Misurazione di trasporto cationico da Na, K e H, K-ATPasi Xenopus Gli oociti per spettrofotometria di assorbimento atomico: una alternativa a saggi radioisotopi

La procedura utilizza i citi di rana come sistema di espressione in vivo. Per quantificare l'attività di trasporto del contatore di potassio P-tipo A, TP, ais o altri trasportatori di membrana di oligoelementi esprimono prima la proteina trasportatrice in zap lavis. I citi inducono quindi l'assorbimento cationico incubando le cellule in una soluzione di flusso contenente una certa concentrazione del catione trasportato per un tempo e una temperatura fissi.

In alternativa, eseguire l'esperimento di assorbimento sotto controllo del potenziale di membrana utilizzando la tecnica del voltage clamp a due elettrodi. Dopo aver lavato le cellule, omogeneizzare, i singoli ovociti in un millilitro di acqua milliporosa. Successivamente, misurare i campioni su uno spettrofotometro ad assorbimento atomico dotato di un forno atomizzato di grafite riscaldato trasversalmente.

In definitiva, analisi del flusso di traccianti mediante assorbimento atomico. La spettrometria può essere utilizzata per determinare la cinetica del trasporto o dell'inibitore, la dipendenza dalla tensione del trasporto e del trasporto, la geometria stoica e può eventualmente essere utilizzata per lo screening farmacologico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un'alternativa accurata, economica e sicura agli esperimenti convenzionali di flusso tracciante con radioisotopi.

Offre inoltre una misurazione precisa dell'influenza del potenziale di membrana sulla funzione del trasportatore. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle relazioni funzionali della struttura dei TPA di tipo P, può essere applicato anche ad altre proteine trasportatrici di membrana specifiche per il sink di rame o altri oligoelementi. Preparare gli opusciti, ed eseguire l'iniezione di CRNA come descritto da Richards e Demsky per aumentare la concentrazione intracellulare di sodio per le misurazioni funzionali del sodio potassio.

Ai TPA. Innanzitutto, trasferire i citi in un tampone di carico di sodio e incubare su ghiaccio per 45 minuti. Quindi posizionare i citi per recuperare nel tampone post-carico per almeno 30 minuti su ghiaccio.

Ora, per bloccare il sodio potassio endogeno ai TPA, incubare i citi in un tampone post-carico contenente 100 micromolari di lobbing per 15 minuti. A temperatura ambiente, preparare i micro elettrodi tirando i capillari silicici Bos utilizzando un estrattore per micropipette a due fasi. Riempire gli elettrodi di vetro dal retro con tre molari di cloruro di potassio e montarlo sopra il filo di argento e cloruro d'argento dei micro portaelettrodi del morsetto di tensione a due elettrodi impostato.

Quindi, inserire i microelettrodi di vetro e due ponti di agar cloruro di sodio nella camera di registrazione pre-riempita con tampone di misura. Portare l'amplificatore a morsetto di tensione in modalità off. Controllare separatamente la resistenza di ciascun elettrodo di vetro.

Inoltre, controllare i potenziali di offset dell'elettrodo di tensione e corrente sul display dell'amplificatore TEVC appropriato. In caso di discrepanza da zero, regolare l'offset con i corrispondenti regolatori di offset dell'amplificatore. Ora posiziona un ovocita al centro della camera e penetra delicatamente nella membrana con l'elettrodo di corrente e di tensione.

Controllare la lettura del potenziale dell'amplificatore per il potenziale di riposo della cella. Commutare l'amplificatore in modalità VC utilizzando il software P clamp. Bloccare la cellula a un potenziale di membrana predefinito.

Monitorare l'ampiezza e la stabilità della corrente di dispersione perfondere l'ovocita con una soluzione contenente rubidio per un tempo definito. E registra la corrente della pompa con il software p clamp. Assicurarsi che l'assorbimento del rubidio sia completamente interrotto in seguito perfondendo la cella con una soluzione priva di rubidio per 30 secondi.

Ora fermate l'esperimento del morsetto di tensione a due elettrodi. Estrarre l'ovocita dalla camera di registrazione e procedere al lavaggio. Passaggio 4.4 per analizzare l'assorbimento del rubidio con assorbimento atomico.

Spettrometria con i dati. Eseguire una sottrazione di corrente di offset e valutare l'integrale temporale della corrente della pompa utilizzando il programma di adattamento a pinza del pacchetto di pinze P. Per evitare danni agli ovociti, tagliare e fondere un puntale per pipetta da 200 microlitri a circa due millimetri di diametro.

Quindi, per ogni ovocita da misurare, preparare una provetta da 1,5 millilitri riempita con un millilitro di acqua millipore. Disporre tre piastre di Petri con tampone di lavaggio privo di rubidio e una piastra con acqua millipore. Ora trasferisci contemporaneamente cinque citi pre-incubati in una piastra di Petri da 3,5 centimetri riempita con tampone di flusso di rubidio incubato a temperatura controllata.

Quindi, sciacquare contemporaneamente i citi nel primo piatto con un tampone di lavaggio privo di rubidio. Procedere al secondo e terzo lavaggio e poi risciacquare delicatamente in acqua millipore. Ora trasferisci ogni ovocita singolarmente nelle provette di eph preparate riempite con un millilitro di acqua millipore Omogeneizzare ogni ovocita utilizzando un puntale per pipetta da 200 microlitri fino a quando la soluzione non è omogeneamente torbida.

Aprire la valvola di alimentazione del gas Argonne. Inserire un'appropriata lampada a catodo cavo nella posizione arbitraria della presa ed equilibrare lo strumento per 15 minuti. Quindi avviare il software di controllo wind lab 32 e attendere 15 minuti per l'equilibratura delle lampade.

Verificare che il tubo dell'atomizzatore in grafite riscaldato trasversalmente sia in buone condizioni. Quindi selezionare la tecnica del forno THGA nel laboratorio eolico 32. Preparare campioni di calibrazione con almeno cinque concentrazioni di litio rubidio comprese tra 10 e 50 microgrammi per litro, disciolti in acqua millipore e una sonda bianca di sola acqua millipori.

Ora scegli il file di inizializzazione appropriato chiamato file del metodo. Inserire le posizioni e le concentrazioni dei campioni di calibrazione e della sonda in bianco. Seleziona il campionatore automatico appropriato.

Misurare le sonde di calibrazione. Ora trasferisci ogni omogenato di ovociti in singole coppette per campioni di polipropilene da 1,2 millilitri e posiziona queste provette nel vassoio del campionatore automatico. Creare un file di informazioni di esempio per identificare le sonde nelle posizioni del campionatore automatico.

Quindi regolare il volume del campione a 20 microlitri e avviare lo strumento al termine della corsa. Verificare la presenza di sonde in cui la quantità misurata di rubidio supera il massimo della curva di calibrazione. Diluire questi campioni in modo appropriato e misurarli nuovamente per il sodio potassio elettrogenico.

I flussi di rubidio di un TPA possono essere determinati in due esperimenti di clap di tensione degli elettrodi volti alla correlazione tra il trasporto netto di carica e il trasporto di rubidio. Qui, l'integrazione del segnale di corrente ha prodotto 7.840 nku di carica totale trasportata. Il rapporto tra la carica totale e il flusso di rubidio era di 0,47, un valore coerente con la stechiometria di trasporto di tre sodio e due di potassio degli APA di sodio e potassio.

La riproducibilità di questa tecnica di A a s su esperimenti su singola cella è dimostrata dai risultati di esperimenti ripetuti che producono una correlazione lineare tra la carica totale e il trasporto di rubidio con un fattore di pendenza di 0,49 per il protone potassio che opera in modo neutro. A TPA è possibile determinare la dipendenza dalla concentrazione dell'assorbimento del rubidio e la sua sensibilità verso l'inibitore specifico S CH 2 8 0 8 0. Queste misurazioni in diversi lotti di ovociti mostrano un assorbimento di fondo negli ovociti non iniettati inferiore al 10% dell'assorbimento di rubidio massimo rilevato, e questo è insensibile all'aggiunta di SCH 2 8 0 8 0.

Al contrario, i flussi nei citi che esprimono atpa di potassio protonico sono ridotti al livello di fondo. Con l'aggiunta di 10 micromolari s CH 2 8 0 8 0 0 il tracciamento dei valori di assorbimento specifico consente di calcolare le affinità apparenti del protone potassio Il trasporto del turnover dell'ATP per il sodio extracellulare del rubidio determina una diminuzione dell'affinità apparente per il rubidio coerente con la competizione per la tasca di legame cationico extracellulare durante il trasporto. La combinazione di esperimenti di assorbimento del rubidio sotto il controllo del potenziale di membrana mediante la pinza di tensione a due elettrodi e la determinazione di un a s può anche essere applicata per determinare la dipendenza dalla tensione del trasporto di rubidio da parte di APA di potassio protonico.

In diverse condizioni di pH, gli esperimenti di flusso di rubidio possono essere utilizzati per studiare gli effetti funzionali delle mutazioni degli APA del potassio protonico. Ad esempio, le analisi dell'attività di trasporto del rubidio di mutanti APA protonico-potassio con diverse delezioni C terminali rivelano che l'attività di assorbimento del rubidio diminuisce gradualmente con il numero di amminoacidi eliminati. È interessante notare che l'entità dell'inibizione dell'assorbimento del rubidio da parte di 10 micromolari SC 2 8 0 8 0 è notevolmente ridotta per il costrutto delta Y, mentre delta YY e delta Q-E-L-Y-Y non sono più sensibili a 10 micromolari S CH 2 8 0 8 0 in tutte le analisi della pagina SDS indicano che la quantità totale di proteine nelle frazioni di membrana per i vari costrutti di delezione era simile.

Tuttavia, la quantità relativa di proteine nelle frazioni della membrana plasmatica è diminuita con la delezione C terminale assunta insieme ai risultati dell'inibizione del farmaco. Questi dati hanno implicazioni sulla distribuzione allo stato stazionario degli intermedi del ciclo di reazione: come discusso nel testo di accompagnamento, i flussi di rubidio possono anche essere utilizzati per misurare parametri termodinamici come le energie di attivazione. L'assorbimento del rubidio da parte del protone potassio ATPA esprime gli ovociti è fortemente dipendente dalla temperatura.

Un grafico aous produce una buona correlazione lineare dei dati con conseguente energia di attivazione di 96 kilojoule per mole. I primi risultati con l'assorbimento del litio hanno mostrato che l'assorbimento aspecifico di litio nei citi è basso, mentre l'assorbimento da parte dell'atpa di potassio protonico aumenta in modo dose-dipendente e sembra resistente a SC 2 8 0 8 0. Questi dati fanno luce sugli stati enzimatici durante il ciclo stazionario del litio protonico.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di selezionare i citi per dimensioni omogenee e di attenersi attualmente ai tempi di incubazione e alla temperatura per ogni esperimento di flusso. A seguire una procedura S. Altri metodi, come lo screening farmacologico, possono essere eseguiti al fine di identificare nuovi farmaci per la terapia contro le malattie umane, come i gas, gli osteopati o l'ipertensione.