Generazione di Allineati tessuto funzionale del miocardio attraverso la stampa microcontatto

Lo scopo del seguente esperimento è generare un tessuto miocardico funzionale allineato mediante stampa per contatto microscopica. Questo viene ottenuto innanzitutto stampando per contatto microscopico la fibronectina su substrati di poli dimetil silossano. Come secondo passaggio, doppia transgenesi.

Linee di cellule staminali embrionali vengono differenziate in vitro e isolate mediante il sorting cellulare attivato da fluorescenza, che consente di ottenere popolazioni altamente purificate di progenitori fortemente cardiogenici. Successivamente, i progenitori cardiaci isolati vengono seminati su substrati microincisi in PDMS per indurli a allinearsi e assumere una forma allungata simile a quella dei miociti cardiaci. I risultati ottenuti dimostrano l'isolamento riuscito e la crescita anisotropa dei progenitori cardiaci, basandosi su dati e analisi di immunofluorescenza.

La generazione di un tessuto miocardico isotropo può contribuire ai progressi nei campi della biologia delle cellule staminali e dell'ingegneria tissutale, aprendo la possibilità di sviluppare saggi cellulari specifici per malattia utili alla scoperta e allo sviluppo di farmaci, e gettando le basi per la medicina rigenerativa cardiaca. Per prima cosa, pesare 180 g di poli(dimetilsilossano) elastomero in un rapporto di 10 a 1 con l'agente indurente e mescolare accuratamente.

Disgassare l'assemblaggio utilizzando un essiccatore per eliminare eventuali bolle d'aria. Versare il PDMS in uno stampo precedentemente realizzato con creste di 20 micron di larghezza e due micron di spessore, separate da una distanza di 20 micron, quindi polimerizzare per due giorni in un essiccatore a temperatura ambiente per ottenere stampi in PDMS microstrutturati. Dopo aver reso le superfici dello stampo in PDMS idrofile mediante un pulitore al plasma.

Sterilizzare i timbri con etanolo al 70% per un minuto. All'interno di una cappa a sicurezza biologica, asciugarli rapidamente con aria compressa. Coprire le superfici sterili dei timbri con soluzione di fibronectina per un assorbimento di almeno 10 minuti dopo l'assorbimento.

Scuotere via la soluzione di fibronectina dai timbri ed asciugare rapidamente con aria compressa. Stabilire un contatto conformale tra il timbro e le coprioggetti di vetro rivestiti in PDMS precedentemente preparati, come descritto nel protocollo testuale, per due minuti premendo con fermezza. Lavare i substrati micro-patterning con acqua distillata.

Conservarli in acqua distillata per un massimo di due settimane a quattro gradi Celsius, a meno che non debbano essere utilizzati immediatamente. Rivestire le piastre a sei pozzetti con gelatina sterile allo 0,1% in acqua distillata e lasciare assorbire per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Durante questo periodo, preparare i fibroblasti embrionali di topo da un'aliquote congelata aggiungendoli a 50 millilitri di PBS in un tubo conico. Centrifugare il metà a 1000 giri al minuto per cinque minuti e risospendere il pellet nel mezzo di coltura.

Trascorso il tempo di incubazione, aspirare l'eccesso di gelatina e aggiungere il MES nei pozzetti. Lasciare il MES un giorno per consentirne l'adesione. Preparare le cellule staminali embrionali o cellule ES da un'aliquote prelevata aggiungendole a 50 millilitri di PBS in un tubo conico. Centrifugare.

Centrifugare le cellule staminali embrionali a 1000 g per cinque minuti e risospendere in mezzo per cellule staminali embrionali. Aggiungere le cellule staminali embrionali alle pozzette contenenti mitomicina e mantenere nel mezzo per cellule staminali embrionali fino al raggiungimento della confluenza per ottenere cellule staminali embrionali confluenti. Aspirare prima il mezzo per cellule staminali embrionali e lavare le cellule una volta con PBS sterile.

Quindi aspirare il PBS e aggiungere 500 microlitri di tripsina nel pozzetto. Incubare la piastra per tre minuti e mezzo a 37 gradi Celsius. Pipettare la soluzione di TRIPSINA su e giù per diverse volte.

Prima di tutto, dissociare le colonie di cellule staminali embrionali (ES). Neutralizzare quindi la soluzione di tripsina aggiungendo 500 microlitri di mezzo per cellule staminali embrionali (ESC) al pozzetto. Passare le cellule ES secondo il rapporto richiesto; in questo caso, le cellule ES vengono suddivise in un rapporto di 1 a 30, il che permette loro di raggiungere la confluenza entro tre giorni.

Iniziare la differenziazione in vitro quando le cellule staminali embrionali hanno raggiunto la confluenza. Innanzitutto ricoprire piastre da coltura da 10 centimetri con gelatina sterile allo 0,1% in acqua distillata e lasciare assorbire per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Durante questo periodo, raccogliere le cellule staminali embrionali come in precedenza.

Trascorsi i 15 minuti, aspirare qualsiasi eccesso di gelatina e aggiungere circa un terzo fino alla metà della sospensione di cellule ES E in piatti di coltura contenenti mezzo di adattamento. Dopo aver coltivato le cellule nel mezzo di adattamento per due giorni, raccogliere le cellule ES adattate in un tubo conico da 50 millilitri contenente PBS utilizzando 1,5 millilitri di tripsina. Centrifugare a 1000 giri/min per cinque minuti e risospendere in mezzo di differenziamento.

Preparare corpi embrionali o EBS di circa 1000 cellule per goccia di 10 microlitri di mezzo di differenziamento in piastre di coltura da 15 centimetri. Utilizzando una pipetta multicanale, capovolgere le piastre e coltivare. Gli EBS sono gocce sospese per due giorni e mezzo a 37 gradi Celsius.

Dopo due giorni e mezzo, trasferire l'EBS da sei-otto piastre da 15 centimetri in una sola utilizzando il mezzo di differenziamento e coltivare per ulteriori tre giorni e mezzo. Dopo altri tre giorni e mezzo, raccogliere l'EBS in un tubo conico da 50 millilitri e lavare la piastra una volta con PBS sterile per raccogliere tutti gli ebs. Quindi lasciarli sedimentare sul fondo per circa cinque minuti.

Quindi rimuovere il soprannatante e lavare l'EBS con PBS sterile. Lasciare che l'EBS sedimenti nuovamente sul fondo per circa cinque minuti. Dissociare l'EBS aggiungendo 2,5 millilitri di tripsina e agitare delicatamente il tubo in un bagno a 37 gradi Celsius per due minuti.

Quindi aggiungere 2,5 millilitri di PBS sterile alla soluzione di tripsina e pipettare su e giù con una pipetta sierologica da 10 millilitri circa otto-dieci volte per disgregare gli aggregati cellulari. Neutralizzare la tripsina con 10 millilitri di tampone fax contenente 7,5% di FBS per cellule ES o per differenziamento e 0,01% di DPI in PBS, centrifugare le EBS dissociate a 1000 giri/min per cinque minuti. Quindi rimuovere il soprannatante e aggiungere circa un millilitro di tampone fax, pipettando su e giù con una pipetta da un millilitro circa otto-dieci volte per disgregare gli aggregati cellulari.

Trasferire le cellule in un tubo sterile a fondo rotondo con un filtro cellulare da 35 micron per ottenere una sospensione monocellulare. Separare le cellule staminali differenziate utilizzando un citofluorimetro Aria e ottenere popolazioni purificate di progenitori ventricolari impegnati. Consultare la sezione testuale del protocollo per la strategia dettagliata di selezione tramite porte analitiche.

Incubare i substrati con microstruttura in F1 27 al 1% in acqua distillata per 10 minuti. Successivamente lavarli tre volte con PBS sterile. Applicare guarnizioni in PDMS attorno alla zona strutturata e premere saldamente.

Quindi seminare i progenitori cardiaci su substrati microstrutturati di fibronectina. Le seguenti immagini provengono da un grafico rappresentativo di citometria a flusso relativo a cellule staminali embrionali differenziate in vitro al giorno sei. Questa immagine mostra il gating sull'ampiezza della diffusione in avanti (FSCA) e sull'ampiezza della diffusione laterale (SSCA).

Questo consente la separazione di cellule intere dai detriti cellulari. Qui si osserva il gating su FSCA e larghezza dello scattering in avanti FSCW. Questo permette l'isolamento di cellule singole da doppietti e altri aggregati cellulari.

Questa immagine mostra il gating su SSCA e la dispersione con SSCW. Ciò aumenta la purezza dei singoletti cellulari. Questa immagine mostra il gating su FSCA e la colorazione con DPI che consente l'isolamento di cellule vitali negative al DPI da cellule non vitali.

Qui si osserva il gating per fico, rine, PE e PE cian in DI sette PE SI sette. Questo permette di ottenere cellule realmente positive e realmente negative per il rosso ed escludere le cellule autofluorescenti negative per il rosso. Queste immagini mostrano il gating per l'ampiezza di fluoresceina isotiocianato fit CA e PEA, che consente di separare cellule realmente positive e realmente negative per il verde all'interno delle popolazioni positive e negative per il rosso.

La purificazione mediante FACS di cellule staminali differenziate in vitro rivela quattro popolazioni distinte di progenitori, come mostrato in questo grafico di citometria a flusso. Le quattro popolazioni distinte di progenitori sono rosse positive, verdi positive, rosse positive e verdi negative, rosse negative e verdi positive, e rosse negative e verdi negative. Questa immagine rappresentativa di microscopia a immunofluorescenza mostra substrati di fibronectina microstrutturati.

La barra della scala rappresenta 80 micron. Questa immagine mostra una microscopia a immunofluorescenza rappresentativa di FAD derivati da embrione, progenitori isolati nei pannelli superiori e FAD derivati da ESL, progenitori isolati nei pannelli inferiori dopo ulteriori cinque giorni di coltura su micropattern di fibronectina; i nuclei sono colorati in blu. S-M-M-H-C-A colorato in rosso, l'alfa-actinina sarcomerica appare verde.

La barra della scala è di 40 micron. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare tessuto miocardico funzionale anisotropo a partire da una fonte cellulare rinnovabile di protusi cardiaci.