Lunghezza dei telomeri e telomerasi attività; Un Yin e Yang di senescenza cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un metodo breve, accurato ed economico per valutare la lunghezza dei telomeri e l'attività dei telomeri in più tessuti e specie. Ciò si ottiene isolando prima il DNA genomico per la determinazione della lunghezza dei telomeri utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale. Il secondo passo consiste nell'isolare e limare le cellule dello stesso tessuto in un tampone che preserva la funzione della telomerasi e misurare quantitativamente la telomerasi utilizzando la PCR in tempo reale.

In definitiva, sia la determinazione della lunghezza dei telomeri che il rilevamento dell'attività della telomerasi vengono utilizzati per trovare le relazioni tra la lunghezza dei telomeri e la senescenza cellulare, i possibili meccanismi di accorciamento dei telomeri e le risposte di recupero all'invecchiamento e agli stati di proliferazione cellulare. Sono stato introdotto per la prima volta a questi metodi quando cercavo un modo semplice e veloce per misurare le lunghezze e l'attività di omera. L'implicazione di questa tecnica si estende verso la diagnosi di malattie associate all'età e morte prematura perché riporta lo stato cellulare, che si riflette sulla condizione dell'organo e sulla forma generale del corpo.

A dimostrare questa procedura sarà il Sig. Ur Bogo, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, isolare il DNA dal sangue del soggetto utilizzando il kit Qiagen DNE, specificamente formulato per le fonti di sangue nella fase finale. Eluire il DNA in acqua di grado PCR e misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro.

Successivamente, preparare i primer PCR stock come descritto da OC Callahan et al per il gene a copia singola o controllo SCG e per i telomeri diluendoli a 100 picomoli per microlitro. Utilizzando acqua di grado PCR mentre i primer si reidratano, preparare diluizioni seriali del DNA isolato. Inizia diluendo il DNA stock con acqua di grado PCR a una concentrazione massima di 6,1 nanogrammi per microlitro per le reazioni dei telomeri e 1,8 nanogrammi per microlitro.

Per le reazioni SCG, lasciare riposare la diluizione per un minimo di 15 minuti prima di passare a quella successiva. Dopo 15 minuti, preparare la diluizione successiva secondo la tabella riportata qui. Ripetere l'operazione per ogni diluizione elencata.

Quindi, impostare le reazioni PCR in una piastra PCR standard. Ogni campione, insieme ai controlli SCG, viene eseguito in triplice copia. Per prima cosa, aggiungere sei microlitri di acqua di grado PCR a ciascun pozzetto, quindi aggiungere 10 microlitri della miscela di reazione cyber green.

Quindi aggiungere i primer nelle quantità mostrate qui ai rispettivi pozzetti. Successivamente, diluire ulteriormente un'aliquota di ciascuno dei primer stock con acqua di grado PCR dieci volte in modo che la concentrazione finale sia di 10 picomoli per microlitro. Infine, aggiungere due microlitri di DNA diluito in serie nei rispettivi pozzetti e coprire la piastra con un foglio di plastica adesivo per sigillare il contenuto.

Quindi posizionare la piastra nella macchina per PCR in tempo reale. Successivamente, preparare un programma sul Light Cycler Roche four 80, iniziando con una denaturazione di 10 minuti. Passa a 95 gradi Celsius, quindi pedala a 95 gradi Celsius per 10 secondi, 60 gradi Celsius per cinque secondi e 72 gradi Celsius per 11 secondi.

Per un totale di 50 cicli, eseguire misurazioni del verde cibernetico dopo ogni ciclo. Quindi, iniziare il programma una volta completato il termociclatore. Impostare la linea CT all'inizio della curva esponenziale e registrare i valori del ciclo a partire dal momento in cui ogni campione supera la linea di soglia.

Successivamente, calcola il rapporto tra i numeri di ciclo tra i telomeri e i campioni di gene a copia singola. Poiché il telomero ha più regioni, che si amplificheranno in ogni ciclo, i valori CT dei telomeri saranno inferiori al numero di copie del singolo gene, risultando in una razione inferiore a uno. Infine, calcola la lunghezza dei telomeri in base al lavoro di Terry Etal, dove un telomero per singola unità di razione di copia genica equivale a una lunghezza media dei telomeri di 4.270.

Le coppie di basi nei leucociti eseguono misurazioni dell'attività della telomerasi utilizzando il rilevamento quantitativo della telomerasi da parte di allied biotech per iniziare le misurazioni, raccogliere da 10 a 10 a 10 a sei cellule del sangue periferico e sciacquarle in PBS. Quindi pellettali a 500 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, risospendere il pellet in 200 microlitri di un tampone di lisi x dal kit di analisi e incubare su ghiaccio per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, centrifugare i campioni a 12.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Per pellettare i detriti cellulari, trasferire 160 microlitri del surnatante risultante in una provetta nuova e flashare, congelare il surnatante rimanente in un bagno di etanolo e ghiaccio secco prima di conservarlo a meno 80 gradi Celsius per un uso ripetuto. Successivamente, determinare la concentrazione proteica del surnatante mediante il dosaggio standard del BCA.

Per ogni campione raccolto, calcolare la quantità di proteine necessarie per il test in base all'intervallo di lavoro del kit di telomerasi. Quindi, poiché la telomerasi è un enzima sensibile al calore, il calore inattiva metà di ciascun campione per utilizzarlo come controllo negativo mediante incubazione a 85 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, preparare la curva standard quantitativa diluendo in serie il materiale.

Gli oligonucleotidi TSR diluiscono la soluzione madre cinque volte con una diluizione da uno a cinque utilizzando un tampone di lisi. Gli oligonucleotidi TSR hanno una sequenza identica ai primer dei telomeri e sono di una concentrazione nota. Successivamente, impostare la miscela master composta da 12,5 microlitri di due premiscele per il rilevamento quantitativo della telomerasi e 11,5 microlitri di acqua di grado PCR per campione e miscela.

Quindi pipettare 24 microlitri della miscela master in ciascuna provetta utilizzata. Una volta erogata la miscela master, aggiungere ai pozzetti un microlitro di ciascun modello costituito dallo standard, da un campione riscaldato e attivato o da un campione normale. Quindi, sigillare la piastra con un foglio di plastica adesivo e mescolare i campioni mediante vortex.

Quindi inserirli nel sistema di rilevamento PCR in tempo reale. Imposta il programma PCR in modo che inizi a 25 gradi Celsius per 20 minuti. Durante questo periodo, avrà luogo la reazione della telomerasi.

Seguire con 95 gradi Celsius per 10 minuti per la fase iniziale di attivazione della PCR. Quindi eseguire 40 cicli di 95 gradi Celsius per 30 secondi, 60 gradi Celsius per 30 secondi e 72 gradi Celsius per 30 secondi. Per amplificare i modelli di telomeri aggiunti durante i 20 minuti a 25 gradi Celsius.

Infine eseguire il programma e raccogliere i valori del ciclo di soglia per ogni campione. Quindi generare una curva standard utilizzando i valori CT e utilizzarla per calcolare l'attività della telomerasi. Negli esempi mostrati.

Ecco i risultati della PCR in tempo reale di un soggetto di 65 anni. Il gene dei telomeri rappresentato dalle linee rosso vivo raggiunge la sua curva esponenziale dopo circa 27 cicli. Il secondo insieme di linee rappresenta l'amplificazione genica a copia singola, che ha una sola copia nel genoma, e quindi ha meno copie rispetto ai campioni di telomeri rappresentati dalle linee rosse.

Inoltre, il gene a copia singola raggiunge la sua curva esponenziale dopo circa 31 cicli. Le linee marroni rappresentano la curva standard 33 basata su una diluizione seriale delle concentrazioni note del campione. Di seguito è riportata la curva standard per il log della concentrazione rispetto ai valori soglia.

Una linea retta conferma che la diluizione seriale è stata misurata e caricata con precisione. I risultati dell'analisi PCR in tempo reale vengono quindi utilizzati per stimare la lunghezza dei telomeri. Un'unità di rapporto telomero per singola copia genica equivale a una lunghezza media dei telomeri di 4.270 paia di basi nei leucociti e da questi dati risulta in un rapporto di 0,87, che è una media di 3.715 paia di basi e una lunghezza intermedia per qualcuno di questa età.

Utilizzando i risultati dei saggi quantitativi di PCR in tempo reale, è possibile chiarire una relazione tra l'attività dei telomeri e il rapporto tra telomeri e singola copia genica. Questo grafico mostra una forte relazione tra i due saggi dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha spianato le porte ai ricercatori nel campo dell'invecchiamento per esplorare la senescenza cellulare nell'organismo modale, nei dati demografici dei pazienti e nei sistemi di organi.