Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare se le lesioni genetiche predisposte al cancro al seno alterano il comportamento delle cellule di memoria plastica pineale in coltura primaria. Ciò si ottiene isolando le cellule epiteliali mammarie primarie da topi geneticamente modificati. Come seconda fase, l'imaging time-lapse su cellule vive viene eseguito nell'arco di cinque-sette giorni, creando un filmato per analizzare il comportamento delle cellule.

Quindi viene utilizzato un programma software che tiene traccia delle singole cellule per quantificare e confrontare il comportamento delle cellule isolate da diversi modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno. I risultati mostrano che specifiche lesioni genetiche inducono comportamenti diversi nella memoria pre neoplastica. Cellule epiteliali basate su analisi comportamentali quantitative eseguite utilizzando il tracciamento di singole cellule.

Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni su come diverse lesioni genetiche alterano il comportamento delle cellule epiteliali mammarie mam preneoplastiche. Può anche essere applicato ad altri sistemi come il preneoplastico, le cellule di altri organi, le cellule tumorali di qualsiasi organo, compreso lo studio di possibili cambiamenti comportamentali indotti dalla terapia, nonché il confronto del comportamento delle cellule stromali da tessuto normale e canceroso che dimostrano la procedura. Oggi saranno la volta della dottoressa Priscilla Firth, autrice senior di questa pubblicazione, e Pete Johnson, responsabile del Centro di risorse condivise di microscopia e imaging presso il Lombardi Cancer Research Center della Georgetown University.

Sopprimere un topo e procedere immediatamente con l'autopsia. Posiziona il topo supino su una piattaforma per necroscopia in polistirolo e fissa tutti e quattro gli arti in modo che la pelle ventrale sia tesa. Saturare la pelle ventrale e i capelli, compresa la pelle degli arti, con il 70% di etanolo.

Esporre le ghiandole mammarie numero due e tre e numero quattro e cinque con un'incisione sulla linea mediana attraverso la pelle. Estendere l'incisione con due incisioni a Y attraverso la pelle mediale dei quattro arti. Fare attenzione a non entrare nel peritoneo usando una dissezione smussata.

Separare la pelle dal peritoneo sottostante. Tirare indietro entrambi i lati della pelle finché non è tesa e fissarla alla piattaforma iniziando dal lato esterno. Usa le forbici per eseguire una dissezione smussata che isola le ghiandole mammarie inali e/o toraciche intatte dal tessuto connettivo e dal muscolo sottostanti.

Posizionare una o due ghiandole mammarie in una capsula di Petri da 10 centimetri e spostarle in una cappa di coltura tissutale. Ora, esamina le ghiandole per i linfonodi mammari. Piccoli noduli ben circoscritti di colore giallastro.

Usando un bisturi e una pinza, rimuovili dalla ghiandola circostante. Tritare il tessuto mammario in cubetti di dimensioni millimetriche utilizzando due bisturi. Mettere il tessuto mammario tritato in una provetta conica da 50 millilitri con cinque millilitri di mezzo di dissociazione.

Mescolarlo con una delicata azione e incubarlo per una notte. Tenere il tappo allentato il giorno successivo. Isolare e coltivare le cellule epiteliali primarie.

Subito dopo la placcatura delle celle. Posizionare saldamente la piastra a sei pozzetti su un tavolino da microscopio all'interno di una camera di incubazione. Lasciare equilibrare la piastra per almeno 15 minuti.

Regolare il condensatore per l'illuminazione di Kohler e centrare gli anelli di fase. Apri il software di acquisizione delle immagini come la velocità e crea e assegna un nome a una libreria per le immagini time-lapse e salvale in una posizione con spazio sufficiente per file di grandi dimensioni. Abbassare le lenti per evitare l'interferenza della lente del tavolino.

Sotto l'intestazione dello stage, selezionare calibra stage riacquisire l'impostazione del piano focale Z uguale a zero nella scheda X, Y, Z. E contrassegna i punti di imaging selezionando aggiungi punto sotto il tavolino. Posizionamento dell'intestazione dei punti di imaging al centro di ogni pozzo.

L'imaging a contrasto di fase può essere distorto vicino alla periferia dei pozzetti di plastica. Disponi i punti in un quadrato in campi quattro per quattro, ciascuno con una sovrapposizione di circa il 5%. Salva i punti selezionati nella fase.

Nella fase, seleziona Crea mappa di messa a fuoco e segui le istruzioni per impostare la messa a fuoco di ciascun punto. Quindi imposta i tempi di acquisizione delle immagini in modo da catturare il numero corretto di immagini all'ora. Ora salva la mappa di messa a fuoco sotto stage.

Procedi facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'acquisizione dell'immagine sulla barra degli strumenti sul lato destro. Quindi salvare le impostazioni di imaging. Premere il pulsante di registrazione per iniziare il processo di imaging dopo un'ora, controllare la messa a fuoco delle immagini per vedere se è necessaria una regolazione.

Monitorare e continuare l'imaging dal vivo per cinque giorni quando le cellule diventano confluenti. È fondamentale monitorare le immagini digitali acquisite e regolare frequentemente la mappa di messa a fuoco durante le prime 24 ore perché le celle si attaccheranno alla lastra almeno due volte al giorno. Verificare che le cellule siano a fuoco e che le colture non siano contaminate.

Per determinare il meccanismo di formazione iniziale della colonia, iniziare con una singola pila di immagini che rappresenta un sito di imaging sulla piastra. Nei fotogrammi iniziali, le cellule saranno galleggianti, le cellule epiteliali e i fibroblasti possono essere distinti in base alla morfologia cellulare. Le cellule epiteliali hanno una forma cuboidale e formano colonie cellulari.

I fibroblasti, un tipo di cellula stromale, hanno una morfologia allungata. Segui le immagini seriali per determinare quando la prima cellula epiteliale aderisce alla piastra. In questa fase, le cellule epiteliali possono essere identificate e differenziate dai fibroblasti per la loro morfologia più cuboidale.

Segui questa singola cellula epiteliale attraverso immagini seriali e segui il suo destino nelle successive 24 ore. Prendere nota, se la cellula viene circondata da ulteriori cellule epiteliali, subisce la divisione cellulare o subisce l'apoptosi Se circondata da cellule epiteliali, il meccanismo di formazione delle colonie può essere determinato dall'aggregazione dell'ambiente circostante o dalla divisione cellulare. Registrare il numero di colonie formate dall'aggregazione cellulare rispetto alla divisione cellulare durante le prime 24 ore per determinare il numero di cellule inizialmente aderenti che subiscono l'apoptosi in un determinato periodo di tempo.

Segui le immagini seriali per la comparsa delle caratteristiche classiche dell'apoptosi che si sviluppano in una cellula che è stata aderente nel tempo. Le cellule epiteliali in coltura alterano la loro morfologia da una forma cuboidale iniziale a un aspetto più allungato. Coerente con EMT.

Seguire le immagini seriali per determinare il giorno e l'ora dopo la placcatura Quando ciò si verifica, iniziare avviando il programma TTT. Seleziona le iniziali dell'utente e fai clic su Continua. Premere set NAS, selezionare la cartella di esportazione TTT creata dall'utente e fare clic su OK.

Nel browser, seleziona una cartella dell'esperimento. Selezionare una cartella di posizione, quindi premere il pulsante di caricamento della posizione. Invia il fattore oculare a 10 volte.

Carica il numero di immagini richieste, che in genere è tutte le immagini. Quando si utilizza questa analisi. Per la prima volta nella finestra dell'editor di celle, selezionare Nuova colonia nel menu File nella finestra del filmato.

Premere il pulsante della cella della traccia o premere F due. Per iniziare a tracciare una cella. Identifica una cella nella finestra del filmato e posiziona il cursore sulla cella.

Un cerchio con il numero della cella dovrebbe apparire dopo aver fatto clic su F due. Utilizzare il tasto zero sul tastierino numerico per tenere traccia della posizione della cella e passare all'immagine successiva. Sposta il cursore per seguire la posizione di ogni cella attraverso ogni fotogramma.

Per eliminare una traccia e tornare all'immagine precedente, premere Canc sul tastierino numerico per spostarsi in avanti di fotogrammi senza inseguire la cella, premere tre. E per tornare indietro senza tracciamento, premine uno. Per contrassegnare una divisione cellulare nella finestra del filmato, fare clic sul pulsante di divisione per contrassegnare la morte cellulare nella finestra del filmato, fare clic su morte cellulare.

Una volta che si è verificata una divisione, le cellule figlie possono essere tracciate nella stessa mappa del destino cellulare. Per fare ciò, vai alla finestra dell'editor di celle e fai clic con il pulsante destro del mouse sul simbolo del cerchio della cella del puntatore designata. Questo avvia automaticamente la modalità di tracciamento, ora premi F 10 per salvare l'albero.

Ogni albero verrà salvato nella cartella di output designata. Per avviare una nuova mappa dei solfati nella finestra dell'editor di celle, selezionare il menu aperto, fare clic su file e fare clic. Le nuove cellule di colonia sono state arrotondate e galleggianti all'inizio dell'imaging.

Le barre di dimensioni sono pari a 200 micron Dopo l'attacco alla piastra, sono diventate piatte e hanno dimostrato un aspetto di tipo cuboidale. Entro quattro giorni di coltura, la maggior parte delle cellule epiteliali si è allungata in una morfologia simile all'EMT. Questo cambiamento si è verificato con la stessa cronologia in tutti i genotipi studiati: le cellule galleggianti si sono sviluppate in colonie di cellule epiteliali individuali definite.

Entro 24 ore dalla piastra, l'analisi seriale delle immagini ha rivelato che queste colonie sono state generate dall'aggregazione cellulare piuttosto che dalla divisione cellulare. Mentre la distruzione di BRCA uno di per sé non ha alterato il numero di colonie formate. L'aggiunta dell'insufficienza dell'aplofono TP 53 ha ridotto significativamente il numero di colonie formate.

Allo stesso modo, l'aggiunta di ER alfa in eccesso di espressione ha aumentato significativamente il numero di colonie formate a seguito di questa procedura. Altri metodi che impiegano l'uso dell'imaging time-lapse combinato con il tracciamento di singole cellule possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come il modo in cui approcci terapeutici specifici o lesioni genetiche aggiuntive alterano il comportamento cellulare e possono influenzare la risposta terapeutica o la progressione del cancro.