Name: Langiogenesi nel polmone del ratto ischemica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Impara la legatura dell'arteria polmonare sinistra nel ratto per studiare la neovascolarizzazione bronchiale. Questo metodo chirurgico consente di analizzare la risposta vascolare polmonare all'ischemia mediante misurazioni di fluorescenza e istologia.

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Riconosciamo il lavoro del dottor Adlah Sukkar, MD nell&#39;assistere con fusione del polmone. Questo lavoro è stato finanziato dal NHLBI, HL088005.

Tutti i protocolli eseguiti su ratti sono stati approvati dalla Johns Hopkins Animal Care University e del Comitato uso e in conformità con le linee guida NIH. Quando possibile, l&#39;animale deve essere preparata chirurgicamente in una zona separata dalla zona chirurgica per ridurre al minimo la contaminazione del sito chirurgico. 1. Anestesia / analgesia <ol><li> Posto ratto (ratti Sprague Dawley maschi, 125-150 g; Harlan, Indianapolis, IN) in una camera di induzione infuso con 3% isoflurano. </li><li> Posizionare ratto anestetizzato a bordo chirurgia attaccato al cono e ventilatore con il 3% anestesia isoflurano. Utilizzare la tecnica sterile per tutte le procedure. Drappeggio ratto garantire campo sterile operativo. </li></ol> 2. Intubazione <ol><li> Immobilizzare appendici in posizione supina con nastro adesivo chirurgico. </li><li> Rimuovere ratto dal naso a cono, estendere la lingua con le pinze imbottite. </li><li> Utilizzare 14 intracath calibro con stiletto in metallo smussato come guida. Far scorrere dietro aNgue, nella trachea. </li><li> Rimuovere stiletto in metallo bianco lasciando intracath plastica in trachea. Garantire il ratto respira e l&#39;aria fluisce attraverso il tubo. </li><li> Sostituire il cono con adattatore diretto al catetere, collegare ratto di ventilatore (90 atti / min, 8 ml / kg di volume corrente; Roditore Ventilatore modello 683, Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts). </li><li> Applicare Puralube (Butler Schein, Dublin, OH) unguento veterinaria sugli occhi. </li></ol> 3. Toracotomia <ol><li> Luogo ratto lato destro verso il basso, immobilizzare appendici con nastro adesivo chirurgico. </li><li> Shave sinistra nella cassa toracica laterale. </li><li> Rimuovere pelo in eccesso con il vuoto di piccole dimensioni. </li><li> Fai campo sterile pulendo giù con l&#39;alcol seguita da Povidone-Iodio swabstick (Dynarex Corporation, Orangebur, NY). Ripetere questa operazione altre due volte (per un totale di tre scrub). </li><li> Fai incisione trasversale con le forbici sterili dissezione o bisturi sterile nel centro del campo. </li><li> Blunt sezionare attraverso layers del tessuto e grasso fino a nervature (ultimo strato è sottile membrana che copre le costole). </li><li> Contare costole per determinare 3 ° spazio intercostale. </li><li> Utilizzando sterili 45 ° Graefe pinza, fare un&#39;incisione smussato tra il 3 ° e 4 ° costola. </li><li> Inserire separatori costola, tirare leggermente la creazione di vuoto aperto con visualizzazione completa di polmone, nastro adesivo posto su suture di tenere aperto. </li></ol> 4. Sinistra legatura dell&#39;arteria polmonare <ol><li> Con 90 ° pinza Graefe, spostare polmone sinistro posteriore con la mano destra. </li><li> Utilizzando i modelli Dumont N ° 5 pinze diritte, prendere a sinistra dell&#39;arteria polmonare e delle vie aeree con la mano sinistra. Sinistro dell&#39;arteria polmonare si stese sopra delle vie aeree. Garantire che pinze sono direttamente perpendicolare al tavolo. Inoltre, è più efficace per raccogliere l&#39;arteria polmonare sinistra / bronco principale sinistro nella posizione più distale (più vicino al parenchima). Spingere il polmone sinistro di ventilazione da parte con questa manovra la mano sinistra. </li><li> Utilizzare Dumontpattern # 5 45 ° pinze curve per separare l&#39;arteria polmonare sinistra dal bronco principale di sinistra alle frontiere naturali. Questa linea di separazione appare sottile e bianca tra le due strutture singole. </li><li> Separare direttamente sotto l&#39;arteria, senza passare attraverso la nave, senza problemi far scorrere le punte pinze tenute insieme lungo la separazione. </li><li> Continuare fino a punte della pinza sono visibilmente separati l&#39;arteria polmonare sinistra e il bronco principale di sinistra. Solo un piccolo punto della punta deve essere pienamente attraverso. Se il sangue può essere visualizzata sulla punta della pinza, allora non è completamente tramite legatura e non deve essere tentata. Una volta nello spazio, l&#39;arteria polmonare sinistra porrà sulla curva della pinza. Tenere in questa posizione. </li><li> Delicatamente rilasciare dritto smussato presa pinza (mano sinistra) e prendere parte di un pre-taglio sutura (~ 2-3 cm; sutura in polipropilene formato 6-0, Myco medici, Cary, NC). </li><li> Aprire pinze curve cullano sinistro dell&#39;arteria polmonare e grab sutura. Estrarre delicatamente sutura attraverso lo spazio tra sinistra dell&#39;arteria polmonare e bronco principale di sinistra in un movimento verso l&#39;alto rispetto alla curva della pinza. </li><li> Fissate occludere la polmonare sinistra con un nodo quadrato, resto attentamente snip di sutura. </li><li> Chiudi costole con una pinzetta smussate per tenere costola e due volte con sutura in polipropilene (monofilamento blu) taglia 4-0 collegato a un 19 mm, 3/8 retromarce cerchio di taglio dell&#39;ago (Myco Medical, Cary, NC) in una pinza emostatica, facendo attenzione a non sutura della pelle (solo costole). </li><li> Completare un nodo allentato quadrato, gonfiare il polmone, luogo positiva di fine espirazione (PEEP; 2-5 cm H 2 O), hyperinflate nodo polmonare poi sicuro strettamente e fare un altro nodo pieno prima snipping resto di sutura. Rimuovere dalla PEEP e visualizzare per 30 sec per garantire che il polmone non collassa. Applicare 5 gocce Bupivicaine (APP Pharmaceuticals, Schaumbur, IL). </li><li> Chiudi la pelle mettendo colla tessuto sulla ferita e spingere indietro la pelle insieme usando end di cotone punta dell&#39;applicatore. Dare Bupivicaine (2,0 mg / kg per via sottocutanea) al sito di incisione successivamente ogni 8 ore per 24 ore o fino a quando l&#39;animale riprende la normale attività. Come strato sottocutaneo in questa zona è molto sottile, non è facile da suturare da solo. Quando la colla è applicata tessuto e la pelle viene accostati chiude anche lo strato sottocutaneo. </li><li> Spegnere gas isoflurano, ma continuano a ventilare il ratto per 1-2 minuti in aria ambiente fino al ritorno del movimento volontario. Scollegare il tubo tracheale dal ventilatore e assicurarsi che il ratto è in respiro spontaneo prima di rimuoverlo. </li><li> Pulire Puralube da occhi con un batuffolo di cotone e il movimento del monitor e di recupero. Iniettare buprenorfina cloridrato (0,05 mg / kg intraperitoneale, Butler Schein, Dublino OH). Continua la consegna di ogni analgesico ore 12 per 48 ore dopo l&#39;intervento chirurgico. </li></ol> 5. Sinistra incannulamento arteria carotide Per valutare l&#39;entità del perfus bronchialiione del polmone ischemico sinistra a tempi desiderati sinistra dopo legatura dell&#39;arteria polmonare, iniettare microsfere marcate attraverso l&#39;arteria carotide sinistra nella aortico. Preparare ratti come sopra 1-2. <ol><li> Tagliare linea mediana lungo il collo, smussare sezionare per rivelare trachea e sinistra arteria carotide (al sito di iniezione microsfere). </li><li> Inserire il catetere riempito con soluzione fisiologica eparinizzata, punta smussata di PE20 tubi (Becton Dickinson, Sparks MD) nel serbatoio collegato a 25 g di aghi, 4 vie rubinetto, siringa da 1 ml. </li><li> Bottiglia Luogo di microsfere (15 micron cremisi polistirene microsfere fluorescenti, 1 x 10 6 sfere / ml; Invitrogen, Eugene, OR) in sonicatore acqua per 30 sec. </li><li> Rimuovere bottiglia, vortice e redigere 0,5 ml (500.000 microsfere), in un ml 1 siringa di vetro Hamilton (Hamilton Company, Reno, NV) attraverso un ago 20 g. </li><li> Collegare la siringa Hamilton a 4-way rubinetto e infondere microsfere con pompa a siringa (rate: 500 microlitri / min; Genie Plus, Kent scientifico, Torringtsu, CT). </li><li> Rimuovere la siringa Hamilton e apparecchi filo con 1 ml di soluzione fisiologica heparized a 500 microlitri / min. </li><li> Eseguire toracotomia pieno petto e exsanguinate il ratto dal recidendo la vena cava inferiore. </li><li> Rimuovere il polmone sinistro e altri tessuti di interesse. </li><li> Per estrarre microsfere dal tessuto, prendere l&#39;intero polmone sinistro del ratto dopo dissanguamento e trasferirla in KOH 2M (4-6 ml). Mettere in un bagno d&#39;acqua ° 55 C e lasciare per una notte per la digestione dei tessuti. Aggiungere Tween 80 (0,25%) per lavare le perline, vortice (10 sec) e centrifugare (2000 rpm, 20 ° C per 10 min). Rimuovere il surnatante, aggiungere 2-etossietil acetato (1 ml), vortex e lasciare riposare per 1 ora. Vortex e centrifugare la sospensione (2.000 rpm; (20 ° C per 10 min) Rimuovere il 2-etossietil strato acquoso contenente l&#39;acetato, fluorescenza posto in una cuvetta e misurare usando un Hitachi F-2500 spettrofotometro a fluorescenza (eccitazione 612/emission 618. , Digilab, Holliston, MA). </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Sinistra legatura dell&#39;arteria polmonare in tutte le specie testate porta alla robusta neovascolarizzazione sistemica del polmone ischemica. Abbiamo presentato i dettagli del metodo chirurgico in un modello di ratto. I nostri risultati prodotti da fusione vascolare, istopatologia, e in vivo dimostrano che l&#39;etichettatura arterie bronchiali proliferano e perfusione del parenchima polmonare. Così, i meccanismi di angiogenesi bronchiale può essere studiata in un modello animale che affianca la condizione u...

Angiogenesi sistemica nel polmone è ben riconosciuta. In condizioni patologiche quali asma 2, fibrosi polmonare interstiziale 3, cancro 4, tromboembolia polmonare cronica e 5, il sistema vascolare sistemica e circonda i prolifera polmonari e invade il parenchima polmonare. Tuttavia, i modelli animali per studiare questa attivazione differenziale del sistemica piuttosto che la circolazione polmonare sono pochi. Forse il modello più riproducibile di neovascolarizzazione sistemica nel polmone del mammifero adulto è quella che si verifica dopo induzione cronica ischemia arteriosa polmonare. La risposta a sinistra ostruzione dell&#39;arteria polmonare nell&#39;uomo 5-7, 8 cani, maiali, pecore 9 10, cavie, ratti 11 1, 12, 13, 14 e topi è la rapida proliferazione dell&#39;arteria bronchiale e arterie intercostali. I meccanismi responsabili della sistemica neovascularizione del polmone dopo ischemia polmonare non sono noti e non sono state ampiamente studiate. La durata di angiogenesi bronchiale nel ratto dopo sinistra ostruzione dell&#39;arteria polmonare è stata descritta nel lavoro istologica di Weibel 1. Estendere questo lavoro nel ratto, il nostro laboratorio ha focalizzato su entrambi i fattori di crescita importanti in questo processo, nonché l&#39;esito fisiologico di questo neovascolarizzazione nel polmone. Risultati dimostrano la chemochina CXC CINC-3 è elevata precoce dopo ischemia e trattando ratti con un anticorpo neutralizzante per CXCR2, il recettore per CINC-3, attenua angiogenesi 13. Il sistema vascolare di nuova costituzione bronchiale 14 giorni dopo l&#39;insorgenza di ischemia polmonare ha dimostrato di essere anormale, con un significativo aumento della permeabilità delle proteine ​​15. Funzione polmonare sinistra non stava mostrando normale diminuita capacità di diffusione e una diminuzione del volume polmonare 15. Sebbene la neovascolarizzazione può avere contributed alla conservazione del tessuto polmonare durante ischemia cronica polmonare, sembra non essere normale e può contribuire ad un prolungato decremento della funzione polmonare. Forse uno degli aspetti più curiosi di questo modello riguarda la distribuzione spaziale della proliferazione dei vasi sanguigni. Nonostante il rilascio di fattori di crescita all&#39;interno del parenchima polmonare da ischemia, la neovascolarizzazione originario monte relativamente grandi arterie bronchiali. L&#39;arteria bronchiale normale si pone come un piccolo ramo della aorta e invade l&#39;albero delle vie aeree alla carena. Così il meccanismo con cui i fattori di crescita indurre la fase iniziale di arteriogenesi non è chiara. Suggeriamo che il topo, con una anatomia vascolare simili agli esseri umani, fornisce un&#39;opportunità unica di studiare i meccanismi responsabili per l&#39;angiogenesi sistemico polmonare durante l&#39;ischemia. Sebbene completa ostruzione dell&#39;arteria polmonare sinistra è un evento raro in soggetti umani,aumentata vascolarizzazione bronchiale sembra essere similmente indotta in pazienti indipendentemente dalla dimensione del sito e ostruzione dell&#39;arteria polmonare 16. Così, forniamo una descrizione dettagliata del metodo chirurgico per legare l&#39;arteria polmonare sinistra in ratti e un mezzo per quantificare la grandezza di angiogenesi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenti: </td><td> Azienda </td><td></td><td></td></tr><tr><td> buprenorfina cloridrato, Puralube </td><td> Butler Schein </td><td></td><td></td></tr><tr><td> bupivicaine </td><td> APP Pharmaceuticals </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Povidone-iodio swabstick </td><td> Dynarex Corporation </td><td></td><td></td></tr><tr><td> polipropilene dimensioni sutura 6-0, 3/8 cerchio ago inversione di taglio </td><td> Myco Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PE20 tubi </td><td> Becton Dickinson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 micron fluorosfere polistirene cremisi </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ml di vetro siringa Hamilton </td><td> Hamilton Azienda </td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Attrezzatura: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Genie Inoltre siringa pompa </td><td> Kent scientifico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spettrofotometro fluorescenza </td><td> Digilab </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Roditore Ventilatore Modello 683 </td><td> Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 1. Tabella di reagenti e attrezzature specifiche. </td></tr></tbody></table>

l&#39;angiogenesi nel polmone del ratto ischemica

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

Il polmone adulto è perfuso sia l&#39;arteria sistemica bronchiale e il ritorno venoso intero che scorre attraverso le arterie polmonari. Nella maggior parte delle patologie polmonari, è il più piccolo vascolare sistemica che risponde ad una esigenza di perfusione polmonare avanzata e mostra neovascolarizzazione robusta. Ischemia vascolare polmonare indotta da ostruzione arteriosa polmonare ha dimostrato di provocare una rapida angiogenesi arteriosa sistemica nell&#39;uomo e in modelli animali. Sebbene la valutazione istologica del corso tempo di proliferazione dell&#39;arteria bronchiale nei ratti è stato accuratamente descritto da Weibel 1, meccanismi responsabili di questa crescita di nuovi vasi organizzata non sono chiare. Noi forniamo i dettagli chirurgici di indurre sinistra ischemia arteriosa polmonare nel ratto che porta alla neovascolarizzazione bronchiale. Quantificazione del grado di angiogenesi presenta una sfida aggiuntiva per la presenza dei due letti vascolari all&#39;interno del polmone. Metodideterminare angiogenesi funzionale sulla base iniezioni microsfere sono etichettati.

Espressi vascolare: Risultati degli effetti di sinistra ischemia dell&#39;arteria polmonare nel ratto sono rappresentati in figura 1. Viene mostrato un cast in metacrilato del circolo bronchiale e la vascolarizzazione estesa della struttura delle vie aeree sinistra 28 giorni dopo la LPAL. Per ottenere questo cast, il sistema vascolare sistemica è stata iniettata una miscela metacrilato (rosso), retrogrado nell&#39;aorta discendente e la trachea è stata incannulata e iniettato con un materiale a base di ...

Il polmone è perfuso sia l&#39;arteria sistemica bronchiale e arterie polmonari. Nella maggior parte delle patologie polmonari, è il più piccolo vascolare sistemica che mostra neovascolarizzazione robusta. La cessazione del flusso ematico polmonare promuove l&#39;angiogenesi vivace bronchiale. Noi forniamo i dettagli chirurgici di indurre ischemia arteriosa polmonare sinistra che promuove la neovascolarizzazione bronchiale.

L&#39;angiogenesi nel polmone del ratto ischemica

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

L'obiettivo generale di questa procedura è legare l'arteria polmonare sinistra. Ciò si ottiene intubando e ventilando prima un ratto anestetizzato. Successivamente, viene eseguita una toracotomia e viene legata l'arteria polmonare sinistra.Dopo la legatura, il torace viene chiuso e il ratto può riprendersi. In definitiva, l'entità della neovascolarizzazione nel polmone sinistro può essere valutata misurando il livello di fluorescenza nel tessuto o con altri metodi istologici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre l'opportunità di studiare lo sviluppo in vivo e la neovascolarizzazione della circolazione bronchiale nel polmone.Ciò fornisce un'opportunità per studiare la complessa struttura 3D di questo nuovo sistema vascolare in un polmone ventilato. Ora, questo è molto diverso da ciò che viene attualmente fatto dalla maggior parte dei ricercatori che formano l'OMS, che eseguono studi in vitro che studiano la proliferazione delle cellule endoteliali e la chemiotassi o la formazione di tubi. In generale, gli individui che non conoscono questa procedura avranno difficoltà a cercare di eseguire la dissezione tra l'arteria polmonare sinistra e il bronco sinistro.L'unico c

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Normale adulto tessuto vascolarizzato mammiferi che manca l'angiogenesi fisiologica e che non è stata esposta a un intervento chirurgico viene utilizzato per studiare: (i) l'avvio e lo sviluppo di angiogenesi in seguito alla somministrazione intraperitoneale di agenti di test, e (ii) la modifica di angiogenesi dopo somministrazione sistemica di selezionati agenti di test.

Rat mesentere angiogenesi Assay

Inizia con un ratto sottoposto a occlusione dell'arteria cerebrale media, una procedura chirurgica che blocca temporaneamente il flusso sanguigno al tessuto cerebrale.Questo induce un ictus ischemico, con conseguente danno al tessuto cerebrale.Quindi, rimuovere il blocco per ripristinare il flusso sanguigno.Seleziona i ratti che presentano deficit neurologici per garantire la pertinenza dello studio.Quindi, somministrare il farmaco di prova al gruppo sperimentale mentre si inietta soluzione...

Valutazione degli effetti dell'angiogenesi di un farmaco in prova in un modello di ictus ischemico su ratto

La preparazione isolato polmone sangue perfuso rende possibile visualizzare le reti microvasali sulla superficie polmonare. Qui si descrive un metodo per quantificare permeabilità delle singole microvasi nei polmoni isolati utilizzando l'imaging di fluorescenza in tempo reale.

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

La ricapitolazione del microambiente organo-specifico, che stimola l'angiogenesi locale, è indispensabile per il successo della rigenerazione dei tessuti danneggiati. Questo rapporto dimostra un nuovo metodo per impiantare gel di fibrina sulla superficie polmonare di topo vivente al fine di esplorare come il microambiente polmonare specifico modula l'angiogenesi e la rigenerazione alveolare nel topo adulto.

L&#39;impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

Questo protocollo utilizza un catetere a palloncino per causare un danno endoluminale sull'arteria carotide di ratto e d'ora in poi suscitare iperplasia neointimale. Questo è un modello consolidato per lo studio dei meccanismi di rimodellamento vascolare in risposta al danno. È inoltre ampiamente utilizzato per determinare la validità dei potenziali approcci terapeutici.

Vascolare Balloon Lesioni e intraluminale Amministrazione in Rat carotide

La somministrazione di farmaci per il recupero della funzione renale richiede il controllo della localizzazione e distribuzione del composto terapeutico. Qui, descriviamo in dettaglio una semplice tecnica per la consegna intrarenale di farmaci nei ratti. Questa procedura può essere eseguita facilmente senza mortalità ed elevata riproducibilità.

Consegna intravascolare di Biologics al rene di ratto

Qui viene presentato un modello sperimentale critico di ischemia dell'arto posteriore seguito da una batteria di test funzionali, istologici e molecolari per valutare l'efficacia delle terapie angiogeniche.

Valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb

La retinopatia indotta dall'ossigeno (OIR) può essere utilizzata per modellare malattie retiniche ischemiche come la retinopatia della prematurità e la retinopatia diabetica proliferativa e per servire da modello per studi proof-of-concept nella valutazione dei farmaci antiangiogenetici per le malattie neovascolari. OIR induce una neovascolarizzazione robusta e riproducibile nella retina quantificabile.

Modello di retinopatia indotta dall'ossigeno per le malattie retiniche ischemiche nei roditori

Qui, presentiamo le ottimizzazioni di un modello di trapianto di polmone di ratto che servono a migliorare i risultati. Forniamo una guida alle taglie per i polsini in base al peso corporeo, una strategia di misurazione per accertare il 4° spazio intercostale e metodi di chiusura della ferita e raccolta di liquidi e tessuti BAL (lavaggio broncoalveolare).

Un modello di trapianto di polmone di ratto di ischemia calda / danno da riperfusione: ottimizzazioni per migliorare i risultati

Il protocollo delinea un metodo fattibile, affidabile e riproducibile di clampaggio ilare polmonare sinistro che può essere utilizzato per studiare il danno da ischemia-riperfusione polmonare in modelli murini.

Modello murino di morsetto ilare polmonare sinistro di lesione da riperfusione da ischemia polmonare

Viene descritta una metodologia dettagliata per stabilire un modello minimamente invasivo di embolia polmonare nel ratto utilizzando coaguli di sangue autologhi. Vengono inoltre forniti ulteriori metodi per quantificare l'area infartuata e visualizzare l'albero arterioso polmonare.

Istituzione di un modello di embolia polmonare minimamente invasivo per ratti utilizzando coaguli di sangue autologhi

Impara la legatura dell'arteria polmonare sinistra nel ratto per studiare la neovascolarizzazione bronchiale. Questo metodo chirurgico consente di analizzare la risposta vascolare polmonare all'ischemia mediante misurazioni di fluorescenza e istologia.

L'angiogenesi nel polmone del ratto ischemica

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