Name: Progettazione e utilizzo di matrici chemostato multiplexing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 40 s
Description: Impara a progettare e utilizzare matrici di mini-chemostati per evoluzione sperimentale e genomica funzionale con lievito. Questo metodo compatto riduce costi e spazio mantenendo risultati fisiologici equivalenti ai sistemi tradizionali.

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La creazione del video è stato sostenuto dalle concessioni dal National Center for Research Resources (5P41RR011823-17) e l&#39;Istituto Nazionale di General Medical Sciences (8 P41 GM103533-17) dal National Institutes of Health. Questo lavoro è stato sostenuto anche da NSF concedere 1120425. MJD è Rita Allen Foundation Scholar. AWM è sostenuto in parte dal NIH T32 HG00035. Ringraziamo Sole Anna per l&#39;assistenza al miglioramento dei protocolli. Inoltre, riconosciamo Sara DiRienzi, Celia Payen, e Amy Sirr come primi utenti dei Ministat.

Usare le tecniche sterile per tutto il protocollo. 1. Assemblaggio dei pezzi e preparazione del Array Ministat <ol><li> Ordina tutte le parti. </li><li> Pulire tubi di vetro. Segna i tubi a 20 ml di volume. </li><li> Crea gruppi di sughero con l&#39;aria, i media, e le porte degli effluenti e metterli in cima dei tubi di vetro puliti cultura. </li><li> Preparare camere di umidificazione e organizzare tutti i non-autoclave parti. </li><li> Fai aria, scarichi, tubi e multimediale utilizzando la lunghezza dei tubi sufficienti e compatibili accoppiamenti. </li><li> Collegare ogni tipo di tubo (aria, i media, e degli effluenti), ai gruppi di sughero e filtri foglio e il supporto connettore rapido per prepararli per l&#39;autoclave. </li><li> Preparare una damigiana per la fabbricazione di mezzo sterile chemostato. </li><li> Preparare le bottiglie di campionamento la cultura con l&#39;inserimento di due fori tappo di gomma con raccordi appropriati. Lamina ogni filtro per prepararli per l&#39;autoclave. </li><li> Fit la matrice ben assemblato in uno o più vassoi autoclave e sterilizzare in autoclave tutte le parti. </li><li> Marca e filtrare i media chemostato in bottiglioni autoclave. </li></ol> 2. Configurazione di un esperimento <ol><li> Riempire ogni pallone idratazione con 700 ml DDH 2 O. </li><li> Posizionare i Ministat autoclavato nel set blocco riscaldante alla temperatura desiderata. </li><li> Posizionare le compagnie aeree nel collettore a 4 porte e accendere la pompa. </li><li> Collegare le linee di effluenti ai flaconi da 100 ml di raccolta. </li><li> Rimuovere la pellicola dalla fine del tubo media e damigiana media e collegare i due innesti rapidi. Infilare ogni lunghezza di tubo della pompa attraverso una cartuccia pompa peristaltica e fare clic su di loro in posizione. Accendere la pompa di supporto. </li><li> Lasciate che le camere di riempimento. Spegnere la pompa media. </li><li> Spruzzare i gruppi di sughero con il 70% di etanolo e inoculare le culture con una siringa. Salva un campione dell&#39;inoculo come uno stock di glicerolo congelatose desiderato. Lasciate culture crescere per 30 ore. </li><li> Regolare l&#39;altezza dell&#39;ago effluenti finché il volume cultura è impostato a 20 ml con il flusso d&#39;aria spenta. Questo può richiedere aggiustamenti diversi nel corso di un&#39;ora. Al termine girare il flusso d&#39;aria di nuovo. </li><li> Accendere la pompa multimediale su. </li><li> Svuotare le bottiglie di campionamento degli effluenti, che contengono dei media raccolti durante l&#39;impostazione del volume di cultura del lavoro, e registrare il tempo. </li><li> Per fare un tempo zero luogo di misura le linee degli effluenti in provette sterili per la raccolta di 15 minuti-2 ore (a seconda del volume che si desidera campione per l&#39;analisi del DNA). Anche fare una scorta congelata glicerolo per ogni coltura in questo momento se lo si desidera. </li></ol> 3. Misurazioni giornaliere <ol><li> Come con il tempo zero di misura, campione in ghiaccio per 15 minuti-2 ore (come richiesto per l&#39;esperimento) su ghiaccio e registrare il tempo di campionamento per campioni di DNA e di archivi congelati. </li><li> Per i campioni di RNA o raccogliere un piccolo volal volume, utilizzando una siringa e 22G 5 &quot;ago dalla cultura o stappare ogni Ministat per raccogliere tutta la cultura. campioni deve essere presa rapidamente, raccolto mediante filtrazione, ed immediatamente congelati in azoto liquido. </li><li> Misurare la residua raccolta dopo l&#39;ultimo prelievo per ogni Ministat quantificare di diluizione. Regolare tassi di diluizione, se necessario, regolando l&#39;impostazione di messa a punto della pompa o l&#39;ammenda regolare sulle linee pompe singole. </li><li> Sostituire i tubi di raccolta degli effluenti in bottiglia vuote. </li><li> Quantificare cellule / ml così come altri endpoint di interesse e fare una scorta congelata glicerolo. </li></ol> 4. Post-esperimento Cleanup <ol><li> Mettere tutti i tubi in vassoi separati e risciacquare con abbondante DDH 2 O. Tubi a secco utilizzando una pompa acquario. </li><li> Pulire le assemblee di sughero con DDH 2 O e usare l&#39;inserto ago per pulire gli aghi, aspirare e dispensare acqua a sua volta. Pulire la parte esterna degli aghi e sughero per rimuovere qualsiasisupporti residui. </li><li> Pulire il tubo di vetro con acqua ed etanolo, e rimuovere i contaminanti fisici con 3 appallottolato Kimwipes e pinze. </li><li> Sciacquare e asciugare tutti i componenti prima dell&#39;uso. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Coltivazione chemostato nelle Ministat, come con qualsiasi chemostato, richiede attenzione per i dettagli e la risoluzione dei problemi. Dal momento che la contaminazione è di grande preoccupazione in esperimenti di coltura continua, di solito cercare tramite microscopio per la contaminazione batterica e fungina su inoculazione e ogni 50 generazioni durante esperimenti a lungo termine evoluzione. Ad oggi non abbiamo osservato contaminazione tra 96 ​​esperimenti evoluzione maggiore di 300 generazioni (dati non mostrati). Per verificare la contaminazione incrociata tra Ministat e il potenziale di microbi di colonizzare la camera di coltura tramite la linea effluente correvamo 16 Ministat tali che ogni altra Ministat stato inoculato con lievito come sopra e il resto non sono stati inoculati con qualsiasi cultura. Le colture sono state campionate in un contenitore di rifiuti urbani, che è stato svuotato ogni altro giorno. Quindi, se fosse possibile per i contaminanti di entrare attraverso la linea di scarichi che probabilmente avrebbe osservato che in questo experiment. Nel corso di tre settimane e più di 100 generazioni di crescita in questo schema a scacchiera di colture inoculate e non inoculate non abbiamo osservato la crescita non inoculate provette di coltura Ministat, suggerendo che la contaminazione da lieviti dall&#39;esterno o altri microbi è improbabile che si verifichi in esperimenti di tempi simili. Anche se le Ministat sono stati progettati per operare in modo analogo a chemostati commerciali, la natura modulare di questa disposizione permette di ottimizzare per soddisfare le esigenze degli utenti e di bilancio. La pompa peristaltica utilizzata in questo protocollo può ottenere portate tra 0,0186 vol / hr a 3,6 vol / hr (dati non mostrati). Un maggiore controllo dei tassi di diluizione potrebbe essere realizzato con modelli di pompe alternative. Si noti che il funzionamento a bassi tassi di diluizione può richiedere la sostituzione di un ago calibro maggiore per ottenere la stessa frequenza di consegna goccia. Dimensione della popolazione è un fattore importante per la corretta progettazione di esperimenti di evoluzione.Il tasso di diluizione standard e la concentrazione dei nutrienti qui utilizzato fornisce una taglia popolazione relativamente grande (~ 10 9 cellule) dello stesso ordine di grandezza di studi pubblicati evoluzione. 11 popolazioni più grande o più piccolo potrebbe essere mantenuta modificando il volume di lavoro o limitando la concentrazione dei nutrienti. Fornitura mutazione aumentato potrebbe anche essere ottenuto lavorando con ceppi con elevati tassi di mutazione. Le Ministat potrebbe anche essere migliorata nel corso nostro sistema attuale. Ad esempio, in grado di raccogliere condensa sulle pareti del tubo di coltura e può essere notevolmente ridotto utilizzando un bagno d&#39;acqua profonda, incubatore, o ambiente a temperatura costante. Sebbene aggregazione e la crescita parete in solfato culture limitate sembra essere relativamente rare, appare in 5/48 esperimenti di evoluzione da 300 generazioni (dati non mostrati), una varietà di tensioattivi sono disponibili che può essere di aiuto nel ridurre o ritardare questo tratto. Nel caso in cui interferisce con agglomerante cultura adeguatamiscelazione, agitazione maggiore può essere ottenuto riducendo il numero di modi viene diviso ogni pompa di aria, o aggiungendo un apparato agitazione. Sonde aggiuntive per la concentrazione di gas disciolto, pH o altri parametri possono anche essere inclusi, come in alcuni altri disegni 17. Nonostante le modifiche possibili, in base alle Ministat come descritto in questo protocollo, abbiamo osservato parametri sperimentali altamente coerenti e risultati riproducibili quando si confrontano il nostro dispositivo con i dati riportati per chemostati volume maggiore commerciali. Questo incluso riproducibilità di fisiologia cellulare come visto attraverso il raggiungimento dello stato di equilibrio stazionario entro 10-15 generazioni (Figura 2A) e ottenendo densità cultura simile all&#39;equilibrio. Pattern di espressione genica erano coerenti tra biologico tre repliche in Ministat e tra Ministat e commerciali di grande volume piattaforme (Figura 2B), con l&#39;eccezione di geni metabolismo del ferro. Questi expression differenze sono probabilmente causati da cambiamenti nel contenuto di metallo tra i due dispositivi o miglioramento della qualità degli ingredienti media. I nostri dati suggeriscono che Ministat sarà utile per esperimenti di fisiologia o della concorrenza in cui è richiesto un ambiente coerente. Per verificare se il disegno Ministat è sufficiente per applicazioni sperimentali evoluzione ci siamo evoluti culture sotto limitazione solfato per 250 generazioni e utilizzato CGH per caratterizzare l&#39;amplificazione a livello del locus SUL1 -. Un segno distintivo di evoluzione a lungo termine in queste condizioni in chemostati di quantitativi maggiori 10 Abbiamo osservato amplificazione di SUL1 nei cloni da 4/4 esperimenti indipendenti in evoluzione solfato-limitati mezzi di comunicazione (Figura 2C). Nel suo insieme questi dati suggeriscono che Ministat sono una solida piattaforma che può essere utile per una varietà di applicazioni chemostato tradizionali. Anche se abbiamo dimostrato il loro uso in coltura di lievito in erba, i Ministat dovrebberoanche compatibile con altri organismi e disegni simili sono stati effettivamente utilizzati per la coltura di batteri e le specie di lievito altri. 16,17,25 Inoltre il volume più piccolo e cultura correlata ridotto bisogno di mezzi di comunicazione possono Ministat un&#39;alternativa interessante per esperimenti che richiedono costosi o esotici reagenti come può essere il caso in chimica o schermi genetici.

La dinamica della crescita microbica e l&#39;evoluzione sono fondamentali per microbiologia, ecologia, genetica e biotecnologie. Il metodo più comune di microbi coltura è in batch, in cui vengono inoculate cellule a bassa densità in brodo ricco di sostanze nutritive e cresciuta a saturazione. Anche se semplice da effettuare con attrezzature standard di laboratorio, colture in lotti sperimentare un ambiente fluttuante chimica e di conseguenza cambiando fisiologia cellulare. Questo ambiente eterogeneo crescita può provocare effetti secondari di crescita e lo stress che possono mascherare sottili differenze fisiologiche. L&#39;evoluzione sperimentale di trasferimento lotto di serie è possibile selezionare per le miscele complesse di crescita in fase sottopopolazioni specifiche, complicando i tentativi di connessione adattamenti a specifiche condizioni selettive. Misurazione dei fenotipi quantitativi può essere difficile a causa del rumore da calendario di campionamento imprecisa e variazione di caratteristiche come tempo di ritardo. Culture continui fornire un&#39;alternativaregime di crescita in cui le cellule possono essere coltivate riproducibile in un ambiente chimicamente omogenea ad un tasso di crescita definito per raggiungere uno stato fisiologico stazionario. Grazie a questi vantaggi, studi di evoluzione sperimentale e caratterizzazione di stato cellulare utilizzano spesso l&#39;ambiente controllato di coltura continua come il chemostato 14. Punteggio di questi vantaggi ha portato ad un ritorno di interesse in culture chemostato. 15 Sin dalla loro introduzione nel 1950, 1,2 chemostato sistemi sono stati sviluppati per funzionare su una varietà di scale che vanno da litri al microlitri e per una varietà di applicazioni. 16 -19 Questi disegni diversi, che vanno dalla bioreattori prodotti commercialmente alle navi glassblown personalizzati per piattaforme microfluidica, la quota di principi generali di progettazione. Camera di coltura viene agitata e aerato (di solito facendo gorgogliare aria attraverso di esso) ed i microbi esso contenute siano mantenute omogenealy dispersa la camera di coltura in ogni momento. Mezzo fresco di composizione viene aggiunto continuamente e la velocità di aggiunta controlla il tasso di crescita e influenza l&#39;ambiente chimico sperimentato dalla cultura. Un overflow imposta il volume di coltura nel tubo di crescita, e attraverso questo overflow la cultura saranno campionati con la stessa velocità con cui entra in terreno fresco. In questo modo le culture raggiungere in breve tempo uno stato fisiologico stabile in cui molti parametri biologici restano costanti. Nonostante i vantaggi di chemostati e le relazioni di queste diverse piattaforme presenti in letteratura, l&#39;adozione diffusa è stata limitata dalla difficoltà di costruzione e gestione di questi sistemi, e gli elevati costi connessi con i commerciali. Inoltre, le descrizioni di come creare e utilizzare questi dispositivi possono essere opachi. Presentiamo i disegni e le istruzioni per l&#39;uso di un piccolo ingombro serie di chemostati in miniatura costruito da ricambi facilmente disponibili a basso costo. Abbiamo obsErve parametri sperimentali altamente coerenti e risultati riproducibili quando si confrontano il nostro dispositivo con i dati riportati per il lievito in coltura in bioreattori grandi volumi commerciali. Questo include riproducibilità di fisiologia cellulare come visto attraverso il raggiungimento dello stato di equilibrio stazionario entro 10-15 generazioni e ottenendo densità cultura simile all&#39;equilibrio. Inoltre, i modelli di espressione genica sono coerenti tra Ministat e uno spot per più ampi volumi di piattaforma. Stabilità del tasso di diluizione, la densità ottica e la riproducibilità di espressione genica tra le tre culture repliche dimostrare la robustezza della nostra piattaforma. Abbiamo anche dimostrato che le stesse mutazioni adattive insorgere simili tempi di evoluzione sperimentali con chemostati volumi più grandi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> 3/32 &quot;x 7/32&quot; tubazioni in silicone </td><td> VWR </td><td> 63009-260 </td><td> Tubing: Ordine: (50 &#39;pacco batteria) </td></tr><tr><td> Mezzo di silicone &quot;x 5/8&quot; di tubo (extra large) </td><td> VWR </td><td> 63009-299 </td><td> Tubing: Ordine: (50 &#39;pacco batteria) </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;x 3/8&quot; di tubo in silicone (media) </td><td> VWR </td><td> 63009-279 </td><td> Tubing: Ordine: (50 &#39;pacco batteria) </td></tr><tr><td> Arancione verde Marprene pompa tubi </td><td> Watson-Marlow </td><td> 978.0038.00 + </td><td> Tubi: Order: 6x (confezione da 6) </td></tr><tr><td> Femmina luer, 1/8 &quot;barb </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45500-04 </td><td> Connettori: Ordine: 4x (pacchetto di 25) </td></tr><tr><td> Maschio Luer Lock, 1/8 &quot;barb </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45503-04 </td><td> Connettori: Ordine: 1x (pacchetto di 25) </td></tr><tr><td> Ridurre connettore, PVDF, 1/4 &quot;a 1/8&quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30703-50 </td><td> Connettori: Ordine: 1x (confezione da 10) </td></tr><tr><td> Spinato Connettore a Y, 1/8 &quot;ID </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-30703-92 </td><td> Connettori: Ordine: 3x (pacchetto di 10) </td></tr><tr><td> I morsetti del tubo Medio </td><td> VWR </td><td> 63022-405 </td><td> Morsetti: Ordine: 1x (confezione da 12) </td></tr><tr><td> Giorno Pinchcock (fascetta metallica per tubi) </td><td> VWR </td><td> 21730-001 </td><td> Morsetti: Ordine: 1x (pacchetto di 10) </td></tr><tr><td> In linea con valvola maschio attacco rapido, Adatto a tubo: 1/4 </td><td> Pescatore </td><td> 05-112-39 </td><td> Connettori: Ordine: 1x (pacchetto di 25) </td></tr><tr><td> Donne in linea con valvola attacco rapido, Adatto a tubo: 1/4 ID, Polipropilene </td><td> Pescatore </td><td> 05-112-37 </td><td> Connettori: Ordine: 1x (pacco da 5) </td></tr><tr><td> Pompe aria silenziosa </td><td> <a href="http://www.aquariumguys.com/" target="_blank">Acquario Guys.com</a> </td><td> 212422 </td><td> Alimentazione aria: Ordina: 4 pompe </td></tr><tr><td> Filtri in PTFE, 0,45 micron, per la filtrazione dell&#39;aria </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-02915-22 </td><td> Alimentazione aria: Ordina: 1x (confezione da 100) </td></tr><tr><td> Borraccia 1L con braccio laterale </td><td> Pescatore </td><td> 10-181F </td><td> Air Supply: Ordina: 2x (confezione da 6) </td></tr><tr><td> # 8 tappo in silicone, 3/8 nel foro, per fiaschi sidearm </td><td> Pescatore </td><td> K953715-0801 </td><td> Alimentazione aria: Ordina: 8 tappi </td></tr><tr><td> 4 porte collettore </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06464-85 </td><td> Alimentazione aria: Ordina: 8 collettori </td></tr><tr><td> 55 ml Tappo a vite cultura tubi </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 9825-25 </td><td> Sezione Cultura: Ordina: 2x (pacchetto di 48) </td></tr><tr><td> Regular bianco ago ipodermico hub, 16G, 5 pollici di lunghezza per la linea degli effluenti </td&gt; <td> Pescatore </td><td> 14-817-105 </td><td> Sezione Cultura: Ordina: 1x (confezione da 100) </td></tr><tr><td> Rubinetto ago spinale </td><td> VWR </td><td> BD40836 </td><td> Sezione Cultura: Ordina: 4x (pacchetto di 10) </td></tr><tr><td> Ago ipodermico Regular rosa </td><td> Pescatore </td><td> 14-817-104 </td><td> Sezione Cultura: Ordina: 1x (confezione da 100) </td></tr><tr><td> Schiuma in silicone tappo formato &quot;2&quot;, rosa </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-06 </td><td> Sezione Cultura: Ordina: 2x (pacchetto di 20) </td></tr><tr><td> 8-Well tubo Rack </td><td> VWR </td><td> 82024-452 </td><td> Cultura della Camera: Ordine: 4 rack </td></tr><tr><td> Reservoir bottiglia 10L con uscita tubo inferiore: sicuro vuoto </td><td> VWR </td><td> 89001-530 </td><td> Media: Ordine: 2 o più </td></tr><tr><td> Giallo silicone tappo di schiuma, non standard taglia 12 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-22 </td><td> Media: Ordine: 2 o più </td></tr><tr><td> Damigiana di sfiato filtro </td><td> Pescatore </td><td> SLFG 050 10 </td><td> Media: Ordine: 1x (pacchetto di 10) </td></tr><tr><td> Nastro elettrico, verde </td><td> <a href="http://Amazon.com" target="_blank">Amazon.com</a> </td><td> 10851-BA-10 </td><td> Media: Ordine 1 rotolo. </td></tr><tr><td> Bottiglia filtro superiore, 1L, 0,2 micron, 45 mm </td><td> VWR </td><td> 29442-978 </td><td> Media: Ordine: (1 caso su 12) </td></tr><tr><td> 5000 ml flacone con serbatoio scarico di fondo: vacuum sicuro </td><td> VWR </td><td> 89003-384 </td><td> Media: (Opzionale) </td></tr><tr><td> Blu Tappo in silicone Schiuma, nonstandardsize 10 1/2 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-18 </td><td> Media: (Opzionale) </td></tr><tr><td> 205S/CA16, 16 Cartuccia pompa </td><td> Watson-Marlow </td><td> 020.3716.00A </td><td> Media Pompa: ordinabile: 1 </td></tr><tr><td> 16 canali 205CA Estensione testa della pompa </td><td> Watson-Marlow </td><td> 023.1401.000 </td><td> Media della pompa: Ordina: teste della pompa 2 Estensione </td></tr><tr><td> Silicone sigillante acquario </td><td> Pescatore </td><td> S18180B </td><td> Media Pompa: ordinabile: 1 </td></tr><tr><td> 6-blocco di bagno a secco </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Ordina: 2 per 32 Ministat o 1 per 16. </td></tr><tr><td> Blocco per drybath, 6 x 25 mm provetta per blocco </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Ordina: 12 per 32 Ministat o 6 per 16. </td></tr><tr><td> Filtri a membrana in nylon, 0,45 micron Dimensione dei pori, Dia: 25 mm. </td><td> Pescatore </td><td> R04SP02500 </td><td> Raccolta: Ordina: 1x (confezione da 100) (facoltativo) </td></tr><tr><td> Filtri a membrana in nylon, 0,45 micron Dimensione dei pori; 45 millimetri </td><td> Pescatore </td><td> R04SP04700 </td><td> Raccolta: Ordina: 1x (confezione da 100) (facoltativo) </td></tr><tr><td> 47 mm, grande apparato filtro </td><td> Pescatore </td><td> XX10 047 30 </td><td> Raccolta: Ordine: 1 (opzionale) </td></tr><tr><td> Glass portafiltro, 25 mm, piccola apparecchiatura filtro </td><td> VWR </td><td> 26316-692 </td><td> Raccolta: Ordine: 1 (opzionale) </td></tr><tr><td> Dewar pallone, 1L per azoto liquido </td><td> VWR </td><td> 63380-052 </td><td> Raccolta: Ordine: 1 (opzionale) </td></tr></tbody></table>

progettazione e utilizzo di matrici chemostato multiplexing

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostati sono sistemi di coltura continua in cui le cellule vengono coltivate in un ben ambiente controllato chimicamente costante dove è vincolato densità cultura limitando specifici nutrienti. 1,2 I dati chemostati sono altamente riproducibili per la misurazione dei fenotipi quantitative che forniscono un tasso di crescita e l&#39;ambiente allo stato stazionario. Per queste ragioni, chemostati sono diventati strumenti utili per la messa a livello della fisiologia caratterizzazione attraverso l&#39;analisi di espressione genica 3-6 e le altre caratteristiche di culture allo steady-state di equilibrio. 7 a lungo termine esperimenti chemostati può evidenziare traiettorie specifiche popolazioni microbiche adottano durante l&#39;evoluzione adattativa in un ambiente controllato. Infatti, chemostati sono stati utilizzati per evoluzione sperimentale dalla loro invenzione. 8 Un risultato comune in esperimenti evoluzione è per ciascun replicato biologica di acquisire un repertorio di mutazioni. 9-13 Questa diversità suggerisce che c&#39;è ancora molto da scoprire eseguendo esperimenti di evoluzione con velocità di gran lunga maggiore. Vi presentiamo qui la progettazione e gestione di una relativamente semplice, a basso costo di serie chemostati-o miniatura Ministat-e convalidare il loro uso nella determinazione della fisiologia e in esperimenti di evoluzione con lievito. Questo approccio comporta una crescita di decine di chemostati scappare un singolo multiplex pompa peristaltica. Le colture sono mantenuti ad un volume di 20 ml di lavoro, che è pratico per una varietà di applicazioni. La nostra speranza è che l&#39;aumento della produttività, riduzione costi, e fornendo costruzione dettagliate e istruzioni operative può anche motivare la ricerca e l&#39;applicazione industriale di questo progetto come una piattaforma generale per caratterizzare funzionalmente un gran numero di ceppi, specie, e parametri di crescita, oltre che genetica o farmaci biblioteche.

La matrice Ministat sopra descritta e nella (Figura 1A, B) è stato utilizzato per la cultura un aploide MATA ceppo di laboratorio di lievito in erba (S288c) in solfato di limitazione condizioni come descritto in precedenza 10. Abbiamo testato l&#39;efficacia per le applicazioni più comuni chemostato compresa la determinazione della fisiologia e evoluzione sperimentale. Per convalidare i Ministat, abbiamo ripetuto diversi esperimenti condotti in precedenza fermentatori industriali modificati per uso chemostato. 10,20,21 Sixfors ATR fermentatori sono state eseguite in un volume 300 ml di lavoro, oltre dieci volte il volume dei Ministat, e hanno modi molto diversi di aerazione cultura e di agitazione. Abbiamo tentato di replicare la stabilità attrezzature, fisiologia stato stazionario, i risultati sperimentali evoluzione, e modelli di espressione genica ottenuti con questi fermentatori. Dal momento che l&#39;uniformità del tasso di diluizione e di aerazione sono aspetti importanti del progetto chemostato, abbiamo measured il tasso effettivo di diluizione in 32 Ministat dopo 15 generazioni di crescita e ha scoperto che con un tasso di diluizione obiettivo di 0,17 vol / h (4-5 gocce / min) abbiamo raggiunto un tasso medio di 0,17208 diluizione con una deviazione standard di 0,0075 in 32 replica. Questa gamma era alla nostra tolleranza tipica di + / -0,01 vol / h differenza dalla definizione degli obiettivi, oltre il quale cambiamenti su larga scala dell&#39;espressione genica sono stati osservati. 22-23 su 4 Ministat la portata d&#39;aria è stato determinato in 307,5 ​​ml / min con una deviazione standard di 9,57 ml / min. Questo suggerisce che il flusso d&#39;aria nelle camere è robusto e divisi tra i quattro camere ed è un valore simile a quello descritto per l&#39;aerazione in fermentatori industriali. 20 Abbiamo già osservato l&#39;amplificazione del ricorrente ad alta affinità di zolfo agli ioni di SUL1 trasportatore in 8/8 solfato-limitati esperimenti di evoluzione nel lievito. 10 Data la coerenza dei risultati in thicondizione s abbiamo scelto solfato-limitazione per verificare la capacità del nostro sistema. Un elemento requisito della cultura chemostato è la necessità di mantenere un ambiente costante chimica. Fluttuazioni l&#39;abbondanza di un cambiamento di limitazione nutritiva o di altro ambiente tipicamente risultare in un cambiamento del numero di cellule in una data cultura. Abbiamo misurato la densità ottica come proxy per numero di cellule (Figura 2A) e riproducibilità misurato in 16 repliche culture, trovare un A600 media di 1.12 (~ 10 9 celle) dopo circa 15 generazioni di crescita con una deviazione standard di 0,057 unità, o 5.1 %. Per confronto, le misure prese da 4 colture replicate coltivate nei fermentatori industriali hanno mostrato una deviazione standard di 2,5%. Cellule erano ben miscelato nella camera di crescita: misurazioni di OD e di cellule sulla pista effluenti erano equivalenti ai campioni prelevati direttamente dal tubo cultura (dati non mostrati). Questi risultati dimostrano la robustezza della nostra piattaforma und capacità di mantenere un ambiente costante chimico entro una tolleranza simile come il fermentatore industriale. Come una lettura più sensibile della fisiologia, abbiamo confrontato il genoma stazionario espressione genica stato da colture cresciute sotto limitazione solfato nelle Ministat e nel fermentatore industriale. Espressione genica nelle Ministat mostrato un alto grado di somiglianza tra tre repliche biologica (Figura 2B). Abbiamo precedentemente notato che per RNA derivati ​​da due chemostati replicati Sixfors e co-ibridato ad un microarray, espressione del 99% dei geni rientra in un intervallo di 1,5 volte, permettendo l&#39;uso di 1,5 X come cutoff significato empirico. 21 espressione genica da Ministat tre repliche, rispetto a coppie, ha mostrato il 99% dei geni rientrava in un range 1,5-1,7 volte, paragonabile ai risultati dei fermentatori industriali. I tre campioni sono stati ibridati per singoli array ed i rapporti a coppie calcolate in seguito, per cui questi value includono inter-matrice rumore oltre al rumore biologico, potenzialmente sovrastimare la variazione tra replicati rispetto ai pubblicate, co-ibridizzati risultati. 138 geni sono differenzialmente espressi&gt; 1.5 volte in tutto Ministat tre repliche rispetto ad un campione prelevato da una coltura cresciuta abbinato nel fermentatore industriale. I geni sono diminuiti in espressione nei Ministat sono stati fortemente arricchito per il metabolismo del ferro. Questa firma può riflettere la diversa composizione metallica di ogni configurazione del dispositivo: l&#39;apparecchio Sixfors comprende una girante in metallo e montaggio aerazione immersi nella cultura, e la damigiane supporti precedentemente utilizzati anche richiesto hardware in metallo. Il Ministat utilizza aghi di acciaio inossidabile, ma non componenti metallici. I geni con aumentata espressione sono stati in gran parte associato con le membrane cellulari, anche se il significato biologico di questa associazione non è chiaro. Infine, abbiamo testato unde sperimentale evoluzioner queste condizioni. Dopo 250 generazioni di solfato-limitata crescita, 4/4 cloni testati da 4 popolazioni indipendenti evoluzione mostrato amplificazione SUL1 come rilevato da Genomic Hybridization matrice comparativa (CGH, Figura 2C). Questo risultato è coerente con quanto rilevato negli chemostati di quantitativi maggiori su intervalli di tempo simili 10. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1highres.jpg"/> Figura Design 1. Design A. e disposizione della matrice Ministat. B. della camera di coltura. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2highres.jpg"/> Figura 2. A. Experimentale dati che dimostrano che le culture raggiungere l&#39;equilibrio nel raggio di dieci generazioni di crescita (n = 16). dati di espressione B. biologica tre repliche S1-3 campionati durante lo stato stazionario in solfato di limitazione rispetto ad un riferimento comune cresciuto in un corrispondente solfato-limitata chemostato Sixfors C.. amplificazioni SUL1 recuperato in Ministat dopo 250 generazioni di crescita in un solfato di un ambiente limitato. DNA genomico da ciascun clone è stato evoluto rispetto al DNA ancestrale da CGH come descritto. 21 Il numero medio di copia è stato calcolato per ogni regione amplificata ed è indicato accanto a ciascun amplicone. Tutti i dati di microarray sono depositati nella banca dati GEO in adesione GSE36691. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50262/50262fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura.</a>

Abbiamo sviluppato e validato un piccolo ingombro serie di chemostati in miniatura costruito da prontamente parti disponibili per basso costo. Risultati evoluzione fisiologiche e sperimentali sono stati simili a chemostati volumi più grandi. La matrice Ministat fornisce una piattaforma compatta, poco costoso, e accessibile per gli esperimenti chemostato tradizionali, genomica funzionale, e le applicazioni di screening chimici.

Progettazione e utilizzo di matrici chemostato multiplexing

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

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