Luce Preferenza Assay per studiare Innata e circadiano Photobehavior Regolamentato Drosophila Larve

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di testare il comportamento fotografico innato e circadiano della lava di drosophila mediante un test di preferenza chiaro scuro. Ciò si ottiene allevando prima le larve sperimentali in condizioni di luce e buio definite per stabilire un orologio circadiano iniziale nelle larve. Successivamente, le larve passano all'oscurità costante, che consente all'orologio circadiano larvale di correre liberamente.

Una volta raggiunta la fase di alimentazione L tre, la lava viene ordinata in gruppi per testare la loro preferenza di luce in diversi punti circadiani. Si ottengono risultati che mostrano la preferenza alla luce innata e circadiana in base al calcolo di un indice di preferenza e al confronto tra punti temporali e gruppi sperimentali. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione innata e circadiana del rilevamento della luce e sull'elaborazione del comportamento fotografico, può essere applicato anche ad altri sistemi come l'olfatto, la cassazione, la chemio, la termo taxi.

Allo stesso modo, può essere modificato per i test di apprendimento e memoria. A dimostrare la procedura saranno Alina e BMA Per laurearsi studenti del mio laboratorio Per raccogliere le uova, consentire alle mosche adulte di accoppiarsi di deporre per 12 ore su file fresche e trasferirle in nuove fiale. Continua a trasferire gli adulti ogni 12 ore per un ciclo di luce e buio di 12 ore.

Conservare le raccolte di uova per 12 ore nell'incubatrice. Per l'esperimento, allevare gli animali allo stadio precoce di L tre larve. Si tratta di lae di alimentazione disponibili da 84 a 108 ore dall'uovo.

La corretta stadiazione della LAE è fondamentale per il successo dell'esperimento. Dalla fine di L tre, LAE ha cambiato il comportamento fotografico per testare le componenti circadiane del comportamento visivo. 48 ore prima del test e poco prima delle larve soggettive, all'alba, mettere le larve raccolte in una scatola di cartone.

Quindi trasferisci la scatola in un'incubatrice al buio costante per 48 ore fino all'esperimento, queste larve devono rimanere indisturbate nel loro spazio dedicato. Preparare il coperchio di una capsula di Petri di nove centimetri utilizzando un quadrato di 20 centimetri diviso in quattro quadranti. Come guida.

Incollare quadrati di 10 centimetri di carta stagnola sui quadranti opposti e coprirli con del nastro adesivo nero. Assicurati di coprire il bordo del coperchio. Poi colla, un quadrato di 20 centimetri diviso in quattro quadranti sotto la fonte luminosa sul tavolo.

Segna la circonferenza di un piatto di prova sul foglio per fungere da guida per uno spostamento costante. Installare una lampada a LED sopra la piastra di Petri utilizzando un supporto in ferro. Regolare l'altezza in modo che l'intera piastra di prova sia illuminata in modo omogeneo.

Regolare l'intensità della luce in un sito di prova tra 350 e 760 luxe regolando ulteriormente l'altezza della lampada o utilizzando un alimentatore regolabile. La sala sperimentale ha bisogno di illuminazione a luce rossa e deve avere la stessa temperatura da cui vengono allevati gli animali. Le fiale crescevano per due giorni sotto costante oscurità.

Raccogli la lava nel loro cibo con una spatola dai primi cinque millimetri del cibo. Distribuire il cibo sul lato esterno del coperchio di una capsula di Petri. Aggiungere un po' d'acqua al cibo e mescolarlo delicatamente con la spatola.

Aggiungi una goccia di acqua del rubinetto a un nuovo piatto usando un pennello. Trasferisci le larve nella goccia d'acqua per lavarle. Quindi usa un pennello bagnato per raccogliere le larve usando il pennello bagnato.

Seleziona solo l'alimentazione precoce L tre larve ed evita di vagare tardivamente L tre larve. Trasferire le larve selezionate al centro di una piastra di prova. Alimentazione L tre larve hanno sferiche anteriori aperte e sporgenti verso l'esterno.

In una forma simile a un dito. Le sferiche posteriori hanno tre aperture ciascuna e quattro gruppi di grandi peli ramificati. Le ghiandole salivari si estendono fino al secondo segmento addominale.

Una volta posizionate 30 larve al centro della piastra di prova, coprirla con il coperchio preparato. Accendi la lampada a LED. Avvia un timer e lascia che le larve si muovano liberamente sul piatto per cinque minuti.

Quindi rimuovere rapidamente il coperchio e contare il numero di larve nei quadranti al buio e in quelli chiari. Segnare la posizione di ogni lava può facilitare il conteggio. Una fotografia veloce può anche aiutare le larve che mostrano una preferenza per la luce poco chiara, come le larve che strisciano sulle pareti o che prendono in prestito in agar, dovrebbero essere conteggiate come preferenze neutre e aggiunte al numero totale di larve quando viene calcolato l'indice di preferenza per la luce.

Dopo aver contato le larve, scartare la piastra e utilizzare una nuova piastra di prova per l'esperimento successivo. Dopo aver eseguito da 10 a 15 prove per genotipo, procedere con l'analisi seguendo il protocollo. La preferenza per la luce e il buio della lava di Canton ES è stata confrontata in due diversi tempi circadiani.

CT zero e CT 12, soggettivamente, le larve dell'alba e del tramonto gemono o gemono per 48 ore in condizioni standard e poi passano all'oscurità costante per tre giorni. I test al buio chiaro sotto i 350 luxe hanno rivelato che la fotosensibilità alla luce era più alta nelle larve testate a CT zero rispetto alle larve testate a CT 12. Usando questa formula, la preferenza per l'oscurità della lava CT zero era 0,52 rispetto a 0,36.

Le larve CT 12 che confrontano gli indici utilizzando un test di wilcoxon producono un valore P significativo di 0,023. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare la preferenza di luce della larva di trofio in diversi circuiti e punti temporali per raggiungere questo obiettivo. Dovresti essere in grado di trascinare sullo stadio F tre larve di oph, testare il loro comportamento fotofobico e calcolare l'indice di preferenza della luce per il confronto statistico.