Lunghezza dei telomeri e telomerasi attività; Un Yin e Yang di senescenza cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un metodo rapido, accurato ed economico per valutare la lunghezza dei telomeri e l'attività telomerica in diversi tessuti e specie. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il DNA genomico per la determinazione della lunghezza dei telomeri mediante PCR quantitativa in tempo reale. Il secondo passaggio consiste nell'isolare e lisiare le cellule dello stesso tessuto in un buffer che preserva la funzione della telomerasi e nel misurare quantitativamente la telomerasi utilizzando la PCR in tempo reale.

In definitiva, sia la determinazione della lunghezza dei telomeri che il rilevamento dell'attività telomerasica vengono utilizzati per individuare le relazioni tra la lunghezza dei telomeri e la senescenza cellulare, i possibili meccanismi di accorciamento telomerico e le risposte al recupero in condizioni di invecchiamento e di proliferazione cellulare. Ho conosciuto per la prima volta questi metodi quando stavo cercando un modo rapido e semplice per misurare le lunghezze dei telomeri e l'attività telomerasica. L'applicazione di questa tecnica ha implicazioni nella diagnosi di malattie associate all'età e di morte precoce, poiché fornisce informazioni sullo stato cellulare, che riflette le condizioni degli organi e lo stato generale del corpo.

La dimostrazione di questa procedura sarà effettuata dal Sig. Ur Bogo, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare la procedura, isolare il DNA dal sangue del soggetto utilizzando il kit Qiagen DNE, appositamente formulato per campioni ematici nell'ultimo passaggio. Eluire il DNA in acqua di grado PCR e misurare la concentrazione mediante spettrofotometro.

Successivamente, preparare i primer PCR di riserva come descritto da OC Callahan et al. per il gene singolo copia o controllo SCG e per i telomeri, diluendoli a 100 picomoli per microlitro. Utilizzando acqua di grado PCR durante la reidratazione dei primer, preparare diluizioni seriali del DNA isolato. Iniziare diluendo il DNA di riserva con acqua di grado PCR fino a una concentrazione iniziale di 6,1 nanogrammi per microlitro per le reazioni sui telomeri e di 1,8 nanogrammi per microlitro.

Per le reazioni SCG, lasciare riposare il diluizione per almeno 15 minuti prima di passare alla successiva. Dopo 15 minuti, preparare la successiva diluizione secondo la tabella mostrata qui. Ripetere questo procedimento per ciascuna diluizione elencata.

Successivamente, preparare le reazioni PCR in una piastra PCR standard. Ogni campione, insieme ai controlli SCG, viene eseguito in triplice replicato. Aggiungere prima sei microlitri di acqua di grado PCR in ogni pozzetto, quindi aggiungere 10 microlitri della miscela di reazione cyber green.

Aggiungere quindi i primer nelle quantità indicate qui di seguito nei rispettivi pozzetti. Successivamente, diluire ulteriormente un'aliquote di ciascun primer stock con acqua di grado PCR di dieci volte, in modo da ottenere una concentrazione finale di 10 picomoli per microlitro. Infine, aggiungere due microlitri del DNA diluito in serie nei rispettivi pozzetti e coprire la piastra con un foglio di plastica adesiva per sigillarne il contenuto.

Quindi posizionare la piastra nel termociclatore in tempo reale. Successivamente, impostare un programma sul Roche LightCycler 480, iniziando con una denaturazione di 10 minuti a 95 gradi Celsius, seguita da cicli di 95 gradi Celsius per 10 secondi, 60 gradi Celsius per 5 secondi e 72 gradi Celsius per 11 secondi.

Per un totale di 50 cicli, eseguire le misurazioni con il cyber green dopo ogni ciclo. Successivamente, avviare il programma una volta completato il termociclatore. Impostare la linea CT all'inizio della curva esponenziale e registrare i valori dei cicli corrispondenti al momento in cui ciascun campione attraversa la linea di soglia.

Successivamente, calcolare il rapporto tra i numeri di cicli dei campioni di telomero e di quelli del gene a copia singola. Poiché il telomero presenta numerose regioni che si amplificano in ogni ciclo, i valori di CT del telomero saranno inferiori rispetto al numero di copie del gene singolo, determinando un rapporto inferiore a uno. Infine, calcolare la lunghezza del telomero in base ai lavori di Terry Etal, in cui un'unità di rapporto tra telomero e copia singola del gene corrisponde a una lunghezza media del telomero di 4.270.

Le coppie di basi nei leucociti eseguono misurazioni dell'attività telomerasica utilizzando il dosaggio quantitativo della telomerasi di Allied Biotech. Per iniziare le misurazioni, raccogliere da 10 alla quinta a 10 alla sesta cellule del sangue periferico e lavarle in PBS. Quindi centrifugare a 500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, risospendere il pellet in 200 microlitri di buffer di lisi 1x del kit dell'assay e incubare sul ghiaccio per 30 minuti.

Al termine dell'incubazione, centrifugare i campioni a 12.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Per formare il pellet dei detriti cellulari, trasferire 160 microlitri del soprannatante ottenuto in un tubo nuovo e congelare rapidamente il soprannatante rimanente in un bagno di etanolo e ghiaccio secco, quindi conservarlo a meno 80 gradi Celsius per utilizzi successivi. Successivamente, determinare la concentrazione proteica del soprannatante mediante saggio BCA standard.

Per ogni campione raccolto, calcolare la quantità di proteina necessaria per il saggio in base al range di lavoro del kit per telomerasi. Poiché la telomerasi è un enzima sensibile al calore, inattivare per calore metà di ciascun campione da utilizzare come controllo negativo mediante incubazione a 85 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, preparare la curva standard quantitativa mediante diluizioni seriali del campione stock.

Diluire la soluzione stock degli oligonucleotidi TSR di cinque volte in un rapporto uno a cinque utilizzando il tampone di lisi. Gli oligonucleotidi TSR hanno una sequenza identica ai primer telomerici e una concentrazione nota. Successivamente, preparare il mix master costituito da 12,5 microlitri di premix di rilevamento quantitativo della telomerasi 2x e da 11,5 microlitri di acqua di grado PCR per campione, quindi mescolare.

Quindi pipettare 24 microlitri del mix master in ogni tubo utilizzato. Una volta dispensato il mix master, aggiungere un microlitro di ciascun template costituito da un campione standard, da un campione attivato per riscaldamento o da un campione normale nelle pozzette. Successivamente, sigillare la piastra con un foglio di plastica adesivo e mescolare i campioni mediante vortex.

Quindi posizionarli nel sistema di rilevamento PCR in tempo reale. Impostare il programma PCR in modo che inizi a 25 gradi Celsius per 20 minuti. Durante questo periodo, avverrà la reazione della telomerasi.

Successivamente, eseguire 95 gradi Celsius per 10 minuti per la fase iniziale di attivazione della PCR. Quindi, eseguire 40 cicli di 95 gradi Celsius per 30 secondi, 60 gradi Celsius per 30 secondi e 72 gradi Celsius per 30 secondi, al fine di amplificare i modelli di telomero aggiunti durante i 20 minuti a 25 gradi Celsius.

Infine, eseguire il programma e raccogliere i valori del ciclo soglia per ciascun campione. Quindi generare una curva standard utilizzando i valori di CT e utilizzarla per calcolare l'attività della telomerasi. Nei campioni mostrati.

Di seguito sono riportati i risultati della PCR in tempo reale di un soggetto di 65 anni. Il gene telomerico, rappresentato dalle linee rosso brillante, raggiunge la sua curva esponenziale dopo circa 27 cicli. Il secondo insieme di linee rappresenta l'amplificazione del gene monocopia, presente con un'unica copia nel genoma, e pertanto con un numero inferiore di copie rispetto ai campioni telomerici rappresentati dalle linee rosse.

Inoltre, il gene presente in un'unica copia raggiunge la fase esponenziale dopo circa 31 cicli. Le linee marroni rappresentano la curva standard di 33 punti basata su una diluizione seriale di concentrazioni note del campione. La curva standard del logaritmo della concentrazione rispetto ai valori di soglia è mostrata qui.

Una linea retta conferma che la diluizione in serie è stata misurata e caricata con precisione. I risultati dell'analisi di PCR in tempo reale vengono quindi utilizzati per stimare la lunghezza dei telomeri. Un'unità di rapporto tra telomero e singolo copia genica equivale a una lunghezza media dei telomeri di 4.270 paia di basi nei leucociti e, da questi dati, risulta un rapporto di 0,87, corrispondente a una media di 3.715 paia di basi e a una lunghezza intermedia per una persona di questa età.

Utilizzando i risultati ottenuti con i saggi di PCR quantitativa in tempo reale, è possibile chiarire una relazione tra l'attività dei telomeri e il rapporto tra telomeri e copie singole di un gene. Questo grafico mostra una forte correlazione tra i due saggi dopo lo sviluppo della tecnica. Tale metodo ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'invecchiamento per esplorare la senescenza cellulare in organismi modello, demografie dei pazienti e sistemi organici.