Generazione di Allineati tessuto funzionale del miocardio attraverso la stampa microcontatto

Lo scopo del seguente esperimento è quello di generare tessuto miocardico funzionale allineato attraverso la micro stampa a contatto. Ciò si ottiene stampando la fibronectina per primo micro contatto su substrati di polidimetilsilossano. Come secondo passo, doppio transgenico.

Le linee di cellule staminali embrionali sono differenziate in vitro e isolate mediante selezione cellulare attivata da fluorescenza, che consente di ottenere popolazioni altamente purificate di progenitori fortemente cardiogeni. Successivamente, i progenitori cardiaci isolati vengono seminati su substrati PDMS micro brevettati per renderli maligni e assumere una forma simile a un bastoncino simile a un miocita cardiaco. Si ottengono risultati che dimostrano il successo dell'isolamento e una crescita isotropa dei progenitori cardiaci sulla base di fatti e analisi di immunofluorescenza.

La generazione di un tessuto miocardico isotropo può aiutare a progredire nei campi della biologia delle cellule staminali e della bioingegneria tissutale, aumentando la possibilità di sviluppare un saggio cellulare specifico per la malattia per lo sviluppo e la scoperta di farmaci. E gettando le basi per la medicina rigenerativa cardiaca. Prima protezione IL, elastomero 180 4 poli dimetil alano con un rapporto di agente acunte a base di 10 a uno e mescolare bene.

Degasare l'assemblaggio utilizzando un essiccante per eliminare eventuali bolle d'aria. Versare il PDMS in un master precedentemente fabbricato con 20 micron di larghezza e due micron di creste dell'utensile separate da una spaziatura di 20 micron, quindi polimerizzare per due giorni in un essiccato a temperatura ambiente per ottenere timbri PDMS microtesturizzati. Dopo aver reso idrofile le superfici del timbro PDMS, con un pulitore al plasma.

Sterilizzare i francobolli con etanolo al 70% per un minuto. In una cabina di sicurezza biologica, asciugare rapidamente con aria compressa. Coprire le superfici sterili del timbro con una soluzione di fibronectina da assorbire per almeno 10 minuti dopo l'assorbimento.

Scuotere la soluzione di fibronectina dai timbri e asciugare rapidamente con aria compressa. Stabilire un contatto conforme tra il timbro e i vetrini di copertura in vetro rivestito PDMS precedentemente preparati, come descritto nel protocollo di testo, per due minuti e premere con decisione. Sciacquare i substrati del micro pattern con acqua distillata.

Conservali in acqua distillata per un massimo di due settimane a quattro gradi Celsius, a meno che non debbano essere utilizzati immediatamente. Rivestire sei piastre a pozzetti con gelatina sterile allo 0,1% in acqua distillata e lasciarla assorbire per 15 minuti a 37 gradi Celsius Durante questo tempo, preparare i fibroblasti embrionali di topo dall'aliquota ahor aggiungendoli a 50 millilitri di PBS in una provetta conica. Centrifugare la metanfetamina a 1000 giri/min per cinque minuti e risospenderla nel mezzo di metanfetamina.

Una volta trascorso il tempo di incubazione, aspirare la gelatina in eccesso e aggiungere il mes nei pozzetti. Consentire al MES di collegarsi un giorno. Preparare le cellule staminali embrionali o le cellule ES da un'aliquota di pensiero aggiungendole a 50 millilitri di PBS in una centrifuga a provetta conica.

Le celle ES 1000 RPM per cinque minuti e Resus le sospendono in mezzo ESC. Aggiungere le cellule E ES ai pozzetti contenenti miti e mantenerle nel terreno ESC fino a quando non viene raggiunta la confluenza per massaggiare le cellule ES cofluenti. Per prima cosa aspirare il terreno ESC e lavare le cellule una volta con PBS sterile.

Quindi aspirare il PBS e aggiungere 500 microlitri di viaggi nel, beh. Incubare la piastra per tre minuti e mezzo a 37 gradi Celsius. Pipettare più volte la soluzione di TRIPSIN su e giù.

Primo a scomporre le colonie di cellule E.s. Quindi neutralizzare la soluzione di tripsina aggiungendo 500 microlitri di terreno ESC al pozzetto. Massaggiare le cellule ES secondo il rapporto richiesto, qui le cellule E ES vengono fatte passare con un rapporto da uno a 30, che consente loro di raggiungere la confluenza entro tre giorni.

Iniziare la differenziazione in vitro quando le cellule ES hanno raggiunto la confluenza. Per prima cosa rivestire le piastre di coltura da 10 centimetri con gelatina sterile allo 0,1% in acqua distillata e lasciarla assorbire per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Durante questo periodo, raccogliere le cellule ES come prima.

Trascorsi i 15 minuti, aspirare la gelatina in eccesso e aggiungere circa un terzo o metà della sospensione di cellule E ES in piastre coltivate contenenti terreno di adattamento. Dopo aver coltivato le cellule in terreno di adattamento per due giorni, raccogliere le cellule ES adattate in una provetta conica da 50 millilitri contenente PBS utilizzando 1,5 millilitri di tripsina. Centrifugarli a 1000 giri/min per cinque minuti e rimetterli in sospensione in mezzo di differenziazione.

Realizzare corpi embrionali o EBS di circa 1000 cellule per 10 microlitri di goccia di terreno di differenziazione in piastre di coltura da 15 centimetri. Utilizzando una pipetta multicanale, capovolgere le piastre e la coltura. EBS appende goccioline per due giorni e mezzo a 37 gradi Celsius.

Dopo due giorni e mezzo, estrarre l'EBS da sei a otto piastre da 15 centimetri in una utilizzando il terreno di differenziazione e coltivarle per altri tre giorni e mezzo. Dopo altri tre giorni e mezzo, raccogliere l'EBS in un tubo conico da 50 millilitri e lavare la piastra una volta con PBS sterile per raccogliere tutto l'EBS. Quindi lasciarli affondare sul fondo per circa cinque minuti.

Quindi rimuovere il supinato e lavare l'EBS con PBS sterile. Lasciare che l'EBS affondi di nuovo sul fondo per circa cinque minuti. Dissociare l'EBS aggiungendo 2,5 millilitri di tripsina e agitare delicatamente il tubo a bagnomaria a 37 gradi Celsius per due minuti.

Quindi aggiungere 2,5 millilitri di PBS sterile alla soluzione di tripsina e pipettare su e giù con la pipetta sierologica da 10 millilitri circa 8-10 volte per abbattere i gruppi di cellule. Neutralizzare la tripsina con 10 millilitri di tampone fax contenente il 7,5% di cellule E ES o FBS di grado di differenziazione e 0,01% DPI in centrifuga PBS, EBS dissociato a 1000 RPM per cinque minuti. Quindi rimuovere il supinato e aggiungere circa un millilitro di pipetta tampone fax su e giù con una pipetta da un millilitro circa 8-10 volte per abbattere i gruppi di cellule.

Trasferire le cellule in una provetta sterile a fondo tondo con un filtro cellulare da 35 micron per ottenere una sospensione a singola cellula. Ordina le cellule ES differenziate utilizzando un citometro a flusso aria e ottieni popolazioni purificate di progenitori ventricolari impegnati. Vedere la parte di testo del protocollo per la strategia di gating dettagliata.

Ha mangiato i substrati del micro pattern con l'1% di onic F1 27 in acqua distillata per 10 minuti. Quindi lavarli tre volte con PBS sterile. Fissare le guarnizioni PDMS attorno alla regione del modello e premere con decisione.

Quindi seminare i progenitori cardiaci su substrati di fibronectina micro pattern. Le immagini seguenti sono tratte da un grafico rappresentativo della citometria a flusso del sesto giorno di cellule ES differenziate in vitro. Questa immagine mostra il gating sull'ampiezza di diffusione diretta FSCA e sull'ampiezza di dispersione laterale SSCA.

Ciò consente la separazione di cellule intere dai detriti cellulari. Qui si vede il gating su FSCA e la larghezza di dispersione diretta FSCW. Ciò consente l'isolamento di singoletti cellulari da doppietti e altri aggregati cellulari.

Nell'immagine viene mostrato il gating su SSCA e la dispersione con SSCW. Ciò aumenta la purezza dei singoletti cellulari. Questa immagine mostra il gating su FSCA e la colorazione DPI che consente l'isolamento di cellule DPI negative vitali da cellule non vitali.

Qui si vede il gating per fico, rine, PE e PE ciano in DI sette PE SI sette. Ciò consente di ottenere cellule rosse positive e negative vere e di escludere le cellule negative rosse autofluorescenti. Queste immagini mostrano il gating per l'adattamento dell'ampiezza dell'isotiocianato di fluoresceina a CA e PEA che consente di ordinare le cellule verde positivo e negativo all'interno delle popolazioni di rosso positivo e rosso negativo.

La purificazione via fax di cellule ES differenziate in vitro rivela quattro distinte popolazioni di progenitori, come si vede da questo grafico di citometria a flusso. Le quattro popolazioni distinte di progenitori sono il rosso, il verde positivo, il rosso positivo, il verde positivo, il rosso negativo, il verde negativo positivo e il rosso negativo il verde negativo. Questa immagine rappresentativa al microscopio a immunofluorescenza mostra substrati di fibronectina microstrutturati.

La barra della scala rappresenta 80 micron. Questa immagine mostra la microscopia rappresentativa dell'immunofluorescenza di fatti derivati da embrioni, progenitori isolati nei pannelli superiori e fatti derivati da ESL, progenitori isolati nei pannelli inferiori dopo ulteriori cinque giorni di coltura su nuclei di micro pattern di fibronectina colorati di blu. L'alfa actinina sarcomerica colorata di rosso S-M-M-H-C-A appare verde.

La barra della scala è di 40 micron. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare tessuto miocardico funzionale anisotropo da una fonte cellulare rinnovabile di protus cardiaco.