cellula è stabilito 7. Ci sono una serie di trappole da evitare lo svolgimento questi esperimenti. Primo, è molto importante assicurare condizioni ambientali stabili durante la procedura sperimentaleDure. Ciò si ottiene in una camera ambientale che viene impostato alle condizioni sperimentali diverse ore prima di iniziare l&#39;esperimento. La qualità video è altamente dipendente sofisticati moduli che utilizzano laser a infrarossi per mantenere automaticamente il campione z-posizione indipendentemente cambiamenti meccanici o termici eliminando così la necessità di correzioni fuoco manuale. Data la natura estesa degli esperimenti, è importante limitare l&#39;esposizione della luce laser e associati effetti photobleaching e fotoconversione, che può essere minimizzata utilizzando marcatori altamente fluorescenti, che facilitano i tempi di esposizione. Il protocollo di colorazione FITC qui descritto è veloce e affidabile. Come FITC è molto luminoso e stabile macchia, tempi di esposizione bassi sono necessari e questo rende ideale FITC per lunghi filmati time-lapse. Tuttavia, abbiamo abitualmente utilizzano una varietà di macchie bersaglio diverse, comprese Calcofluoro bianco e coloranti PKH nonché organismi etichetta. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La maggior parte del nostro lavoro pubblicato è condotta utilizzando un ampio campo ottico, ma l&#39;esposizione può essere ulteriormente ridotta utilizzando un microscopio confocale disco che gira nelle nostre mani e questo è essenziale per la microscopia time-lapse video 3D. Durante questo studio, le immagini sono state catturate ad intervalli di 1 minuto per un saggio di fagocitosi 6 ore. L&#39;intervallo tra le immagini può essere regolata a seconda del processo in esame. Per esempio, l&#39;intervallo può essere diminuita quando indagando rapidi processi quali il traffico vescicolare. L&#39;intervallo di tempo minimo sarà limitato dalle specifiche microscopio e della fotocamera. Ci sono alcune considerazioni da tenere a mente durante la regolazione delle temporizzazioni. In primo luogo, riducendo l&#39;intervallo tra le istantanee significa meno punti possono essere esposte e la dimensione del file crescerà considerevolmente. Al contrario, aumentando l&#39;intervallo di immagine troppo farà il film perde continuità. Questo approccio può essere applicatoin linea di principio per studiare altri agenti patogeni e l&#39;assorbimento di morire cellule ospiti. Per esempio, abbiamo recentemente dimostrato che i macrofagi di midollo osseo derivate da sialoadhesin-carente topo esibiscono notevolmente ridotto vincolante e fagocitosi di sialylated Campylobacter jejuni 8. Tuttavia, le dimensioni di destinazione è un fattore determinante per la fattibilità, come analisi di immagine diventa sempre più difficile con una riduzione delle dimensioni delle cellule bersaglio. Sofisticato software di analisi delle immagini è essenziale per l&#39;analisi rapida microscopia video, e questo dovrebbe essere accompagnato da un adeguato sostegno bioinformatica per facilitare la generazione di algoritmi per studiare la migrazione delle cellule singole e popolazioni di cellule intere 7. Live-cell video microscopia in combinazione con software sofisticati di analisi di immagine per il minuto per minuto l&#39;analisi della migrazione e dei singoli macrofagi-C.albicans interazioni, fornisce una visione unica della complessità di C. fagocitosi albicans da macrophages. C&#39;è un enorme potenziale di espandere questi metodi per studiare altri patogeni e fagociti (cellule dendritiche, i neutrofili) e di sviluppare microscopia video 3D a immagini interazioni cellula-cellula in modo più approfondito o su più superfici fisiologiche come strati di cellule epiteliali ed endoteliali. Questa tecnica fa parte della nuova generazione di strumenti per lo studio di interazioni ospite-patogeno e contribuirà a generare dettagliate informazioni spaziali e temporali su una vasta gamma di processi dinamici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Lievito base di azoto senza amminoacidi </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> Hemisulphate sale Adenina </td><td> Sigma </td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td> Agar tecnico (n. 3) </td><td> Oxoid </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> Sigma </td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-Ura dropout </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> Sigma </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> Carbonato di sodio </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> Bicarbonato di sodio </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Life Technologies </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Lonza </td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> LysoTracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35 millimetri di vetro piatti </td><td> PAA </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-cellula microscopia video di funghi patogeni fagocitosi

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Liquidazione fagocitaria dei patogeni fungini e microrganismi più in generale, può essere considerato costituito da quattro fasi distinte: (i) la migrazione dei fagociti al sito in cui si trovano i patogeni; (ii) riconoscimento di pattern molecolari associati al patogeno (PAMPs) tramite modello recettori di riconoscimento (PRR), (iii) immersione di microrganismi legati alla membrana cellulare dei fagociti, e (iv) il trattamento delle cellule inghiottito all&#39;interno fagosomi maturazione e la digestione della particella ingerito. Studi che valutano la fagocitosi in toto sono informativi 1, 2, 3, 4, 5, ma sono limitati nel senso che normalmente non rompere il processo di migrazione in giù, immersione e maturazione phagosome, che può essere pregiudicato differenziale. Inoltre, tali studi valutare assorbimento come un singolo evento, piuttosto che come un processo continuo dinamico. Abbiamo recentemente sviluppato avanzate dal vivo di cellule tecnologie di imaging, e hanno unito questi con genetico analisi funzionale di entrambicellule del patogeno e host per creare una piattaforma interdisciplinare per l&#39;analisi della funzione delle cellule immunitarie innate e patogenesi fungina. Questi studi hanno rivelato nuovi aspetti della fagocitosi, che potevano essere osservati con sistematica analisi temporale delle interazioni molecolari e cellulari tra i fagociti umani e agenti patogeni fungini e microrganismi infettivi più in generale. Per esempio, abbiamo cominciato a definire la seguente: (a) i componenti della superficie cellulare per ogni fase del processo di riconoscimento, immersione e l&#39;uccisione delle cellule fungine 1, 6, 7, 8, (b) come geometria della superficie influenza l&#39;efficienza di assorbimento macrofagi e uccisione di lievito e cellule ifali 7, e (c) come engulfment conduce ad alterazioni del ciclo cellulare e il comportamento di macrofagi 9, 10. In contrasto istantanee singole punto temporale, live-cell video microscopia permette un&#39;ampia varietà di cellule ospiti e patogeni da studiare come cosequenze continua che in periodi di tempo lunghi, fornendo informazioni spaziali e temporali su una vasta gamma di processi dinamici, tra cui la migrazione cellulare, la replica e il traffico vescicolare. Qui si descrive in dettaglio come preparare host e cellule fungine, e per eseguire l&#39;esperimento di video microscopia. Questi metodi possono fornire ad un utente-guida per gli studi futuri con altri fagociti e microrganismi.

Qui vi mostriamo i risultati rappresentativi per C. assorbimento albicans da una linea cellulare murina di macrofago J774.1 durante un live-6 hr cella esperimento di video microscopia. Figura 1 è un rappresentante live-cell film microscopia video, che mostra la fagocitosi di C. albicans di macrofagi murini J774.1. Live-cell microscopia video consente interiorizzazione di C. albicans da visualizzare senza la necessità di macchiare Candida esterno. Tuttavia, durante questi esperimenti, C. albicans è stato colorato con il colorante sensibile al pH FITC (verde), che viene spenta durante acidificazione dei fagosomi macrofagi, e facilita la conferma che Candida è stata internalizzata (Figura 1). Per la visualizzazione di un ulteriore aiuto ingerito C. albicans, macrofagi sono state colorate con il colorante fluorescente rosso LysoTracker rosso DND-99, che scomparti macchie acide e serve come non specifico marcatore di maturazione phagosome.La figura 2 è un fermo immagine dal vivo a cellule esperimento di video microscopia e illustra la variazione del numero di C. albicans ingerito dalle singole J774.1 macrofagi. In questo esperimento, l&#39;82% dei macrofagi J774.1 inghiottito almeno un C. cella albicans alla fine del saggio fagocitosi 6 ore. In figura 3, il numero di internalizzato C. cellule albicans per macrofagi viene segnalato. Il numero medio di C. albicans assunte per macrofagi è 3.4, ma è interessante notare i macrofagi possono ingerire fino a 16 cellule fungine. figura 4 è una sequenza di immagini fisse da un rappresentante in tempo reale delle cellule esperimento di video microscopia che mostra un macrofago phagocytosing C. cellule albicans, crescita ifa con il macrofago e lisi infine macrofagi. Figura 4 illustra che videomicroscopia consente l&#39;analisi dei seguenti eventi engulfment di cellule bersaglio, cioè dati può essere generato per il killing dei macrofagi da C. albicans ife in relazione al numero e morfogenesi di cellule bersaglio ingeriti, e come uccisione macrofagi riguarda maturazione phagosome che può essere studiata in tempo reale. Figura 1. Live-cell film microscopia video che mostra la fagocitosi di C. albicans di macrofagi murini J774.1. I macrofagi sono colorati con il rosso colorante fluorescente LysoTracker rosso ND-99, e C. albicans sono colorati con FITC (verde). Macrofagi e C. albicans sono state co-coltivate per un periodo di 6 ore a 37 ° C in completa CO 2-media indipendenti. Le immagini sono state catturate a intervalli di 1 min per 6 ore. Macrofagi può essere visto istituisce contatto cellula-cellula con C. albicans, che è seguito da assorbimento di C. albicans in fagosomi macrofagi. Le frecce indicano C. albicans prima immersione da J774.1 macrofagi. Questo video mostra anche che la fluorescenza FITC è QuEnched immersione seguito di C. albicans. Barra della scala, 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">Clicca qui per visualizzare filmati</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentativa live-cella video microscopia fermo immagine che mostra variazioni nel numero di C.albicans fagocitati dai macrofagi singoli. I macrofagi (tinto con LysoTracker rosso ND-99) sono stati co-coltura con FITC-tinto C. albicans (verde). C&#39;è una variazione nel numero di C. inghiottito albicans (un numero accanto a una freccia indica il numero di C. albicans inghiottito), in C. albicans morfologia (cioè versi lievito ifa). Scala bar, 20 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> Figura 3. Grafico mostra il numero di C. albicans ingerito per J774.1 macrofago murino alla fine del test di fagocitosi 6 ore. I dati rappresentano due esperimenti indipendenti. Un totale di 100 macrofagi sono stati contati da 3 campi di ogni esperimento, per un totale di 600 macrofagi individuali. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> Figura 4. Una serie di immagini da un rappresentante live-cell esperimento di video microscopia mostra un macrofago (M) e C. albicans (C), prima e durante il riconoscimento (A, B), e durante e dopo l&#39;assorbimento (C, D). C. albicans ife continuano a crescere nel macrofago (E, F), che può provocare la lisi dei macrofagi (G). Macrofagi altri vengono reclutati al sito di rottura e tentare di ingerire il rilascio C. albicans (H). I macrofagi sono colorati con il rosso colorante fluorescente LysoTracker rosso DND-99, e C. albicans sono colorati con FITC (verde). Si noti che la colorazione FITC si spegne seguendo C. assorbimento albicans da J774.1 macrofagi (C). Scala bar, 10 micron.

Si descrivono i metodi per il live-cell microscopia video<em&gt; Candida albicans</emFagocitosi&gt; da parte dei macrofagi. Questi metodi consentono stadio-specifica analisi di migrazione di macrofagi, il riconoscimento, immersione e la maturazione phagosome e rivelare nuovi aspetti della fagocitosi.

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire un esperimento di videoscopia su cellule vive per studiare la fagocitosi del patogeno fungino umano candida albicans. Ciò si ottiene con la prima coltura nella candida albicans durante la notte, in modo che entrino nella loro fase stazionaria. Il passo successivo consiste nell'impiattare J 7 74 macrofagi in piastre di imaging con fondo di vetro da 35 millimetri e coltivarli durante la notte.Il giorno successivo, la candida albicans viene colorata con Zi sensibile al pH e gli organelli acidi dei macrofagi vengono colorati con il rosso tracker del liso. Il passo finale consiste nel realizzare un video del test di fagocitosi in cui i macrofagi J 7 7 4 vengono coltivati con la candida albicans. In definitiva, il video risultante può mostrare l'analisi della fase Pacifico del riconoscimento della migrazione dei macrofagi, dell'inghiottimento e della maturazione della zona FGA.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunocitochimica, è che la microscopia video dal vivo può essere utilizzata per scomporre le differenze osservate in singole fasi, come la migrazione, l'inghiottimento e la maturazione dei fagosomi, che possono essere influenzate. In modo differenziale, anche se questo metodo può fornire informazioni sulla fagocitosi del Canada Acan. Può essere applicato anche ad altri sistemi come altri agenti patogeni, fagociti, comprese le cellule dendritiche e i neutrofili.Questa coltura richiede una preparazione avanzata di piastre di agar SC meno U. Possono essere conservati in frigorifero, iniziando con il sierotipo di candida albican, un ceppo CI quattro più CLP 10 da ceppi di glicerolo conservati a meno 80 gradi Celsius su una piastra di agar SC U. Incubare la piastra a 30 gradi Celsius fino a quando le colonie si formano in genere 48 ore.A questo punto, la piastra può essere conservata a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso. Ora scegli una singola colonia e coltivala in cinque millilitri, SCU o media durante la notte a 30 gradi Celsius su un bilanciere impostato a 200 giri/min. Questo genererà la candida albicans in fase stazionaria.Aggiungere 10 microlitri di coltura notturna di candida albicans a 990 microlitri di PBS a pH 7,4 ed eseguire una conta cellulare utilizzando un emocitometro per visualizzare la candida albicans durante i saggi di fagocitosi colorare 100 milioni di candida usando Zi per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Successivamente, rimuovere il fitzy non legato lavando la candida albicans tre volte in PBS per lavare centrifugare la candida a 3000 volte G per cinque minuti. Rimuovere il supporto e risospendere il pellet in un millilitro di PBS Reese.Sospendere il pellet finale in PBS a una concentrazione di 1 milione di celle per microlitro. Per questo protocollo, ho preparato una coltura di macrofagi J 7 7 4 0,1 in fiasche di coltura di tessuto quadrato da 75 centimetri in DMEM integrato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica dal pallone. Rottamare i macrofagi e trasferirli in una provetta Falcon Centrif da 50 millilitri.Utilizzare i macrofagi a 600 volte G per cinque minuti per ottenere un palato cellulare. Rimuovere il supinato e risospendere il pallino in 10 millilitri di DM dmm integrato anteguerra. Ora contate le cellule utilizzando un emocitometro e piastrate 1 milione di cellule in una piastra di imaging a base di vetro da 35 millimetri con due millilitri di terreno DMM integrato.Incubare la capsula per una notte a 37 gradi Celsius e con il 5% di anidride carbonica il giorno successivo. Prima dell'imaging, sostituire il terreno DMM integrato con due millilitri di terreno indipendente dall'anidride carbonica preriscaldato contenente un micromolare di Liso tracker red DND 99 e gli stessi integratori del dmm. La configurazione del microscopio deve includere uno stadio invertito e una camera ambientale riscaldata a 37 gradi Celsius e filtri di emissione di eccitazione per le colorazioni scelte fitzy e trixy.In questo esempio, viene utilizzato un core di visione delta di precisione applicato. Per prima cosa accendi il riscaldatore del microscopio in modo che la camera di controllo sia calda a 37 gradi Celsius. Quindi accendere il microscopio e il computer e caricare il software di imaging, montare la piastra di imaging sul tavolino del microscopio e regolare la messa a fuoco per trovare i macrofagi J 7 74 0.1.Ottimizza l'aspetto delle immagini trixi e DIC regolando la percentuale di luce trasmessa e i tempi di esposizione. Rimuovere la piastra di imaging e aggiungere 3 milioni di candida albicans macchiata di increspatura alla capsula. Registra l'ora e riporta la parabola sul palco, ottimizza l'aspetto delle immagini fitzy se necessario e imposta i punti di interesse nel software di imaging, se necessario.Ora inizia l'imaging quando tutti i punti sono a fuoco e i canali sono ottimizzati. Cattura immagini fitzy, trixi e DIC ogni minuto per sei ore. Questa è la fase più critica della procedura.È necessario dedicare del tempo alla corretta configurazione del microscopio. Se i filmati sono sottoesposti o sovraesposti o se sono fuori fuoco, saranno inutilizzabili e l'esperimento dovrà essere ripetuto. Questo video rappresentativo mostra l'assorbimento di candida albicans da parte della linea cellulare di macrofagi murini J 7 74 0.1.Durante un esperimento di videomicroscopia cellulare dal vivo di sei ore, la candida albicans in verde è stata colorata utilizzando il colorante sensibile al pH fitsi, che è stato spento durante l'acidificazione del fagosoma macrofago. Confermando così che quando la candida è stata internalizzata, i compartimenti acidi dei macrofagi sono stati colorati con un colorante fluorescente rosso. Si noti la variazione nel numero di candida albicans ingerita da singoli J 7 74 0,1 macrofagi in questo esperimento, l'82% dei macrofagi J 7 74 0,1 ha inghiottito almeno una cellula di candida albican entro le sei ore.Il numero medio di candida albicans assorbita per macrofago era di 3,4, ma è interessante notare che i macrofagi potevano ingerire fino a 16 cellule fungine. I dati consentono l'osservazione dei macrofagi e della candida albicans prima e durante il riconoscimento e l'assorbimento. La Candida albicans hyer può continuare a crescere all'interno del macrofago, il che può provocare la lisi dei macrofagi.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire esperimenti di microscopia video su cellule vive utilizzando la candida albicans sulla linea cellulare J 7 7 4 0.1 simile a microfagi. Dovresti essere in grado di impostare colture notturne di entrambi i tipi di cellule ed eseguire un test di fagocitosi, che consentirà l'analisi specifica della fase del riconoscimento e dell'inghiottimento della migrazione e anche la maturazione dei fagosomi.

live-cell-video-microscopy-of-fungal-pathogen-phagocytosis

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Mostriamo, come utilizzare 2-fotoni microscopia per l'osservazione delle dinamiche di granulociti neutrofili nei polmoni infettati mentre fagocitare agenti patogeni o di produrre dei neutrofili trappole extracellulare (NET).

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

Un metodo è descritto per selezionare individualmente, manipolare e agenti patogeni immagine dal vivo utilizzando una trappola ottica accoppiato ad un microscopio a disco rotante. La trappola ottica fornisce il controllo spaziale e temporale di organismi e li adiacenti alle cellule ospite. Microscopia a fluorescenza cattura le interazioni intercellulare perturbazione con minimo di cellule.

L&#39;uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Qui mostriamo come citometria immagine può essere utilizzato per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti in coltura. Questa tecnica può essere utilizzata come alternativa al CFU enumerazione.

L&#39;uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti

Descriviamo come visualizzare macrofagi C. neoformans (Cn) interazioni in tempo reale, con particolare enfasi sul processo di esocitosi non-litica mediante microscopia ottica digitale. Utilizzando questa tecnica individuale macrofagi infetti può essere studiato per accertare i vari aspetti di questo fenomeno.

Visualizzazione non-litica Esocitosi di Cryptococcus neoformans Dai macrofagi utilizzando la luce Microscopia Digitale

Qui descriviamo una tecnica basata sul microscopio per visualizzare e quantificare le prime cascate di eventi durante la fagocitosi di agenti patogeni come i funghi Candida albicans e particolati che sono più grandi di 0,5 μm, inclusi zimosani e perle rivestite di IgG.

Visualizzare le fasi iniziali della fagocitosi

Qui, descriviamo un protocollo per valutare l'attività antifungina di cellule immunitarie umane primarie in tempo reale utilizzando fluorescente Aspergillus conidi giornalista in combinazione con microscopia video live-cell e citometria a flusso. Dati generati forniscono informazioni sulle interazioni di accoglienza cellulo Aspergillus, come fungicida, fagocitosi, la migrazione delle cellule e l'inibizione della crescita di funghi.

Immagini dal vivo di antifungini attività da Human neutrofili e monociti primaria in risposta a<em&gt; A. fumigatus</em

Defensine pianta gioca un ruolo importante nella difesa delle piante contro gli agenti patogeni. Per un uso efficace di questi peptidi antimicotici come agenti antifungini, comprendere le loro modalità di azione (MOA) è critico. Qui, è descritto un metodo di imaging di cellule vive per studiare aspetti critici di MOA di questi peptidi.

Imaging di cellule vive di cellule fungine per studiare modalità di entrata e localizzazione subcellulare delle defensine antifungino pianta

I coloranti fluorescenti vitali sono strumenti essenziali per l'analisi dell'imaging a cellule vive nella moderna biologia delle cellule fungine. Questo documento descrive in dettaglio l'applicazione di coloranti fluorescenti affermati e meno noti per il monitoraggio della dinamica della membrana plasmatica, dell'endo/esocitosi e della morfogenesi delle pareti cellulari nei funghi filamentosi.

Applicazione di coloranti fluorescenti selettivi a membrana e a parete cellulare per l'imaging a celle vive di Filamentous Fungi

Il meccanismo associato alla fagocitosi nell'infezione da Leishmania rimane poco conosciuto. Qui, descriviamo i metodi per valutare gli eventi precoci che si verificano durante l'interazione di Leishmania con le cellule ospiti.

Studiare la fagocitosi della Leishmania usando la microscopia confocale

Questo manoscritto descrive in dettaglio un protocollo di inoculazione ottimizzato che utilizza guaine fogliari di mais staccate per studi citologici, fisiologici e molecolari riproducibili delle interazioni del mais con i patogeni fungini delle piante. Le guaine fogliari facilitano l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellulari tra la pianta vivente e il fungo nei tessuti non fissati.

Guaine di mais staccate per l'imaging su cellule vive dell'infezione da patogeni fungini del mais fogliare

Impara la microscopia video a cellule vive per studiare la fagocitosi di Candida albicans da parte dei macrofagi. Questo metodo consente l'analisi in tempo reale delle fasi di migrazione, riconoscimento e maturazione del fagosoma.

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Esplora altri video