Name: Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T19:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Impara a isolare miofibre scheletriche da embrioni e larve di zebrafish per studiare la morfologia e la localizzazione subcellulare delle proteine muscolari. Questo metodo consente analisi dettagliate in singole fibre.

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Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Dowling (Aaron Reifler, Trent Waugh, Angela Busta, e William Telfer), che hanno contribuito allo sviluppo della tecnica e alla produzione del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;Istituto Taubman, il Dipartimento di Pediatria presso l&#39;Università del Michigan, e in parte da sovvenzioni dal Distrofia Muscolare (JJD MDA186999) e il National Institutes of Health (JJD 1K08AR054835).

1. Preparazione del Poli-L-lisina Rivestito Coprivetrini (Tempo: 1 ora) Lamelle di rivestimento consente una rapida decantazione myofiber e l&#39;adesione. Ciò può essere eseguita durante la fase di dissociazione dell&#39;isolamento miofibre (passo 2). <ol><li> Tagliare e posizionare Parafilm sul fondo di un piatto 60 millimetri Petri (di qualsiasi marca). </li><li> Posizionare scivola vetro di copertura microscopio (diametro 12 mm) su parafilm in un piatto di coltura tissutale a 60 mm o posizionare singolarmente in singoli pozzetti di piastre da 24 pozzetti. </li></ol> Nota 1: Questi piccoli coprioggetto rotondi aiutano a concentrarsi myofiber numeri e ridurre l&#39;utilizzo di anticorpi in eccesso. Nota 2: Altri vetrini di dimensioni lavoreranno, tuttavia, i volumi di reagenti e di embrioni utilizzati dovranno essere adeguati di conseguenza. <ol start="3"><li> Pipettare 50-200 microlitri di soluzione di poli-L-lisina (0,01%) su ciascun vetrino coprioggetto nella capsula di Petri. </li><li> Lasciare i coprioggetti di sedersi almeno una hour a 37 ° C. Incubazione più lungo non influenzeranno negativamente i risultati. </li><li> Rimuovere poli-L-lisina soluzione dal vetro di copertura e lavare due volte con un minimo di 100 microlitri di PBS 1x. </li><li> Lasciare coprioggetto asciugare. </li><li> Coprivetrini sono ora pronti per miofibre. </li></ol> Nota 3: Al fine di garantire la sterilità, il rivestimento può essere fatto in un cappuccio e su vetrini in autoclave. Nota 4: Mantenere il piatto 60 millimetri Petri con Parafilm sul fondo. Questa configurazione verrà utilizzato durante myofiber placcatura e immunomarcatura (fasi successive). Alternativa 1: invece di lamelle di rivestimento immediatamente prima dell&#39;uso, un vetrino rivestito magazzino può essere utilizzato. Un piatto 60 millimetri Petri contenente un minimo di 2 ml di poli-L-lisina può essere conservato a 4 ° C con numerosi coprioggetto. Con questa alternativa iniziare dal punto 1.5 per elaborare le lamelle per miofibre. Alternativa 2: Abbiamo anche coprioggetto cappotto in poli-L-ornitina. Til suo è più alta intensità di manodopera, ma è utile per la coltura a lungo termine perché vetrini rivestiti di poli-L-ornitina può essere trattato UV. Con il trattamento UV e attenta tecnica sterile myofibers vivi in ​​genere può essere mantenute in coltura 4-7 giorni. 2. Dissociazione di embrioni di zebrafish e placcatura di miofibre (Tempo: da 1 a 3 ore) Nota: il protocollo norma si applica meglio al 3 dpf (giorni dopo la fecondazione) gli embrioni. <ol><li> Trasferire embrioni di zebrafish in un 1,5 ml provetta standard ed eliminare quanta più acqua i pesci in eccesso il più possibile. Tipicamente, possono essere utilizzati 10-20 embrioni per provetta, anche se meno. Utilizzando più di 20-25 embrioni traduce spesso in una preparazione di densità eccessiva. <ol><li> Rimuovere chorions prima di dissociazione, manualmente utilizzando # 5 pinze. In alternativa, la rimozione corion chimica si ottiene con 10-15 minuti di trattamento Pronase. Tipicamente, la rimozione precedente del corion è necessaria solo quando prima conferma di un mutè necessario fenotipo formica o morfologia, o quando si utilizza fasi in cui gli embrioni sono naturalmente tratteggiata da loro corion. </li></ol></li><li> Aggiungere 900 ml di CO 2 media indipendenti per il tubo contenente gli embrioni. </li><li> Aggiungere 100 ml di collagenasi di tipo II, finali concentrazione 3,125 mg / ml (soluzione della collagenasi a 31,25 mg / ml diluito in 1x PBS) per iniziare dissociazione. Collagenasi IV può essere utilizzato anche per la dissociazione. </li><li> Ruotare embrioni in un agitatore orbitale, e triturare ogni 30 min a temperatura ambiente usando una P1000 Pipetman per la triturazione. </li></ol> Nota 2: monitorare attentamente embrione dissociazione, sopra o sotto di dissociazione (soprattutto over) sono le ragioni più comuni per il fallimento del protocollo. I tempi per la digestione variano a seconda dell&#39;intensità di triturazione, il numero di embrioni per provetta, e l&#39;età degli embrioni. E &#39;anche spesso meno (rispetto ai tipi selvatici) per embrioni da mutanti muscolari scheletriche. Appunto3: tempo medio di digestione per età dell&#39;embrione: 1 dpf = 1 ora, 2 dpf = 1,5 ore, 3 dpf = 2 ore e 4 dpf = 2-2,5 ore. <ol start="5"><li> Smettere di digestione quando non interi embrioni sono visibili, ma pezzi solidi sono ancora visibili - questo è essenziale per prevenire overdigestion. </li><li> Provette da centrifuga con embrioni dissociate a 0,8-2,3 g per 3-5 minuti per le cellule pellet. </li><li> Rimuovere il surnatante dalle cellule pellet e lavare 2x con CO 2 media indipendenti. </li><li> Aggiungere CO fresco 2 media indipendenti per risospendere le cellule. 1 ml è tipicamente utilizzata per preparazioni di 10-20 embrioni. Il volume può essere scalata basata sul numero embrione. </li><li> Usando una pipetta P1000, passare sospensione embrione attraverso un filtro da 70 micron. Questo aiuta a rimuovere i residui indesiderati dalla preparazione. </li></ol> Nota 4: sospensione embrione può essere filtrato una seconda volta attraverso un filtro da 40 micron per rimuovere ulteriori residui indesiderati. Da una doppia filtrazione, il recupero è approximdiatamente 800 microlitri da un volume iniziale di 1 ml. <ol start="10"><li> Aggiungere circa 50-100 microlitri di sospensione miofibre ad ogni coprioggetto rivestiti con poli-L-lisina. </li></ol> Nota 5: Eseguire il passaggio 2.9 in piastre di Petri con Parafilm sul fondo, precedentemente preparato. Il Parafilm mantiene la sospensione myofiber di scappare coprioggetto rivestiti. Tenere piastre di Petri coperti per evitare l&#39;evaporazione. <ol start="11"><li> Consentire myofibers di stabilirsi a circa 1 ora sui vetrini rivestiti a temperatura ambiente. </li></ol> Nota 6: myofibers inizieranno a comporre entro 5-10 min. Tuttavia, per buon attacco myofiber, si raccomanda un minimo di 1 ora (1-2 ore). Permettere myofibers di stabilirsi a lungo non danneggia la prep. Per incubazioni più lunghi (notti comprese), antibiotici possono essere aggiunti ai media. Con antibiotici e tecnica sterile fermenti vivi in ​​genere può essere mantenuta per 1-2 giorni. <ol start="12"><li> Live myofibers può osservare a questo punto. Miofibre da embrioni 2 dpf e successivamente sarà visto come cellule striate e allungate (Figura 1). A questo punto, miofibre sono ora pronti per l&#39;analisi diretta o per immunomarcatura. </li></ol> Nota 7: muscolo scheletrico dal 1 dpf embrioni non piastra fibre come allungate e chiaramente striati. Invece, grandi myoballs sono visibili. Inoltre, durante la fase di post dissociazione pellet (punto 2.6), 1 dpf myoballs devono essere centrifugati per un minimo di 8 min a 5000 xg per ottenere un pellet. Per l&#39;analisi degli embrioni in questa fase, si consiglia di utilizzare la linea transgenica che esprime EGFP specificamente nel muscolo scheletrico 23. Ciò consentirà identificazione di cellule di origine muscolare contro altre fonti. 3. Fluorescenza Immunostaining di dissociati Zebrafish miofibre (Durata: circa 1 giorno) 3.1. Immunomarcatura <ol><li> Rimuovere una porzione disupporti da myofibers aderito al vetrino rivestito </li><li> Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% o metanolo. Per PFA, rimuovere ½ il volume del supporto e sostituire con la stessa quantità di PFA. Fix per 10 min a RT, quindi rimuovere volume totale, sostituirlo con 50-100 ml di PFA, e fissare per altri 10 min. Per la fissazione alcool, ghiaccio metanolo freddo o acetone può essere applicato a 4 ° C per 10 min o 5 min, rispettivamente. </li><li> Lavare myofibers almeno 3-5x con PBS 1x o 1x PBS più 0,1% di Tween. Il volume medio di lavaggio è 50-100 microlitri per coprioggetto. </li><li> Aggiungere soluzione bloccante a myofibers (Stock di lavoro) e incubare 20-60 minuti a temperatura ambiente. Soluzione bloccante varierà a seconda delle condizioni anticorpi primari e secondari. I due più comuni utilizzate in laboratorio sono (1) 1x PBS, 2 mg / ml BSA, siero di pecora 1%, 0,25% Triton X-100 e finale (2) 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml (0,2 % BSA) e siero di pecora / capra 5%. </li><li> Rimuovere soluzione bloccante e aggiungere anticorpo primario diluito in due bsoluzione o PBS bloccaggio. Incubare myofibers notte a 4 ° C. Assicurati di entrambi Parafilm o avvolgere nella pellicola trasparente scatola di Petri contenente i coprioggetti myofiber-caricato rivestite con anticorpi. Piccoli pezzi di carta assorbente inumidito possono essere aggiunti per creare una camera umidificata. </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo primario da coprioggetto e lavare coprioggetto 3-5x per 5 minuti con PBS o la soluzione di blocco. </li><li> Aggiungi anticorpo secondario a concentrazione adeguata diluito in 1x PBS o soluzione di blocco per 1-2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere anticorpo secondario e lavare myofibers 3-5x in PBS per 5 minuti ciascuno a RT. </li></ol> 3.2. Lamelle di montaggio <ol start="9"><li> Applicare 1-2 gocce di reagente antifade ad un vetrino da microscopio. </li><li> Pick-up con attenzione il vetrino rivestito e immunolabled con pinze e luogo (myofibers giù) il vetrino sul reagente antifade sul vetrino del microscopio. </li></ol> Nota 1: L&#39;attenzione per l&#39;orientamento del cvetrino oated è critica. <ol start="11"><li> Lay 1-2 Kimwipes su una superficie solida dura. Invertire rapidamente la slitta con i vetrini rivestiti riposo sul reagente antifade e posizionarlo (coprioggetto in diminuzione) in Kimwipes. </li><li> Applicare una leggera pressione agli angoli del vetrino da microscopio per rimuovere l&#39;eccesso antifade e formare una perfetta tenuta tra il vetrino e coprioggetto </li><li> Consentire la antifade restante asciugare per 5-10 minuti a temperatura ambiente, poi le miofibre sono pronti ad immagine (Figure 2A e B) o conservare a 4 ° C. </li></ol> 4. Cellulare dal vivo Imaging di calcio Utilizzo GCaMP3 Esperimenti sulle cellule in diretta possono essere eseguite su myofibers prima fissaggio (seguito passo 2.10). Il protocollo che segue descrive l&#39;imaging dal vivo in miofibre esprimono GCaMP3 24, un indicatore di calcio geneticamente codificato, espressa dal muscolo scheletrico specifico zebrafish α-actina promotore (pSKM) 23. Alternativamente,questa tecnica può essere facilmente adattato per usare pigmenti indicatori del calcio, come Fura-2. <ol><li> Iniettare embrioni con pSKM: GCaMP3 costruire nella fase di 1-2 cellule </li><li> A 3 dpf, raccogliere le larve e preparare myofibers come descritto nelle sezioni 1 e 2. Consentire myofibers di aderire per un minimo di 1 ora. Per questa tecnica, vetrini preparano in piatti da 24 pozzetti è necessaria. </li><li> Rimuovere con cura i supporti in eccesso, e aggiungere 300 ml di fresca CO 2 media indipendenti a RT. </li><li> Osservare le cellule sotto un microscopio invertito. GCaMP3 myofibers positivi devono essere visibili sotto fluorescenza verde. </li><li> Installazione della fotocamera per la registrazione, se lo si desidera. </li><li> Preparare una soluzione di caffeina 30 mm di CO 2 media indipendenti. Per stimolare le cellule, pipettare delicatamente 300 ml di soluzione di caffeina nel pozzo sotto ingrandimento. Da 5-10 sec, GCaMP miofibre positivi dovrebbero rispondere agli caffeina con un rapido aumento della fluorescenza (Figura 3). MyofibERS può anche contrarre. Da segnalare, la caffeina induce rilascio di calcio dai depositi del reticolo sarcoplasmatico 25. Altri agenti, come ad esempio KCl 26 e ryanodine 4, possono essere utilizzati per studiare il rilascio di calcio inducibile. </li></ol>

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<li>Leuranguer, V., Papadopoulos, S., Beam, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+calcium+channel+beta1a+subunits+in+triad+junctions+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Organization of calcium channel beta1a subunits in triad junctions in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 281, 3521-3527 (2006).</li>
<li>Capote, J., Bolanos, P., Schuhmeier, R. P., Melzer, W., Caputo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transients+in+developing+mouse+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium transients in developing mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 564, 451-464 (2005).</li>
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<li>Sakowski, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+study+motor+neurons+from+zebrafish+embryos+and+larvae+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach to study motor neurons from zebrafish embryos and larvae in culture.</a> J. Neurosci. Methods. 205, 277-282 (2012).</li>
<li>Nakano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+GPI-anchored+proteins+is+essential+for+surface+expression+of+sodium+channels+in+zebrafish+Rohon-Beard+neurons+to+respond+to+mechanosensory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of GPI-anchored proteins is essential for surface expression of sodium channels in zebrafish Rohon-Beard neurons to respond to mechanosensory stimulation.</a> Development. 137, 1689-1698 (2010).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Schredelseker, J., Shrivastav, M., Dayal, A., Grabner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Ca2%2B-conducting+Ca2%2B+channels+in+fish+skeletal+muscle+excitation-contraction+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Non-Ca2+-conducting Ca2+ channels in fish skeletal muscle excitation-contraction coupling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5658-5663 (2010).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.

Zebrafish sono un potente sistema modello vertebrato per studiare lo sviluppo muscolare e la funzione in vivo 25,27,28. Essi hanno anche emerso come un bene prezioso per la modellazione di malattie muscolari umane 14,15,20,29. Mentre i grandi passi avanti sono stati compiuti per promuovere l&#39;uso e l&#39;applicazione di zebrafish per lo studio della funzione muscolare e delle malattie del muscolo, vi è una necessità critica costante per sviluppare strumenti che consentano più approfondi...

Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente specializzato responsabile della generazione delle forze necessarie motilità contrattili. La contrazione è iniziata attraverso un processo noto come eccitazione-contrazione (EC) di accoppiamento che converte i segnali elettrici di rilascio di calcio dai depositi intracellulari 1,2. Rilascio di calcio intracellulare attiva il sarcomero di accorciare e generare forza. I numerosi componenti specifici della macchina molecolare responsabile mediare la trasmissione neuromuscolare svincolo 3, accoppiamento EC 4,5, e actina-miosina contrazioni dipendenti 6 continuano ad essere oggetto continuo di intensa ricerca. Inoltre, le proteine ​​che stabilizzano la membrana del muscolo durante la contrazione 7,8 e che mediano la segnalazione tra il myofiber e la matrice extracellulare 7,9 sono stati identificati e studiati nei minimi dettagli. Mutazioni in un certo numero di geni importanti per una struttura muscolarefunzione nd sono stati identificati come causa di malattie del muscolo scheletrici umani ( <a href="http://www.musclegenetable.org/" target="_blank">http://www.musclegenetable.org/</a> ). Queste malattie, classificati in linea di massima come miopatie scheletriche e distrofie muscolari basati su caratteristiche cliniche e istopatologiche, sono associati a debolezza muscolare, invalidità permanente e 10,11 mortalità precoce. Lo zebrafish ha dimostrato di essere un sistema eccezionale per la modellazione e lo studio delle malattie del muscolo scheletrici umani 8,12,13. E &#39;stato impiegato per validare nuove mutazioni del gene 8, definire nuovi aspetti della malattia fisiopatologia 14,15, e identificare nuovi approcci terapeutici 15,16. La potenza della zebrafish per studio delle malattie muscolo umano riferisce al maggior numero di figli, il rapido sviluppo della struttura muscolare e funzione, la chiarezza ottica dell&#39;embrione zebrafish, e la facilità di manipolazione genetica e farmacologica della zebra sviluppopesce 17. Noi e altri 12,18,19 recentemente sviluppato una tecnica semplice per l&#39;isolamento rapido ed efficiente miofibre dal zebrafish sviluppo. Questo metodo ha permesso l&#39;esame di miofibre in maggior dettaglio che può essere fornita da intera analisi embrione. La tecnica è stata sfruttata per la caratterizzazione della proteina localizzazione subcellulare 20 nonché per l&#39;identificazione di importanti caratteristiche istopatologiche come parte di studi di validazione in modelli di malattia di nuova concezione 21. Inoltre, miofibre isolate possono inoltre essere utilizzati per l&#39;imaging dal vivo e per gli studi elettrofisiologici 22, tecniche che consentono l&#39;interrogatorio di aspetti fondamentali della funzione muscolare. Il protocollo specifico per l&#39;isolamento miofibre, insieme a due esempi di esperimenti successivi analitiche, è dettagliata nelle parti rimanenti di questo manoscritto.

<table><tbody><tr><td>Piastra di coltura a 24 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>70011</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Terreno indipendente</td><td>Invitrogen Gibco</td><td>18045</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo II</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004186</td><td>Lot 41H12764</td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo IV</td><td>Worthington Biochemical</td><td>L5004188</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica</td> 8<td>% Paraformaldeide</td> Scienze <td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Siero di pecora</td><td>Sigma</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fischerbrand</td><td>12-545-82 12CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Pronasi</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filter</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antidissolvenza Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-alfa;-actinina</td><td>Sigma</td><td>A5044</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-RYR</td><td>Abcam</td><td>34C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Anticorpo Fluor</td><td>Invitrogen</td><td>A-21425</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 60 mm</td><td>Fischerbrand</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitina</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio</td><td>Fischerbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Caffeina</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi delle embrionali e larvali zebrafish scheletriche miofibre da preparazioni dissociata

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Lo zebrafish ha dimostrato di essere un sistema valido modello per esplorare la funzione del muscolo scheletrico e per lo studio delle malattie muscolari umane. Nonostante i numerosi vantaggi offerti da analisi in vivo del muscolo scheletrico nel zebrafish, visualizzando l&#39;ambiente proteina complesso e finemente strutturato responsabile per la funzione muscolare, soprattutto in embrioni interi, può essere problematico. Questo ostacolo deriva dalla piccola dimensione del muscolo scheletrico zebrafish (60 micron) e le dimensioni ancora più piccolo del sarcomero. Qui descriviamo e dimostrare un metodo semplice e rapido per isolare miofibre scheletriche da embrioni di zebrafish e larve. Abbiamo anche i protocolli che illustrano le tecniche di preparazione post utili per analizzare la struttura e la funzione muscolare. In particolare, abbiamo dettaglio la successiva localizzazione immunocitochimica delle proteine ​​dei muscoli scheletrici e l&#39;analisi qualitativa del rilascio del calcio stimolato via live Calcio Imaging cellulare. Nel complesso, questo videoarticolo fornisce un metodo straight-forward ed efficace per l&#39;isolamento e la caratterizzazione di miofibre scheletriche zebrafish, una tecnica che prevede un condotto per la miriade di successivi studi di struttura e funzione muscolare.

Immunomarcatura fluorescente di miofibre (Figura 2) Immagini che mostrano atteso modello di marcatura fluorescente da myofibers immunostained dopo l&#39;isolamento di successo e placcatura. Le miofibre sono stati etichettati sia con anti-recettore ryanodine (1:100) (Figura 2A) o anti-α-actinina (1:100) (Figura 2B) anticorpi, e rivelare rispettivamente immunocolorazione della triade e la Z-band. Anticorpi secondari utilizzati erano A...

Zebrafish sono un sistema emergente per modellare disturbi umani del muscolo scheletrico. Descriviamo un metodo veloce ed efficace per isolare miofibre muscolari scheletriche da zebrafish embrionale e larvale. Questo metodo fornisce una preparazione ad alta densità miofibre adatto per lo studio della morfologia singola fibra muscolare scheletrica, proteina localizzazione subcellulare, e fisiologia muscolare.

Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare in modo efficiente le fibre muscolari scheletriche da pesci zebra embrionali e larvali. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando delle piastrine rivestite con polilisina; successivamente, da uno a quattro giorni dopo la fecondazione, gli embrioni di pesce zebra vengono dissociati. Le fibre miocellulari quindi isolate dagli embrioni dissociati vengono poi seminate sulle piastrine di polilisina.Infine, le fibre miotiche vengono fissate, colorate e analizzate mediante imaging per lo studio delle proteine muscolari. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la localizzazione subcellulare delle proteine muscolari attraverso la microscopia a fluorescenza immunologica. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi dell'embrione intero, è che consente lo studio della morfologia e della fisiologia di singole fibre muscolari in maggiore dettaglio.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo muscolare, come quelle relative alla localizzazione proteica subcellulare, e può essere combinato con l'analisi del calcio in cellule vive. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla validazione di modelli di zebrafish per le malattie muscolari, poiché consente di visualizzare anomalie strutturali patognomoniche associate alle malattie umane. Può inoltre essere utilizzato per contribuire all'identificazione di nuovi aspetti delle malattie muscolari.La patogenesi attraverso questo metodo può fornire informazioni sulla struttura e la funzione muscolare. Può inoltre essere applicata ad altri studi, come le malattie del muscolo scheletrico umano. Per prepararsi alla dissociazione di embrioni di pesce zebra, preparare coprivetrini tagliando e posizionando del paraffina sul fondo di una piastra di Petri da 60 millimetri.Quindi posizionare i vetrini di vetro sul parfum e pipettare da 50 a 200 microlitri di soluzione di polilisina su ciascun vetrino. Incubare i vetrini a 37 gradi Celsius per almeno un'ora, quindi rimuovere la soluzione di polilisina e lavarli due volte con 100 microlitri di PBS. Lasciare asciugare i vetrini, quindi conservarli in una capsula coperta.Per la dissociazione degli embrioni. Trasferire 10-23 embrioni di pesce zebra in fase post-fecondazione in un tubo da centrifuga standard da 1,5 millilitri e rimuovere la maggior parte dell'acqua in eccesso. Pipettare 900 microlitri di mezzo indipendente dal biossido di carbonio nel tubo.Quindi aggiungere 100 microlitri di collaghenasi 3,125 milligrammi per millilitro, soluzione due o quattro, per iniziare la dissociazione. Ruotare gli embrioni su un agitatore orbitale a temperatura ambiente e ogni 30 minuti utilizzare una pipetta P1000 per ripetere il campione al fine di prevenire un'eccessiva digestione, quando non sono visibili embrioni interi ma sono ancora presenti frammenti solidi. Arrestare la reazione centrifugando i campioni a 0,8-2,3 ×g per tre-cinque minuti.Rimuovere il soprannatante e lavare due volte con mezzo indipendente dal biossido di carbonio. Far passare la sospensione attraverso un filtro da 70 micrometri per rimuovere i detriti, aggiungendo circa 50-100 microlitri di sospensione di miofibre su ciascun cover slip rivestito con poli-L-lisina. Lasciare sedimentare le miofibre per un'ora a temperatura ambiente dopo averle fissate ed etichettate mediante immunoistochimica secondo il protocollo descritto nel testo.Posizionare i coprioggetti applicando prima una o due gocce di reagente Antifa su un vetrino. Utilizzare pinzette per prendere con cura un coprioggetto, capovolgerlo e posizionarlo sulle gocce di reagente anti-sfaldamento presenti sul vetrino del microscopio. Successivamente, appoggiare uno o due fazzoletti su una superficie solida e capovolgere rapidamente il vetrino sui fazzoletti.Applicare una leggera pressione sugli angoli del vetrino per rimuovere l'eccesso di reagente Antifa e creare un sigillo stretto tra il vetrino e il coprioggetto. Lasciare asciugare i vetrini per cinque-dieci minuti a temperatura ambiente prima dell'analisi microscopica o conservarli a quattro gradi Celsius. Nell'immagine, le miofibrille marcate immunofluorescentemente contro il recettore anodino e l'alfa-actinina rivelano rispettivamente il triade e la banda Z.Abbiamo utilizzato fibre miopiche isolate in studi precedenti per determinare la localizzazione subcellulare delle proteine muscolari. Per studiare la localizzazione di transgeni chimera espressi e per definire parametri specifici delle fibre miopiche, inclusa la dimensione. Questa figura dimostra il rilascio normale di calcio indotto dalla caffeina in fibre miopiche che esprimono il costrutto PSKM GCaMP tre.La tecnica descritta nel protocollo testuale può essere utilizzata per analizzare l'apparato del coupling eccitazione-contrazione mediante imaging in tempo reale seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'immagine in tempo reale del calcio, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio: sono presenti difetti nel coupling eccitazione-contrazione dopo il suo sviluppo? Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello studio delle malattie muscolari per esplorare studi di validazione di geni di malattie muscolari appena identificati e determinare nuovi aspetti della patogenesi delle malattie muscolari.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare il singolo FBS leggero dagli ems del pesce zebra.

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Misure di forza possono essere utilizzati per dimostrare i cambiamenti nella funzione muscolare a causa di sviluppo, infortunio, malattia, trattamento o tossicità chimica. In questo video, dimostriamo un metodo per misurare la forza durante una contrazione massimale di zebrafish muscolare tronco larvale.

Misura della forza durante la contrazione per valutare la funzione muscolare in larve Zebrafish

Il pesce zebra è ora uno strumento consolidato e potente per modellare distrofie muscolari, miopatie congenite e malattie neuromuscolari correlate. La birifrangenza e il comportamento di fuga evocato dal tatto sono due comuni test non invasivi utilizzati per determinare il grado di disorganizzazione muscolare e compromissione locomotiva degli embrioni di zebrafish durante lo sviluppo precoce.

Analisi dei difetti muscolo scheletrico larvale Zebrafish da Birifrangenza e Touch-evocare Fuga risposta Saggi

In questo studio, descriviamo un metodo semplice per eseguire l'analisi del colorante blu di Evans (EBD) sulle larve di pesce zebra.  Questa tecnica è un potente strumento per la caratterizzazione dell'integrità del muscolo scheletrico e la delineazione di modelli di distrofia muscolare di zebrafish, ed è un metodo prezioso per lo sviluppo di nuove terapie.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

I pesci zebra sono un modello eccellente per studiare la funzione muscolare e le malattie. Durante l'embriogenesi precoce, il pesce zebra inizia contrazioni muscolari regolari producendo un comportamento ritmico di nuoto, che viene alterato quando il muscolo viene interrotto. Qui descriviamo una risposta evocata al tatto e un saggio di locomozione per esaminare le prestazioni di nuoto come misura della funzione muscolare.

Utilizzando risposta al tocco evocata e di locomozione saggi per valutare le prestazioni e sulla funzione muscolare in Zebrafish

L'analisi agli elementi finiti è uno strumento utilizzato frequentemente per studiare le prestazioni meccaniche delle strutture sotto carico. Qui applichiamo il suo uso alla modellazione della biomeccanica della mascella del pesce zebra.

Costruire modelli ad elementi finiti per Indagare Zebrafish Jaw Biomeccanica

La macchiatura di Immunohistochemical delle isoforme della catena pesante della miosina è emerso come il discriminatore di state-of-the-art di fibra del muscolo scheletrico-tipo (cioè, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Qui, presentiamo un protocollo di colorazione insieme a un algoritmo romanzo semi-automatico che facilita la rapida valutazione della morfologia del tipo di fibra e fibra.

Analisi semi-automatica del Mouse del muscolo scheletrico morfologia e composizione di fibra-tipo

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Il presente protocollo descrive l'isolamento acuto di cellule muscolari lisce cardiache e vascolari vitali da pesci zebra adulti, giovanili, larvali ed embrionali (Danio rerio), adatti per studi elettrofisiologici.

Isolamento di cellule muscolari lisce cardiache e vascolari da pesci zebra adulti, giovanili, larvali ed embrionali per studi elettrofisiologici

La chiarezza ottica è un grande vantaggio per il lavoro biologico e fisiologico delle cellule nel pesce zebra. Vengono descritti metodi robusti per la misurazione della crescita cellulare nei singoli animali che consentono nuove intuizioni su come la crescita del muscolo scheletrico e dei tessuti vicini sono integrati con la crescita di tutto il corpo.

Misurazione in tempo reale e ripetuta della crescita muscolare scheletrica in singoli pesci zebra vivi sottoposti ad alterata attività elettrica

Descriviamo un protocollo per ottenere fibre enzimaticamente dissociate di diverse lunghezze e tipologie da sei muscoli di topi adulti: tre di essi già descritti (flessore breve delle dita, estensore lungo delle dita, soleo) e tre di essi dissociati con successo per la prima volta (estensore lungo dell'alluce, peroneo lungo, peroneo delle dita quarti).

Fibre muscolari scheletriche corte, intermedie e lunghe intatte ottenute dalla dissociazione enzimatica di sei muscoli degli arti posteriori di topi: oltre il flessore breve delle dita

Impara a isolare miofibre scheletriche da embrioni e larve di zebrafish per studiare la morfologia e la localizzazione subcellulare delle proteine muscolari. Questo metodo consente analisi dettagliate in singole fibre.

Analisi delle embrionali e larvali Zebrafish scheletriche miofibre da Preparazioni dissociata

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