Monitoraggio migrazione delle cellule dendritiche usando ¹⁹ F / ¹ H Magnetic Resonance Imaging

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare la migrazione delle cellule dendritiche nel linfonodo drenante utilizzando la risonanza magnetica al fluoro non invasiva o la risonanza magnetica in combinazione con la risonanza magnetica protonica convenzionale. Ciò si ottiene preparando prima le cellule dendritiche derivate dal midollo osseo murino e marcando le cellule completamente differenziate con particelle ricche di fluoro. Durante la seconda fase, le cellule marcate con fluoro vengono somministrate per via intracutanea negli arti posteriori di un topo, garantendo l'efficiente trasmigrazione delle cellule somministrate.

Successivamente, la regione anatomica di interesse viene visualizzata mediante fluoro, risonanza magnetica protonica, per monitorare la migrazione delle cellule dendritiche dalla pelle ai linfonodi drenanti. In definitiva, la migrazione delle cellule dendritiche dall'area di applicazione al linfonodo drenante può essere visualizzata mediante risonanza magnetica al fluoro. Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ad altre tecniche di tracciamento cellulare, come quelle che richiedono nanoparticelle di ossido di ferro, è che la pavimentazione legata al carbonio è praticamente assente in tutti gli organismi viventi.

Ciò produce immagini di sfondo complete e prive di informazioni e una completa selettività cellulare dopo l'applicazione di cellule marcate con fluoro in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo dell'immunologia, come ad esempio qual è l'influenza dei candidati molecolari nella migrazione delle cellule dendritiche in vivo. A dimostrare il metodo è Yulia Kovski, tecnico e Helma VIIs, una scienziata senior del mio laboratorio, il giorno 10 della coltura di cellule dendritiche del midollo osseo.

Attiva le cellule dendritiche con LPS per 24 ore. Etichettare le cellule dendritiche con un millimolare ricco di fluoro per fluoro 15 corona cinque particelle etere durante questo periodo, per confermare che le cellule dendritiche sono state etichettate con successo, controllare le caratteristiche fisico-chimiche delle cellule utilizzando la citometria a flusso. Le celle marcate con fluoro sono mostrate qui come eventi rossi sul grafico a dispersione diretta e laterale e le celle non marcate sono mostrate come eventi blu.

La posizione successiva, un mouse C 57 black six in un supporto e quindi caricare una siringa di tubercolina da 0,5 millilitri con un ago calibro 26 e mezzo con cellule dendritiche marcate in fluorescenza in un volume da 50 a 100 microlitri. Ora inserisci con cura l'ago negli strati superiori della pelle in ciascuno degli arti posteriori dell'animale per somministrare le cellule. Dopo aver anestetizzato il topo, posizionare l'animale prono sul letto del mouse dello scanner RM per piccoli animali.

Dopo aver fissato l'animale al supporto per immagini e ai collegamenti al sistema di monitoraggio, spostare il supporto al centro della bobina RF al fluoro protonico per confermare il corretto posizionamento dell'animale e dello scanner. E successivamente pianificazione della geometria della sezione dell'immagine. Acquisisci immagini scout in tre orientamenti standard utilizzando metodi di acquisizione delle immagini veloci e a bassa risoluzione nel software MR Scanner.

Sintonizzare la bobina RF sulla frequenza di risonanza del protone e sulla frequenza di risonanza del fluoro. Utilizzare il monitor di sintonizzazione dello scanner MR per animali per abbinare l'impedenza caratteristica della bobina a 50 ohm. Successivamente, impostare le impostazioni dei sistemi automatici necessarie, incluso lo spessore per regolare con precisione l'omogeneità delle regolazioni della frequenza del sistema di campo magnetico per sintonizzare la RF sulla frequenza LA specifica del sistema RM per i protoni e il guadagno di riferimento.

Per regolare l'ampiezza RF, impostare un protocollo 3D turbo raro per la scansione del protone, utilizzando un TR di 1500 millisecondi e un TE di 53 millisecondi, una matrice di 400 x 200 x 200 e un fattore raro di 16. Regola il campo visivo con l'aiuto delle immagini scout. Quindi avvia la scansione.

Caricare una sequenza FID a singolo impulso con il TR di almeno 1000 millisecondi, quindi aprire la scansione di modifica e impostare il nucleo sul fluoro nel metodo di modifica della casella degli strumenti. Deselezionare il guadagno di riferimento automatico utilizzando la configurazione go. Avviare la misurazione senza registrare i dati per visualizzare un segnale RM in tempo reale.

Regolare la frequenza di base per centrare il picco spettrale del fluoro a zero hertz nella finestra di acquisizione. Quindi selezionare, applicare la frequenza di base e premere stop ora. Clona il protocollo 3D turbo raro dalla precedente scansione protonica.

Vai al metodo di modifica e quindi deseleziona il guadagno di riferimento automatico come appena mostrato nella scansione di modifica. Imposta il nucleo del fluoro e poi cambia la matrice a 1 28 per 64 per 64 e il fattore raro ad almeno 40. Al termine delle scansioni, ritrarre il supporto del mouse dallo scanner RM e utilizzare il menu Visualizza per sovrapporre le immagini del fluoro alle immagini del protone.

Dopo aver sacrificato il topo, rimuovere il linfonodo popale di interesse e inserirlo in una provetta NMR da cinque millimetri contenente 100 microlitri di PFA al 2%. Quindi, posizionare il tubo all'interno di una bobina per spettroscopia al fluoro e spostare la bobina nel centro ISO del magnete. Sintonizzare la bobina RF sulla frequenza di risonanza del fluoro, quindi sul monitor di sintonizzazione dello scanner MR animale, abbinare l'impedenza caratteristica della bobina a 50 ohm all'interno della cassetta degli attrezzi di spessoramento.

Impostare tutti i parametri di spessore su zero e premere applica. Quindi caricare una sequenza FID a singolo impulso con un TR di almeno 1000 millisecondi. Apri, modifica, scansiona e imposta il nucleo sul fluoro.

Ora usando go setup, avvia la sequenza, regola la frequenza di base in modo che il picco spettrale del fluoro sia al centro della finestra di acquisizione a zero hertz e applica la frequenza di base. Quindi regolare nuovamente l'attenuatore di impulsi per massimizzare il segnale per raggiungere un'eccitazione di 90 gradi. Quando il segnale è al massimo, premere stop.

Infine, nel metodo di modifica, impostare le medie tra 64 e 256 a seconda del segnale, e quindi utilizzare go pipeline. Iniziare l'acquisizione da 18 a 21 ore dopo l'applicazione intracutanea. Le cellule dendritiche marcate con fluoro migrano nel linfonodo popale drenante.

Il movimento delle cellule dendritiche attraverso i dotti linfatici nel linfonodo pubblico drenante può essere apprezzato sovrapponendo le immagini anatomiche protoniche con le cellule dendritiche del fluoro. Immagini, le cellule dendritiche sono mostrate come un MR al fluoro. Il segnale è in rosso, mentre i linfonodi e i dotti linfatici sono mostrati nell'immagine RM anatomica del protone in scala di grigi. Al fine di quantificare l'entità della migrazione delle cellule dendritiche nei linfonodi drenanti, i linfonodi vengono estratti e la risonanza magnetica del fluoro viene eseguita come appena dimostrato quando il segnale del fluoro ottenuto da ciascun linfonodo viene confrontato con il segnale del fluoro ottenuto da un numero diverso di cellule dendritiche marcate con cinque particelle etere della corona per fluoro 15, come illustrato da questa curva di calibrazione, Il numero di cellule dendritiche marcate con fluoro che raggiungono il linfonodo drenante può essere dedotto per questo esperimento rappresentativo.

Si può stimare che da 7,5 volte 10 al quarto dendritico che non sono state caricate con antigene hanno raggiunto il linfonodo sinistro, mentre 3,6 volte 10 al quinto l'antigene ha raggiunto il linfonodo destro. Sebbene questo aspetto possa fornire informazioni sui meccanismi molecolari della migrazione delle cellule immunitarie in condizioni normali, può essere utilizzato anche in modelli animali come quelli delle malattie autoimmuni. Inoltre, le implicazioni di questa tecnica si estendono verso il campo della terapia del cancro.

Qualsiasi bersaglio molecolare identificato può essere utilizzato per manipolare le cellule dendritiche per la terapia del tumore.