Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le regioni di legame delle proteine tramite la cromatina. Questo viene ottenuto innanzitutto cross-linkando la proteina al DNA. Il secondo passaggio consiste nel frammentare il DNA.

Successivamente, la proteina bersaglio legata al DNA viene immunoprecipitata e poi eluita. L'ultimo passaggio consiste nel reversare il cross-link e isolare il DNA. In definitiva, l'immunoprecipitazione della cromatina viene utilizzata per mostrare la localizzazione del legame proteico lungo il genoma.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della genomica funzionale, come l'identificazione e la mappatura delle interazioni proteina-DNA in un determinato tessuto o linea cellulare. Le cellule per questa procedura vengono coltivate in piatti per colture cellulari da 100 per 20 millimetri. La quantità di cellule può variare da uno a 10 milioni di cellule per piatto, a seconda del tipo cellulare. Circa 2 milioni di cellule sono sufficienti per un'immunoprecipitazione al fine di cross-linkare proteine e cromatina all'interno delle cellule.

Aggiungere formaldeide fino a una concentrazione dell'1% e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con agitazione occasionale; bloccare la reazione di cross-linking aggiungendo glicina fino a una concentrazione finale di 125 millimolare e incubando per cinque minuti. Lavare le cellule due volte con PBS 1x a temperatura ambiente; dopo il secondo lavaggio, eliminare il PBS e aggiungere 0,2 millilitri di PBS fresco; raccogliere le cellule con una spatola in plastica in una provetta da microcentrifuga. Centrifugare le cellule a 2000 RPM per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Aspirare il soprannatante per l'estrazione dei nuclei. Mantenere le cellule sotto forma di pellet per la preparazione di un lisato totale di cellule, che verrà illustrata nel prossimo segmento. Risospendere le cellule in buffer di lisi SDS; i lisati totali di cellule vengono preparati dalle cellule cross-linkate mediante sonicazione su ghiaccio umido.

Utilizzando un sonicator, per ottenere la dimensione ideale del frammento di DNA, questa procedura deve essere ottimizzata provando diverse condizioni di sonificazione. I campioni devono rimanere sul ghiaccio per tutta la durata della procedura. Sonificare ogni campione con queste impostazioni: 30 secondi accesi e 45 secondi spenti, con un'ampiezza impostata a due.

In questo esempio, sono necessari 12 cicli per ottenere la dimensione ideale del frammento. Raccogliere 20 microlitri di ogni campione per verificare i risultati della sonificazione e per la quantificazione. Il resto del campione può essere conservato a meno 80 gradi Celsius.

Diluire il campione di 20 microlitri aggiungendo 30 microlitri di tampone 0,1 XTE. Successivamente, trattare il campione con un microlitro di RNAsi A a 37 gradi Celsius per un'ora. Poi, aggiungere un microlitro di proteinasi K e incubare a 62 gradi Celsius per due ore.

Dopo il trattamento con proteinasi K, eseguire 20 microlitri del campione su un gel di agarosio al 2%. I campioni dovrebbero presentare una striscia con la maggior parte del DNA alla dimensione desiderata. Se vengono testati diversi cicli, si dovrebbe osservare una graduale riduzione della dimensione.

Con l'aumentare del numero di cicli, la quantità residua di campione verrà purificata con un kit di purificazione rapida PCR kaya e quantificata utilizzando uno spettro NanoDrop di TER per iniziare questa procedura. Fava campioni di cromatina sonificati in ghiaccio centrifugati a 12.000 giri al minuto per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Mettere immediatamente in ghiaccio.

Per rimuovere l'SDS, che appare come un pellet bianco. Raccogliere il soprannatante e scartare il pellet da ogni campione. Combinare i campioni se necessario, mettendo da parte le quantità necessarie per l'esperimento in base ai calcoli precedenti.

Da 1 a 10 microgrammi di cromatina sono richiesti per ogni immunoprecipitazione. Diluire la cromatina da uno a dieci in tampone di diluizione supplementato con inibitore della proteinasi. Aggiungere 100 microlitri di perline bloccate per ogni immunoprecipitazione ed agitare a quattro gradi Celsius per un'ora.

Iniziare la procedura di immunoprecipitazione della cromatina centrifugando i campioni a 800 giri/min per un minuto a quattro gradi Celsius e trasferendo ogni sopranatante in una provetta nuova. Centrifugare il sopranatante a 800 giri/min per un minuto e trasferirlo in un'altra provetta pulita. Conservare 20 microlitri del sopranatante a meno 20 gradi Celsius come controllo di input.

In seguito, aliquotare il resto della cromatina nel numero di immunoprecipitazioni richieste dall'esperimento. A ogni campione, aggiungere due microgrammi di anticorpo per ogni uno-10 microgrammi di cromatina e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius con rotazione. Nella mattina seguente, aggiungere 100 microlitri di perle di aros bloccate a ciascun campione di immunoprecipitazione. Incubare per un'ora a quattro gradi Celsius con rotazione dopo un'ora.

Centrifugare le perle a 800 giri/min per un minuto per formare il pellet. Eliminare il più possibile il sopranatante. Lavare le perle.

Una volta con un tampone di lavaggio a basso contenuto salino per il complesso immunitario, aggiungere un millilitro di tampone a ogni provetta. Incubare in rotazione a temperatura ambiente per cinque-otto minuti, quindi centrifugare a 800 giri al minuto per un minuto dopo aver eliminato il surnatante; lavare i campioni una volta con tampone di lavaggio per complesso immunitario ad alto contenuto salino, una volta con tampone di lavaggio al cloruro di litio, una volta con tampone di lavaggio per complesso immunitario e due volte con tampone TE, per un totale di cinque lavaggi. Successivamente, il DNA viene eluito da ciascun campione di immunoprecipitazione e anche dai campioni di input.

Per invertire il legame incrociato, aggiungere otto microlitri di cloruro di sodio 5 M a 200 microlitri di ciascun eluato e controllo input. Sigillare le provette con param e incubare in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno seguente, trattare ogni campione con un microlitro di RNAsi A per un'ora a 37 gradi Celsius.

Dopo un'ora, aggiungere quattro microlitri di EDTA 0,5 M e otto microlitri di tris HCl 1 M a ciascun campione e mescolare. Quindi aggiungere un microlitro di proteinasi K e incubare a 45 gradi Celsius per due ore. Purificare i campioni utilizzando il kit di purificazione PCR kaya quick.

I campioni possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'analisi mediante PCR. L'arricchimento ottenuto mediante immunoprecipitazione della cromatina può essere verificato tramite PCR o PCR in tempo reale. Per i campioni sottoposti a PCR, dopo elettroforesi su gel di agarosio, dovrebbero essere visibili bande nelle corsie del campione di input e del campione ChIP, utilizzando un anticorpo specifico per la proteina di interesse, in questo caso il fattore di trascrizione TCF7L2. Al contrario, nella corsia del controllo negativo IgG relativa alla regione di legame positivo non dovrebbe essere presente alcuna banda o al massimo una banda molto debole.

Per la regione di legame negativa. Dovrebbe essere presente una banda molto debole o del tutto assente nelle corsie del controllo IgG e del chip. Dovrebbe essere presente una banda nella corsia dell'input.

Questa figura mostra i risultati ottenuti dagli stessi campioni analizzati mediante PCR in tempo reale. Come per il risultato precedente, si dovrebbe osservare un arricchimento significativo in termini di numero di copie della regione di legame positiva per il campione chip rispetto al controllo IgG.

Inoltre, dovrebbe esserci un arricchimento minimo, se non nullo, nella regione di legame negativa. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come incrociare il legame della proteina alla cromatina in un tessuto o in una linea cellulare, precipitare la proteina bersaglio e quindi isolare il DNA per ulteriori analisi.