Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)
19 aprile 2013
La combinazione di immunoprecipitazione della cromatina e sequenziamento ultra-high-throughput (ChIP-seq) in grado di identificare e mappare le interazioni proteina-DNA in una determinata linea di tessuti o cellule. Delineato è come generare un modello di chip per la successiva sequenza di alta qualità, utilizzando l'esperienza con il fattore di trascrizione TCF7L2 come esempio.
L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le regioni di legame delle proteine tramite la cromatina. Ciò si ottiene legando prima la proteina al DNA. Il secondo passo è quello di tosare il DNA.
Successivamente, la proteina bersaglio legata al DNA viene immunoprecipitata e quindi allusa. Il passaggio finale consiste nell'invertire il legame incrociato e isolare il DNA. In definitiva, l'immunoprecipitazione della cromatina viene utilizzata per mostrare la localizzazione del legame proteico in tutto il genoma.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genomica funzionale, come l'identificazione e la mappatura delle interazioni tra proteine e DNA in un determinato tessuto o linea cellulare, le cellule per questa procedura vengono coltivate in piastre di coltura cellulare da 100 x 20 millimetri. La quantità di cellule può variare da uno a 10 milioni di cellule per piatto, a seconda del tipo di cellula. Circa 2 milioni di cellule sono sufficienti per un'immunoprecipitazione per reticolare la proteina e la cromatina nelle cellule.
Aggiungere formaldeide all'1% e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente con occasionale reticolazione a dondolo aggiungendo glicina a una concentrazione finale di 125 millimolari e incubando per cinque minuti. A temperatura ambiente, lavare le celle due volte con una soluzione salina tamponata con fosfato dopo il secondo lavaggio, decantare il PBS e aggiungere 0,2 millilitri di cellule di raccolta PBS fresche con un raschietto per celle di plastica in una provetta per microcentrifuga. Far girare le celle a 2000 giri/min per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare il surnatante per l'estrazione nucleare. Conservare le cellule come pellet per preparare un lisato di cellule intere, che verrà dimostrato nel segmento successivo. Le cellule sospese Resus in tampone di lisi SDS I lisati di cellule intere vengono preparati dalle cellule reticolate mediante sonicazione su ghiaccio umido.
Utilizzo di un My ator Per ottenere la dimensione ideale del frammento di DNA, questa procedura deve essere ottimizzata provando diverse condizioni di sonicazione. I campioni devono rimanere in ghiaccio per tutta la durata della procedura. Sonicare ogni campione con queste impostazioni, 30 secondi in avanti e 45 secondi in modalità di spegnimento con un'impostazione di ampiezza di due.
In questo esempio, sono necessari 12 cicli per ottenere la dimensione ideale del frammento. Raccogli 20 microlitri di ogni campione per controllare i risultati della sonicazione e per la quantificazione. Il resto del campione può essere conservato a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.
Diluire il campione da 20 microlitri aggiungendo 30 microlitri di tampone XTE 0,1. Quindi trattare il campione con un microlitro di RNA A a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, aggiungere un microlitro di proteinasi K e incubare a 62 gradi Celsius per due ore.
Dopo il trattamento con proteinasi K, eseguire 20 microlitri di campione su un gel agros al 2%. I campioni devono presentare uno striscio con la maggior parte del DNA alla dimensione desiderata. Se vengono testati diversi cicli, si dovrebbe osservare una graduale diminuzione delle dimensioni.
All'aumentare del numero di cicli, la quantità rimanente di campione verrà purificata con un kit di purificazione PCR rapida kaya e quantificata utilizzando uno spettro NanoDrop di TER per iniziare questa procedura. Campioni di cromatina sonicata Fava su centrifuga di ghiaccio a 12.000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Metti subito sul ghiaccio.
Per rimuovere la SDS, che appare come un pallino bianco. Raccogliere il surnatante e scartare il pellet da ogni campione. Combinare i campioni se necessario, mettere da parte le quantità necessarie per l'esperimento in base ai calcoli precedenti.
Per immunoprecipitazione sono necessari da uno a 10 microgrammi di cromatina. Diluire il tampone di diluizione della cromatina da uno a 10 inchi integrato con un inibitore della proteinasi. Aggiungere 100 microlitri di velocità aro bloccate per immunoprecipitazione e ruotare a quattro gradi Celsius per un'ora.
Iniziare la procedura per l'immunoprecipitazione della cromatina centrifugando i campioni a 800 giri/min per un minuto a quattro gradi Celsius e trasferendo ciascun surnatante in una provetta nuova. Centrifugare il surnatante a 800 giri/min per un minuto e trasferirlo in un'altra provetta pulita. Conservare 20 microlitri di surnatante a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per fungere da controllo dell'ingresso.
Successivamente aliquotare il resto della cromatina al numero di immunoprecipitazioni richieste nell'esperimento. A ciascun campione, aggiungere due microgrammi di anticorpi per uno a 10 microgrammi di cromatina incubare per una notte a quattro gradi Celsius con rotazione La mattina seguente, aggiungere 100 microlitri di perle di aros bloccate a ciascun campione di immunoprecipitazione. Incubare per un'ora a quattro gradi Celsius con rotazione dopo un'ora.
Pellettare le perline girando a 800 giri/min per un minuto. Scartare la maggior parte possibile del surnatante. Lavare le perline.
Una volta con un tampone di lavaggio del complesso immunitario a basso contenuto di sale, aggiungere un millilitro di tampone a ciascuna provetta. Ruotare a temperatura ambiente per cinque-otto minuti e poi centrifugare a 800 giri/min per un minuto dopo aver scartato le perle di lavaggio del surnatante una volta con il tampone di lavaggio del complesso immunitario ad alto contenuto di sale, una volta con cloruro di litio, il tampone di lavaggio del complesso immunitario e due volte con il tampone TE per un totale di cinque lavaggi. Successivamente, il DNA viene alluso da ciascun campione di immunoprecipitazione e dai campioni di input.
Per invertire il legame incrociato, aggiungere otto microlitri di cloruro di sodio a cinque molari a 200 microlitri di ciascun elu e il controllo dell'input. Sigillare le provette con param e incubare in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius per una notte. Il giorno seguente, trattare ogni campione con un microlitro di RNA, per un'ora a 37 gradi Celsius.
Dopo un'ora, aggiungere quattro microlitri di EDTA 0,5 molare e otto microlitri di tris HCL molare a ciascun campione e mescolare. Quindi aggiungere un microlitro di proteinasi K e incubare a 45 gradi Celsius per due ore. Purificare i campioni utilizzando il kit di purificazione rapida kaya PCR.
I campioni possono essere salvati a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius fino a quando non vengono esaminati mediante PCR. L'arricchimento mediante immunoprecipitazione della cromatina può essere controllato mediante PCR o PCR in tempo reale Per i campioni PCR, elettroreferenziato su un gel agros, dovrebbero esserci bande nelle corsie di input e di campionamento del chip utilizzando un anticorpo per la proteina di interesse, che in questo caso è il fattore di trascrizione TCF sette L due. Al contrario, non dovrebbe esserci nulla o al massimo una banda molto debole nella corsia di controllo negativo delle IgG per la regione di legame positivo.
Per l'area di legame negativo. Dovrebbe esserci una banda molto debole o nessuna banda per il controllo IgG e le corsie dei chip. Dovrebbe esserci una banda nella corsia di input.
Questa figura mostra i risultati degli stessi campioni esaminati mediante PCR in tempo reale. Come per il risultato precedente. Dovrebbe esserci un significativo arricchimento della regione di legame positivo per il campione di chip rispetto al controllo IgG.
Inoltre, l'arricchimento nella regione di legame negativo dovrebbe essere molto ridotto, se non nullo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come legare la proteina alla cromatina in un tessuto o in una linea cellulare, e cioè precipitare la proteina bersaglio e quindi isolare il DNA per ulteriori analisi.
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Panoramica
Questo articolo delinea una procedura per identificare le regioni di legame proteico utilizzando l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Il metodo prevede il cross-linking delle proteine al DNA, il frantumamento del DNA, l'immunoprecipitazione del complesso proteina-DNA e l'isolamento del DNA per il sequenziamento.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Genomica
- Biologia molecolare
Sfondo
- L'immunoprecipitazione della cromatina è una tecnica utilizzata per studiare le interazioni proteina-DNA.
- ChIP-seq permette il sequenziamento ad alto rendimento di queste interazioni.
- Comprendere il legame proteico è fondamentale per chiarire la regolazione genica.
- TCF7L2 funge da fattore di trascrizione modello in questo studio.
Obiettivo dello studio
- Identificare e mappare le interazioni proteina-DNA in tessuti o linee cellulari specifiche.
- Generare un template ChIP di alta qualità per il sequenziamento.
- Dimostrare l'applicabilità di ChIP-seq utilizzando TCF7L2 come esempio.
Metodi utilizzati
- Cross-linking delle proteine al DNA per stabilizzare le interazioni.
- Frantumazione del DNA per creare frammenti gestibili.
- Immunoprecipitazione del complesso proteina-DNA per isolare il bersaglio.
- Inversione dei cross-link e isolamento del DNA per il sequenziamento.
Principali risultati
- Identificazione con successo delle regioni di legame proteico in tutto il genoma.
- Dimostrato l'efficacia del metodo ChIP-seq.
- Fornito informazioni sulla localizzazione del legame di TCF7L2.
- Stabilito un protocollo per futuri studi sulle interazioni proteina-DNA.
Conclusioni
- ChIP-seq è uno strumento potente per studiare la regolazione genica.
- Il metodo può essere applicato a vari fattori di trascrizione oltre a TCF7L2.
- La ricerca futura può basarsi su questo protocollo per esplorare altre interazioni proteina-DNA.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
High-quality ChIP-seq DNA template generation is foundational for mapping genome-wide protein-DNA interactions, directly impacting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Reliable identification of transcription factor binding sites, such as TCF7L2, enables predictive confidence in gene regulation studies and informs portfolio triage for complex disease targets. This workflow supports scalable, reproducible insights essential for advancing discovery-stage assets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables genome-wide mapping of transcription factor binding for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying direct regulatory interactions in disease-relevant cell lines.
- Provides high-resolution data to inform predictive confidence and early portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated DNA templates for downstream sequencing and quantitative analysis.
- Facilitates assay reproducibility through standardized chromatin preparation and immunoprecipitation controls.
- Enables robust screening of protein-DNA interactions across multiple conditions or compounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein-DNA interaction data with disease-relevant models, such as colorectal carcinoma cell lines.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by linking transcription factor binding to gene regulation in pathogenesis.
- Provides a platform for biomarker identification and mechanistic studies in translational research.
Pipeline & Workflow Integration
This ChIP-seq DNA template generation method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven mapping of protein-DNA interactions for pathway clarification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative DNA templates for high-throughput sequencing and comparative analysis.
- Analytics: Supports quantitative PCR and sequencing readouts to compare binding enrichment across conditions.
- Translational Research: Connects transcription factor binding data to disease models for biomarker and mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes chromatin preparation and immunoprecipitation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on direct regulatory evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in chromatin biology, immunoprecipitation, and sequencing workflows.
- Demands access to high-quality antibodies, cell culture, and sequencing infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample preparation and controls.
- Adaptable to various cell lines and transcription factors with protocol optimization.
- Dependent on quantitative validation steps, such as PCR and sequencing, for quality assurance.
