Name: Luce Preferenza Assay per studiare Innata e circadiano Photobehavior Regolamentato Drosophila Larve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Scopri il test di preferenza luce-buio per studiare il fotocomportamento innato e circadiano nelle larve di Drosophila. Questo metodo consente di analizzare i ritmi circadiani e l'elaborazione sensoriale in neuroscienza.

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Ringraziamo i nostri colleghi presso il Dipartimento di Biologia, Università di Friburgo per fruttuose discussioni. Ringraziamo il Bloomington Stock Center per la fornitura di scorte di mosca. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Fondo nazionale svizzero (PP00P3_123339) e la Fondazione Velux per SGS

1. Allevamento larvale <ol><li> Tenere volare ceppi o incroci genetici nella cultura di massa a 25 ° C su mais pasto medio in un 12-ore di luce a 12 ore di buio in una mosca incubatore dotato di luce e timer. </li><li> Diluire sostenitore lievito in acqua per formare una pasta fluida (10 g di lievito sostenitore diluita con 3-4 ml di H 2 O distillata). Aggiungere una piccola goccia per il pasto di mais e coprire le fiale. Lasciare asciugare per almeno un&#39;ora per evitare di mosche adulte attaccare alla pasta di lievito. Mettere una piccola goccia di lievito diluito in acqua sulla superficie del cibo può migliorare ovideposizione. Alternativamente fornaio lievito pasta, acido acetico 20% (AcOH) (Sigma Aldrich, Svizzera A6283-100ml) può essere utilizzato. Per questo, immergere la punta di un Q-tip sulla soluzione e diffusione sulla superficie alimentare farina di mais. </li><li> Mettere mosche adulte (almeno quattro giorni, ma non più di dieci giorni) in farina di mais fiale alimentari. Mettere abbastanza adulti in ciascuna provetta per ottenere larve sufficiente ripetere la preferenzaprovare diverse volte e la comparazione statistica. Per incroci genetici, si utilizzano in genere un minimo di 20 femmine e maschi 5-10 per flaconcino, ma alcune linee richiediamo più femmine per ottenere un sufficiente prole larvale. </li><li> Consentire agli adulti di deporre le uova per 12 ore e trasferirle a nuove fiale. Gli adulti possono essere trasferiti al mattino e alla sera. Noi di solito trasferiamo adulti per sette-dieci giorni e se necessario prendere nuove adulti. </li><li> Mantenere le collezioni d&#39;uovo scattate ogni 12 ore in incubatrice e far crescere le larve a 25 ° C, 12 ore di luce a 12 ore di buio e 60% di umidità. Per eseguire il test per i componenti circadiani di movimento comportamento visivo larve di buio costante (DD) 48 ore dopo la raccolta delle uova (corrispondente a cicli di due-luce-buio). Per questo, utilizzare un incubatore a parte senza luce ma mantenere tutte le altre condizioni quali la temperatura e l&#39;umidità identici. Accertarsi di trasferire le fiale al DD incubatrice poco prima del passaggio alla fase di buio. Prima di spostare le fiale di another incubatore messo fiale in una scatola di cartone o di avvolgere i flaconcini con un foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce durante il trasferimento (imballaggio in scatole di cartone o imballaggio deve essere fatto durante la &quot;luci-on fase&quot; prima del passaggio tra incubatori). Evitare che gli animali da qualsiasi esposizione alla luce dopo questo punto e fino a inizio esperimenti. </li><li> Dopo 4 giorni (84-108 ore dalla deposizione delle uova) raccogliere presto L3 (alimentazione larve) ai punti di tempo per essere testato (vedi 4. Leggera preferenza prova, punto. 4.4.). </li></ol> 2. Configurazione di test <ol><li> Effettuare esperimenti in una stanza buia con temperatura costante e umidità. </li><li> Per mantenere due quadranti della piastra Petri nelle tenebre, coprire il coperchio con del nastro bianco e un foglio di alluminio. Per fare così, segnare il centro della circonferenza coperchio. Anche segnare quattro punti nel bordo del coperchio con 90 ° di separazione fra loro. Per rendere più facile, disegnare un quadrato 20 centimetri diviso in quattro quadranti di 10 cm di lunghezza su unfoglio di carta o con l&#39;aiuto di un computer. Tagliare 10 centimetri quadrati di carta stagnola e nastro nero (Figura 1A). Coprire due quadranti opposti incollando un quadrati di foglio di alluminio, come primo strato e il nastro nero che copre esso, fare attenzione a coprire anche il bordo del coperchio. In passato sono stati utilizzati due forme leggermente differenti di questo test. Noi qui usiamo il saggio &quot;quarter-plate&quot;, in cui il piatto Petri è diviso in quattro quarti uguali 10. Nel saggio &quot;half-plate&quot; alternativa la piastra di Petri è diviso metà (metà esposto alla luce, metà in oscurità) 1,7,8. Fino ad oggi, senza differenze significative tra i due dosaggi è stato pubblicato. </li><li> Colla un foglio quadrante come quello utilizzato per marcare i coperchi proprio sotto la sorgente luminosa sul tavolo. Contrassegnare la circonferenza di un piatto Petri centrata sull&#39;intersezione quadranti. Utilizzare i contrassegni come riferimento per posizionare la piastra di prova sempre nella stessa posizione sotto la sorgente di luce. </li><li> Installare unlampada, o una semplice lampadina bianca (Phillips, Soft tone 5W) o di una lampada a LED (lampada LED, 80012 Bianco, Osram) al di sopra della piastra di Petri con l&#39;aiuto di un cavalletto di sostegno in ferro (Fisher Scientific, S47808). Regolare l&#39;altezza in modo che l&#39;intera piastra di prova viene illuminata in modo omogeneo. Si consiglia vivamente l&#39;utilizzo di lampade LED dal momento che emettono le lunghezze d&#39;onda più specifici rispetto alle tradizionali lampadine. Inoltre LED emettono meno calore. </li><li> Regolare l&#39;intensità della luce con l&#39;aiuto di un fotometro (Ambiente PCE EM882). Per raggiungere l&#39;intensità luminosa necessaria di 350-760 lux, la lampada spostare su o giù come richiesto. Collegare la lampada ad un alimentatore regolabile maggiore versatilità per cambiare intensità senza spostare la lampada (Figura 1B). </li></ol> 3. Piatti Preparazione <ol><li> Fare 200 ml di agar 2,5% (Sigma-Aldrich, Svizzera A5093-500G) con acqua bidistillata (Millipore). </li><li> Porre piastre Petri su un tavolo (90 mm di diametro;Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria) in file per consentire versando caldo agarosio. </li><li> Bollire l&#39;agarosio in un forno a microonde fino a quando la soluzione è completamente trasparente e fluida. Assicurarsi che la soluzione liquida non contiene bolle. ATTENZIONE: Trasporti con attenzione la tabella poiché la soluzione può essere molto caldo! </li><li> Versare agarosio caldo in piastre Petri finché l&#39;intera superficie viene omogeneamente ricoperta con un sottile strato di soluzione, circa due o tre millimetri sono sufficienti. Sii veloce per evitare di agarosio solidificare prima di tutte le lastre di rivestimento. Lasciate raffreddare le piastre. Conservare le piastre a temperatura ambiente e utilizzarle solo lo stesso giorno della preparazione. </li></ol> 4. Test di preferenza Luce <ol><li> Operare in condizioni di luce rosso in camera esperimento di impedire l&#39;influenza della luce prima della prova Drosophila poiché non è in grado di percepire le lunghezze d&#39;onda di luce rossa. Utilizzare una lampadina rossa (Phillips, PFE712E * 8) montato in una lampada per illuminare tha posto per lavorare. </li><li> Mantenere la temperatura in tutti gli esperimenti a 25 ° C. Controllo della temperatura ambiente mediante un dispositivo di riscaldamento o di raffreddamento, se necessario. </li><li> Prendete un po &#39;di cibo dai flaconi allevati per cicli di due giorni in buio costante (da sezione 1). Poiché larve sono solitamente scavando sulla superficie del cibo, prendere lo strato più elevato (circa 5 mm di profondità) con l&#39;aiuto di una spatola (Fisher Scientific, 14-373-25A). Distribuire il cibo sul lato esterno di un piatto coperchio Petri, aggiungere un po &#39;d&#39;acqua e mescolare delicatamente con la spatola. </li><li> Raccogliere alimentazione L3 larve dal cibo. Come preferenza luce sarà testato, scegliendo solo all&#39;inizio / nutrire le larve L3 è di fondamentale importanza in quanto la fototassi negativo è assicurato. Tardo / errante L3 larve o grande larva strisciando sul cibo presumibilmente già acceso il loro photobehavior. Nutrire larve L3 (phototactic negativo) può essere riconosciuto perché i loro spiracoli anteriori sono aperte e sporgenti verso l&#39;esterno in una forma di dita. Il spiracle posteriores hanno tre aperture ciascuno, e quattro gruppi di grossi peli ramificati. Le ghiandole salivari estendono al secondo segmento addominale 11. Messa in scena di larva al microscopio è conveniente, mentre nessuna luce bianca deve essere usato. Una lampada spia rossa è necessario illuminare le larve, se messa in scena sotto microscopio stereoscopico prima è richiesto esperimenti. </li><li> Lavare larve rapidamente in acqua corrente e raccogliere precoce alimentazione larve di terza instar (ancora in luce rossa). Prima di trasferire le larve alla piastra di prova, prendere le larve con un pennello bagnato e assorbire accuratamente l&#39;acqua in eccesso con un tovagliolo di carta o carta da filtro. Non asciugare larve troppo eccessivamente in quanto potrebbe danneggiare l&#39;animale e influenzare il suo comportamento. </li><li> Utilizzando il pennello bagnato trasferire accuratamente le larve di piatti. Posizionare un gruppo di circa 30 larve al centro della piastra. Coprire la piastra con il coperchio già preparato con i quadranti e impostare la piastra sotto la sorgente di luce pronto per l&#39;esperimento (vedi sezzione 2). </li><li> Accendere la lampada luce bianca e avviare il timer. Lasciare la larva muoversi liberamente sulla piastra per 5 minuti, quindi rimuovere rapidamente il coperchio e contare il numero di larve al buio e nei quadranti luminosi. Marcare la posizione di ogni larva con un pennarello può facilitare il conteggio. In alternativa, fare una foto del piatto e contare a posteriori. Larve mostrando preferenza luce poco chiara, come larve strisciando sulle pareti o scavare nel agar deve essere considerato come preferenza neutro e solo essere incluso nel numero totale di larve quando l&#39;indice preferenza luce viene calcolato. </li><li> Dopo il conteggio, scartare la piastra con larve e sostituirla con una nuova piastra di prova per il prossimo esperimento. Raccogliere lastre utilizzate in un sacchetto di plastica autoclave per la manipolazione e lo smaltimento tardi. </li><li> Dopo aver eseguito un numero sufficiente di esperimenti di un nuovo genotipo può essere testata. 10-15 prove per genotipo sono sufficienti per l&#39;analisi. </li></ol> 5. L&#39;analisi des <ol><li> Per comodità di trasferire i dati ad un modulo dati in Excel (Microsoft) o Origine (Origin Lab) su un computer per ulteriori analisi statistiche. Disporre in una colonna il numero di animali in buio, in una seconda colonna il numero di animali in quadranti luce e nella terza il totale degli animali nella piastra (comprese larve &quot;neutro&quot;). </li><li> Calcolare l&#39;indice di preferenza (PREF) per il buio per ciascun esperimento utilizzando la seguente formula: PREF (buio) = (numero di larve nel buio - numero di larve di luce) / numero totale delle larve </li><li> Confrontare statisticamente un insieme di dati con un&#39;analisi appropriata per gruppi. Qui, usiamo un test di Wilcoxon per confrontare statisticamente due gruppi. Un test ANOVA con multiple-confronto di un Tukey post hoc test può essere fatto, se normale ipotesi di distribuzione si compie in un confronto di gruppo collettore. </li><li> Fai i grafici che mostrano chiaramente i confronti tra linee e punti di tempo lungo il ciclo giorno. We l&#39;uso del software Origin (Origine Lab) per testare la significatività statistica e generare grafici appropriati, ma qualsiasi altro software di statistica può essere utile. </li></ol>

<ol><li>Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+genetic+analysis+of+Drosophila+melanogaster+photobehavior+during+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development.</a> J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).</li>
<li>Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+and+larval+photoreceptors+use+different+mechanisms+to+specify+the+same+Rhodopsin+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates.</a> Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).</li>
<li>Sprecher, S. G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+of+rhodopsin+expression+in+terminally+differentiated+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons.</a> Nature. 454, 533-537 (2008).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Diaz, N. N., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors%3A+unconventional+ways+of+seeing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors: unconventional ways of seeing.</a> Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).</li>
<li>Emery, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+CRY+is+a+deep+brain+circadian+photoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor.</a> Neuron. 26, 493-504 (2000).</li>
<li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45, 293-300 (2005).</li>
<li>Keene, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+visual+pathways+mediate+Drosophila+larval+light+avoidance+and+circadian+clock+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment.</a> J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).</li>
<li>Gong, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Pairs+of+Neurons+in+the+Central+Brain+Control+Drosophila+Innate+Light+Preference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference.</a> Science. 330, 499-502 (2010).</li>
<li>Lilly, M., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((smellblind%3A+a+gene+required+for+Drosophila+olfaction%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">smellblind: a gene required for Drosophila olfaction.</a> Genetics. 124, 293-302 (1990).</li>
<li>Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBodenstein%2C+D+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. Demerec, M. , John Wiley & Sons. 275-367 (1950).</li>
<li>Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPittendrigh%2C+CS+%22Biological+Rhythms%22">Biological Rhythms</a>. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, Plenum. 95-124 (1981).</li>
<li>Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balance+of+Activity+between+LN%28v%29s+and+Glutamatergic+Dorsal+Clock+Neurons+Promotes+Robust+Circadian+Rhythms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila.</a> Neuron. 74, 706-718 (2012).</li>
<li>Keene, A. C., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+light%3A+photobehavior+in+fruit+fly+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae.</a> Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).</li>
<li>von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+visual+classical+conditioning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae.</a> Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il test di preferenza luce descritta sfrutta l&#39;innata photobehavior larvale. Il test è facile da stabilire, permette molte ripetizioni a basso costo e fornisce preziose informazioni di rilevamento e di elaborazione della luce. Il paradigma sperimentale consente relativamente rapida quantificazione di quanti individui preferiscono chiaro o scuro. Tale preferenza può essere visualizzato come percentuale del greggio o in alternativa come Indice di Preferenza (PREF). Il PREF è espresso come differenza di animali che luc...

Qui si descrive un test comportamentale basato sulla preferenza delle larve per scuro (o chiaro). Larve reagire con una risposta photonegative forte e stereotipie durante le fasi di foraggiamento (da L1 a L3 presto) 1. Il saggio è volto a valutare il comportamento photophobic della larva e confronta la preferenza chiaro o scuro di un gruppo di larve di muoversi liberamente in una capsula di Petri rivestito con agar. Questa analisi comportamentale fornisce non solo informazioni sulla sensibilità, l&#39;integrazione e temporale plasticità del sistema visivo, fornisce ulteriori suggerimenti su come sensibilità alla luce e il suo processo è controllato dal sistema circadiano. Il larvale occhio Drosophila (anche chiamato Organo Bowlig; BO), è il principale organo per la percezione della luce. Ogni occhio è composto da 12 fotorecettori (PR), otto PR esprimono il verde-sensibile rhodopsin6 (rh6) e quattro PR esprimere il blu-sensibile rhodopsin5 (RH5) 2,3. Oltre a PR, also di classe IV neuroni multidendritic, che coprono la parete del corpo larvale, sono stati identificati per rispondere alle nocivi intensità di luce 4,5. È anche noto che i neuroni pacemaker situati nel cervello larvale centrale esprimono la proteina sensibile alla luce Cryptochrome (Cry) che funge da sensore di luce blu orologio intrinseca all&#39;interno del cervello 6,7. Curiosamente photophobicity di animali di tipo selvatico mostra un componente circadiana a tempi diversi durante il corso del giorno e della notte durante il test con questo saggio. Le risposte alla luce di foraggiamento L3 larva hanno mostrato forte photophobicity all&#39;alba e photophobicity inferiore al crepuscolo durante il test di preferenza luce-buio 7. È interessante notare che solo RH5-PR sono necessari per evitare la luce, mentre Rh6-PR sono superflui. Entrambi, RH5-PR e Rh6-PR sono coinvolti nella regolazione dell&#39;orologio molecolare dalla luce 8. Il percorso Cry deve essere coordinata con gli altri percorsi di rilevazione della luce di orchestrare un appropriato uscita comportamentale nelcorso della giornata. Acetilcolina nel PR gioca un ruolo essenziale nel comportamento di evitamento luce così come trascinamento dell&#39;orologio molecolare. Blocco acetilcolina neurotrasmissione da PR a neuroni pacemaker circadiano riduce la risposta fotofobica nella preferenza saggio luce-oscurità 8. Impiegando lo stesso saggio, due coppie simmetriche di neuroni sono state recentemente identificate per commutare la preferenza luce del terzo stadio larvale di Drosophila 9. Queste due coppie di neuroni può essere funzionante durante ultime fasi larvali, quando gli animali lasciano il cibo per trovare presumibilmente un sito pupariation appropriato. Tuttavia, la questione di come le vie visive interagiscono e controllano il comportamento visivo larvale in modo circadiano rimane in gran parte senza risposta. Il saggio di preferenza luce consente confronti tra momenti circadiani, volano linee e statali circadiano con diverse qualità di luce. Il saggio è facilmente preparato e poco costoso ed è stato utile in precedenza in diversi laboratori per descrivere e studiare il comportamento derivato luce nella larva.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5093-500G</td><td>2,5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Svizzera </td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>633180</td><td>diametro 90 mm; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria</td></tr><tr><td>Lampada LED</td><td>OSARAM</td><td>80012 Lampada</td><td>LED bianca, 80012 Misuratore</td></tr><tr><td>ambientale</td><td>bianco PCE</td><td>PCE EM882</td><td>Lux, Temp, RH%</td></tr><tr><td>Armadio termostatico</td><td>Aqua Lytic (Liebherr)</td><td>ET636-6</td><td></td></tr><tr><td>Timer luce</td><td>Timer T</td><td>6185.104</td><td>230V/50HZ (verificare le specifiche per il proprio paese)</td></tr><tr><td>Universale termostato</td><td>Conrad</td><td>UT200</td><td></td></tr><tr><td>Umidificatore</td><td>Boneco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nastro nero</td><td>Tesa</td><td></td><td>5 cm </td></tr><tr><td>Colla</td><td>Uhu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lncubatore lampada</td><td>Phillips</td><td>Softtone</td><td>5W</td></tr><tr><td>Timer</td><td>orologio Ziliss Ziliss</td><td></td><td>, Svizzera</td></tr><tr><td>Excel Software</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Excel</td></tr><tr><td>Origin Software 8.5</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Backer Lievito</td><td>Migros Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Supporto in ferro 17X28CM</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47808</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283-100ML</td><td>20% acido acetico diluito in H2O</td></tr><tr><td>Lampada a luce rossa</td><td>Phillips</td><td>PFE712E*8C</td><td></td></tr><tr><td>Spatola </td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-25A</td><td></td></tr><tr><td>Alimentazione</td><td>EA</td><td>EA PS 2042-06B</td><td>Foglio di</td></tr><tr><td>alluminio</td> opzionale <td>Prix Coop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heater</td><td>GOON</td><td>NSB200C</td><td></td></tr><tr><td>Forno a microonde</td><td>Intertronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard farina di mais cibo per mosche</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acqua </td><td>distillata</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

luce preferenza assay per studiare innata e circadiano photobehavior regolamentato<em&gt; drosophila</em&gt; larve

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Atti luce come segnale ambientale per controllare il comportamento degli animali a vari livelli. Il sistema nervoso Drosophila larvale è usato come un modello unico per rispondere alle domande di base su come le informazioni luce viene elaborato e condiviso tra i comportamenti rapidi e circadiano. Visualizzare larve di Drosophila un comportamento di evitamento stereotipata quando esposti alla luce. Per studiare i comportamenti crepuscolare relativamente semplici test preferenza luce-buio possono essere applicati. Nei vertebrati e artropodi i percorsi neurali coinvolti nella rilevazione ed elaborazione input visivi si sovrappongono parzialmente a quelle di elaborazione photic informazioni circadiano. La questione affascinante di come il sistema di rilevamento della luce e il sistema circadiano interagiscono per mantenere uscite comportamentali coordinati rimane largamente inesplorato. Drosophila è un modello impatto biologico affrontare questi problemi, a causa di un piccolo numero di neuroni nel cervello e la disponibilità di strumenti genetici per MANIPUL neuronalezione. Il saggio di preferenza chiaro-scuro presentato consente l&#39;indagine di una serie di comportamenti visivi tra cui il controllo circadiano di fototassi.

Seguendo il protocollo descritto in precedenza, abbiamo testato la preferenza chiaro-scuro nei primi mesi del terzo stadio larvale di tipo selvatico Canton-S vola a due diversi tempi circadiani CT0 e CT12. Adulti sono stati allevati 12 ore di luce a 12 ore buio e lasciati a deporre le uova per 12 ore. Le larve crescono i primi due giorni sotto lo stesso regime di chiaro-scuro. Dal momento che abbiamo voluto testare la modulazione circadiana in condizioni costanti (free running dell&#39;orologio circadiano), larve sono s...

Qui si descrive un test di preferenza chiaro-scuro per Drosophila larva. Questo test fornisce informazioni sulla regolazione innata e circadiano di luce di rilevamento ed elaborazione photobehavior.

Luce Preferenza Assay per studiare Innata e circadiano Photobehavior Regolamentato<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è testare il comportamento fototattico innato e circadiano delle larve di drosophila mediante un test di preferenza luce-buio. Questo viene ottenuto allevando innanzitutto le larve sperimentali in condizioni definite di luce e buio per stabilire un orologio circadiano iniziale nelle larve. Successivamente, le larve vengono trasferite in condizioni di buio costante, il che permette all'orologio circadiano larvale di funzionare in libera oscillazione.Una volta raggiunta la fase di alimentazione L3, le larve vengono suddivise in gruppi per testare la loro preferenza per la luce in diversi punti temporali circadiani. I risultati ottenuti mostrano una preferenza innata e circadiana per la luce, calcolata mediante un indice di preferenza e confrontando i diversi punti temporali e i gruppi sperimentali. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla regolazione innata e circadiana della percezione della luce e dell'elaborazione del comportamento fototattico, può essere applicato anche ad altri sistemi, come l'olfatto, la cessione, la chemotassi e la termotassi.Allo stesso modo, può essere modificato per test di apprendimento e memoria. A dimostrare la procedura saranno Alina e BMA, studenti di dottorato del mio laboratorio. Per raccogliere le uova, lasciare che gli adulti si accoppino e depongano per 12 ore su alimenti freschi, quindi trasferirli in nuove provette. Continuare a trasferire gli adulti ogni 12 ore in un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio.Mantenere le raccolte di uova di 12 ore nell'incubatrice. Per l'esperimento, allevare gli animali fino allo stadio larvale L3 precoce. Queste sono larve alimentate disponibili da 84 a 108 ore dall'uovo.La corretta selezione dello stadio di sviluppo degli LAE è fondamentale per il successo dell'esperimento. Poiché in fase tardiva di L3, gli LAE modificano il comportamento visivo per testare i componenti circadiani del comportamento visivo, 48 ore prima del test e poco prima dell'alba soggettiva delle larve, inserire le larve raccolte in una scatola di cartone.Quindi trasferire la scatola in un incubatore a luce costante per 48 ore fino all'esperimento, durante le quali le larve devono rimanere indisturbate nel loro spazio dedicato. Preparare il coperchio di una piastra di Petri da nove centimetri utilizzando un quadrato da 20 centimetri suddiviso in quattro quadranti. Come guida.Incollare quadrati di 10 centimetri di carta d'alluminio su quadranti opposti e coprirli con nastro nero. Assicurarsi di coprire il bordo del coperchio. Successivamente, incollare un quadrato di 20 centimetri diviso in quattro quadranti sotto la sorgente luminosa sul tavolo.Segnare la circonferenza di una piastra di prova sul foglio, in modo da avere una guida per uno spostamento costante. Installare una lampada LED sopra la piastra di Petri utilizzando un supporto in ferro. Regolare l'altezza in modo che l'intera piastra di prova sia illuminata in modo omogeneo.Regolare l'intensità della luce in un sito di prova tra 350 e 760 lux regolando ulteriormente l'altezza della lampada o utilizzando un alimentatore regolabile. L'ambiente dell'esperimento deve essere illuminato con luce rossa e deve avere la stessa temperatura del luogo in cui gli animali vengono allevati. I viall sono stati allevati per due giorni in oscurità costante.Raccogliere la lava nel loro cibo con una spatola dai primi cinque millimetri del cibo. Distribuire il cibo sulla faccia esterna del coperchio di una piastra di Petri. Aggiungere dell'acqua al cibo e mescolare delicatamente con la spatola.Aggiungere una goccia di acqua del rubinetto in una nuova piastra utilizzando un pennello. Trasferire le larve nella goccia d'acqua per lavarle. Quindi utilizzare un pennello bagnato per raccogliere le larve.Selezionare esclusivamente le larve L3 in fase iniziale di alimentazione ed evitare le larve L3 in fase avanzata di erranza. Trasferire le larve selezionate al centro di una piastra di prova. Le larve L3 in fase di alimentazione presentano sferoidi anteriori aperti e protrusi verso l'esterno.In forma simile a un dito. Le sfere posteriori hanno ciascuna tre aperture e quattro gruppi di peli ramificati di grandi dimensioni. Le ghiandole salivari si estendono fino al secondo segmento addominale.Dopo aver posizionato 30 larve al centro della piastra di prova, coprirla con il coperchio preparato. Accendere la lampada a LED. Avviare un timer e lasciare che le larve si muovano liberamente sulla piastra per cinque minuti.Quindi rimuovere rapidamente il coperchio e contare il numero di larve nei quadranti scuro e illuminato. Segnare la posizione di ciascuna larva può facilitare il conteggio. Anche una rapida fotografia può essere utile. Le larve che mostrano una preferenza luminosa incerta, come quelle che si muovono sui bordi o che si immergono nell'agar, devono essere considerate con preferenza neutra e aggiunte al numero totale di larve quando viene calcolato l'indice di preferenza per la luce.Dopo aver contato le larve, scartare la piastra e utilizzare una nuova piastra per il successivo esperimento. Dopo aver effettuato da 10 a 15 prove per ogni genotipo, procedere con l'analisi seguendo il protocollo. La preferenza per la luce e il buio di larve Canton ES è stata confrontata in due diversi momenti circadiani.CT zero e CT 12, soggettivamente, larve all'alba e al crepuscolo o brontolano per 48 ore in condizioni standard e poi passano a buio costante per tre giorni. Il test luce-buio a 350 lux ha rivelato che la fotosensibilità alla luce era maggiore nelle larve testate a CT zero rispetto a quelle testate a CT 12. Utilizzando questa formula, la preferenza per il buio delle larve a CT zero era di 0,52 rispetto a 0,36.I valori P significativi di 0,023 derivano dal confronto degli indici nei larve CT 12 mediante un test di Wilcoxon. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come testare la preferenza per la luce nei larve trof in diversi circuiti e punti temporali rispetto a questo obiettivo. Dovresti essere in grado di sincronizzare larve oph allo stadio F3, testare il loro comportamento fotofobico e calcolare l'indice di preferenza per la luce ai fini del confronto statistico.

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