Giant Preparazione liposomi per Immagini e di patch-clamp elettrofisiologia

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare vescicole uni-lamellari giganti in modo compatibile con l'integrità funzionale delle proteine di membrana incorporate nella membrana della vescicola. Ciò si ottiene depositando prima lipidi o piccoli liposomi su una superficie conduttiva come un vetrino rivestito ITO. Il secondo passo consiste nell'evaporare il solvente in modo controllato per ottenere un film lipidico uniforme sulla superficie conduttiva.

Successivamente, reidratare accuratamente il film lipidico in un tampone adatto e preparare la camera di elettroformazione. Il passaggio finale consiste nell'applicare una tensione oscillante attraverso il film lipidico per generare vescicole di Miller unali giganti. Infine, le vescicole saranno sottoposte a imaging per determinarne le dimensioni e la qualità e confrontarle con le vescicole formate con una tecnica classica.

La dimostrazione visiva di questo protocollo è utile perché la deposizione lipidica può essere difficile da padroneggiare, dipende da molte variabili ed è meglio analizzarla mediante ispezione visiva. Prima di iniziare questa procedura, rimuovere i lipidi dal deposito a meno 20 gradi Celsius o meno 80 gradi Celsius e riscaldarli a temperatura ambiente. Se possibile, eseguire l'esperimento in un'atmosfera di gas inerte come un vano portaoggetti.

Successivamente, coprire i lipidi con argonne secco o azoto gassoso e in tutti i passaggi ridurre al minimo l'esposizione all'aria. Se i lipidi non sono forniti in solventi organici, sospendere 0,3 milligrammi di lipidi in cloroformio o cicloeano a 10 milligrammi per millilitro. Si noti che le concentrazioni dichiarate dai produttori sono in genere solo nominali.

Utilizzare l'etanolo per pulire entrambi i lati di 2 vetrini rivestiti ITO da 25 mm per 37,5 millimetri. Quindi aggiungere lo 0,1% in più di DPPE rosso del Texas ai lipidi per l'imaging fluorescente. Misurare la resistenza superficiale con un multimetro per verificare che il lato rivestito ITO dei vetrini sia rivolto verso l'alto, il che è indicato da una resistenza di alcune centinaia di ohm.

Aspirare i lipidi in una siringa resistente ai solventi con l'ago della siringa che non tocca completamente la superficie ITO. Applicare lentamente il lipide muovendo l'ago avanti e indietro sul vetrino. Coprire la superficie in modo uniforme, cercando una lucentezza arcobaleno sulla superficie del vetro.

Successivamente, posizionare rapidamente i vetrini in un essiccante sottovuoto e pompare la camera a meno di un vuoto per 0,5-un'ora. Per rimuovere eventuali tracce di solvente. Rilasciare il vuoto con gas inerte.

Applicare un sottile strato di grasso siliconico su entrambi i lati di una guarnizione in silicone, quindi posizionare la guarnizione sul vetrino. Lasciare almeno cinque millimetri di vetrino scoperto esposti a un'estremità del vetrino. Quindi, idratare accuratamente ogni pozzetto posizionando un ago da siringa calibro 27 sul bordo della guarnizione e applicare lentamente il tampone riempiendo bene ogni guarnizione di circa il 10% con cumuli di tre millimolari.

Una volta che i lipidi sono idratati, procedere rapidamente attraverso i passaggi rimanenti. Poiché i film lipidici iniziano a delaminarsi, verificare immediatamente il lato conduttivo del vetrino con il multimetro. Quindi applicare la seconda faccia conduttiva della slitta ITO nella parte superiore della guarnizione.

Assicurarsi di avere almeno cinque millimetri di sporgenza all'esterno dell'area della guarnizione e di fronte alla prima sporgenza, e premere delicatamente per garantire una buona tenuta. Pulire le due sporgenze con etanolo. Ora fissa il sandwich scorrevole ITO ai contatti elettrici come barre di rame o schiuma per guarnizioni.

Questo grafico mostra una vista esplosa della camera e del gruppo di contatto come riferimento. I piani dettagliati possono essere trovati nel protocollo di testo utilizzando un multimetro. Verificare che non vi siano cortocircuiti elettrici tra i contatti e che i contatti siano collegati correttamente alle superfici ITO.

Quindi, posizionare la camera di elettroformazione in un forno e riscaldare la camera a 10 gradi Celsius al di sopra della temperatura di fusione più alta di qualsiasi dei lipidi presenti. Misurare lo spazio tra le due superfici rivestite ITO per determinare l'ampiezza dell'onda sinusoidale. L'ampiezza dell'onda sinusoidale deve essere di circa 0,7 volt RMS Per ogni millimetro di spazio tra le superfici ITO, applicare un'onda sinusoidale a 10 hertz per 60-90 minuti.

Collegare il generatore alla camera di elettroformazione e confermare la tensione con un multimetro. Dopo 60-90 minuti di elettroformazione, dovrebbero essersi formate vescicole unali giganti. Utilizzare un microscopio invertito dotato di un cubo filtrante per il colorante rosso del Texas per visualizzare i liposomi.

Il liposoma deve essere sferico, prevalentemente Ella a occhio e privo di difetti come corde che pendono dal liposoma. I passaggi precedenti hanno riguardato la classica preparazione di liposomi giganti da lipidi puri. Viene mostrata una preparazione più impegnativa con piccoli liposomi.

Successivamente, preparare una soluzione satura di carbonato di potassio con un'umidità relativa del 44% a 20 gradi Celsius. Usa un contenitore di plastica per yogurt e muesli con una tazza superiore nidificante che è stata modificata con dei fori nella tazza superiore. Mettere la soluzione salina satura e il sale in eccesso in un contenitore ben chiuso con un ripiano interno.

Riposizionare il ripiano dopo il riempimento e assicurarsi che il fluido si trovi da cinque a 10 millimetri sotto il ripiano. Posizionare un sensore di umidità in una tacca sul lato del contenitore. Pulire entrambi i lati dei vetrini rivestiti ITO con etanolo.

Utilizzare il multimetro per determinare quale lato è conduttivo ed etichettare il lato non conduttivo con il nome del campione. Quindi, ingrassare leggermente entrambi i lati di una o più guarnizioni in silicone. Posizionare il vetrino conduttivo, posizionarlo sul banco e applicare le guarnizioni in silicone su ciascun vetrino su cui verrà applicato il lipide.

Assicurarsi che ci siano almeno cinque millimetri di vetrino esposto a un'estremità per il collegamento all'apparecchio di elettroformazione. Lisciare la guarnizione per garantire una buona tenuta, diluire la preparazione della vescicola nel tampone modico iso a basso contenuto di sale a circa uno o due milligrammi per millilitro. Applicare il lipide sul vetrino in gocce da uno a 10 microlitri.

Posizionare il vetrino sul ripiano interno sopra la soluzione salina satura e sigillare bene il contenitore. Lasciare a temperatura ambiente per tre ore o tutta la notte. Il vetrino può ora essere utilizzato per l'elettroformazione di liposomi giganti come mostrato in precedenza nel protocollo classico.

Si noti l'aspetto arcobaleno dei singoli depositi. Questa immagine mostra i liposomi elettroformati da lipidi depositati dal cloroformio, le frecce puntano a liposomi giganti. Questa immagine ha pochissime aree sfocate e quindi indica una buona preparazione.

L'immagine successiva presenta molte regioni sfocate e quindi indica una preparazione generalmente scarsa. Si noti che la freccia due indica una regione con liposomi scarsamente distinguibili e che nessun liposoma può essere messo a fuoco nell'area indicata dalla freccia tre. Qui è mostrato un ingrandimento di 10 x di liposomi elettroformati con successo da lipidi depositati dalla disidratazione di piccoli liposomi.

Le frecce indicano tre liposomi di buona qualità di dimensioni variabili da circa cinque a 20 micrometri con ingrandimento 40x. Un anello chiaro può essere visto sul bordo del liposoma, che indica un liposoma unificale o quasi lombare. Le correnti ioniche TR PV one attivate dalla capsaicina registrate in chiazze di membrana lipidica asportate dai liposomi giganti formati sono raffigurate qui.

La corrente di dispersione indicava una resistenza di tenuta di 500 mega prima dell'aggiunta della capsaicina. La saturazione della capsaicina attivava una grande corrente T RRP V. La corrente ritorna al basale vicino quando la capsaicina viene lavata via dal cerotto durante il tentativo di questa procedura.

È importante rimanere flessibili poiché molti fattori influenzano il modo in cui i lipidi si disidratano e formano un film uniforme sul substrato di vetro. Consulta la nostra sezione sulla risoluzione dei problemi online e varia la temperatura, l'umidità, la concentrazione di lipidi e la dimensione delle goccioline per ottenere i migliori risultati.