Name: Purificazione e microRNA profiling di Exosomes derivati dal sangue e cultura dei media (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Impara a purificare esosomi da sangue e mezzi di coltura per analizzare i microRNA mediante centrifugazione differenziale e PCR in tempo reale. Questo metodo consente di identificare biomarcatori per ricerche in neuroscienza e biologia cellulare.

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Questo studio è stato sostenuto da fondi da Rita Allen sovvenzione della Fondazione per Seena Ajit. Gli autori desiderano ringraziare Erika Balogh e Dr. Soumitra Ghoshroy dall&#39;Università di Centro Electron Microscopy South Carolina per l&#39;uso dello strumento, l&#39;assistenza scientifica e tecnica.

Tutti gli esperimenti usando campioni di sangue da uomo e roditori sono stati eseguiti in conformità a tutte le direttive, i regolamenti e le agenzie di regolamentazione. Soggetti umani sono stati arruolati dopo aver dato il consenso informato come approvato dalla Drexel University College of Medicine Institutional Review Board e di tutte le procedure per gli studi condotti su animali sono stati approvati dalla Institutional Animal Care di Drexel e utilizzo Comitato. 1. Purificazione Exosome dal sangue (~ 5,5 ore) CONSIGLI <ul><li class="jove_content"> Noi Risospendere exosomes da una provetta di sangue (~ 10 ml di sangue umano e ~ 2 ml di sangue del mouse) in 300 ml di RNA tampone di lisi del kit di isolamento miRNA Mirvana. </li><li class="jove_content"> Per purificare exosomes da mezzi di coltura cellulare, il supporto viene centrifugato a 500 xg per 10 minuti per rimuovere le cellule ed anche filtrato attraverso un filtro di 0,22 micron dopo centrifugazione a 12.000 x g. La purificazione exosome da terreni di coltura cellularenon richiede una diluizione in PBS, il lavaggio PBS o il secondo passo ultracentrifugazione. </li><li class="jove_content"> Se vengono utilizzati i exosomes purificati per studi di proteomica, aggiungendo un gradiente di saccarosio fase di centrifugazione dopo il passo ultracentrifugazione diminuirà la quantità di aggregati proteici e contaminanti 15. </li><li class="jove_content"> La morfologia osservata di exosomes può variare a seconda sia della fasi di lavorazione per la TEM sorgente e. Non abbiamo osservato la morfologia a forma di coppa per exosomes che è stato precedentemente attribuite a differenze di trattamento del campione 9,15. Le nostre immagini TEM compreso l&#39;etichettatura immunogold sono simili alle precedenti relazioni provenienti da diverse fonti, tra cui sangue, delle vie biliari e della cultura corticale derivato exosomes 9,16,17. </li></ul><ol><li> Capovolgere tubo rivestito EDTA contenente il sangue 5x e posto in posizione verticale a temperatura ambiente per 10-60 min. </li><li> Centrifugare a 2000 xg per 15 min a 4 ° C. </li&gt; <li> Raccogliere lo strato superiore, il plasma, in 15 ml provette e tenere in ghiaccio. </li><li> Diluire fluido con un volume uguale di PBS. Centrifugare 30 min a 2000 xga 4 ° C. </li><li> Trasferimento di centrifugare provette, aggiungere 1X PBS per un volume totale di 24 ml e centrifugare 45 min a 12.000 xg a 4 ° C. </li><li> Trasferimento a ultracentrifuga tubi e centrifugare 2 ore a 110.000 xg a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet in PBS e centrifugare 1 ora a 100.000 xg a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet in tampone appropriato (tampone di lisi RNA). </li><li> Risospendere in PBS o RIPA buffer per la microscopia elettronica e western blot, rispettivamente. </li></ol> 2. RNA Purification Utilizzando un Mirvana Isolation Kit miRNA Modified (~ 1 ora) CONSIGLI <ul><li class="jove_content"> Preparare l&#39;area per l&#39;isolamento di RNA da indossare dispositivi di protezione individuale (DPI), pulendo le superfici e pipette con RNasi Zap, e l&#39;utilizzo di puntali con filtro sterili e tubi. </li><liclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Anche se il protocollo dal venditore dà la possibilità di purificare solo miRNA, abbiamo sempre isolare l&#39;RNA totale tra mRNA e miRNA in modo da poter studiare sia dallo stesso campione. </li><li class="jove_content"> Aggiunta di una fase di trattamento DNasi on-column rimuove le tracce di DNA che possono essere presenti. A seconda della sorgente di exosomes, il DNA è stato riportato essere assente in exosomes purificate da alcune fonti tra mouse e linee di mastociti umani 8 ma sequenze di DNA cromosomico è stato isolato exosomes purificati da supporti di cardiomiociti in coltura 18. </li><li class="jove_content"> Abbiamo ridotto il volume della soluzione di lavaggio 1-350 microlitri (Passo 2.4) perché il venditore fornisce abbastanza unica soluzione di lavaggio 1 per un 700 microlitri aggiunta. Se il volume non è ridotta non vi è sufficiente per la soluzione utilizzando l&#39;intero contenuto del kit. Passaggi rimanenti sono state eseguite secondo le raccomandazioni del fabbricante. </li></ul><ol><li> Aggiungere 1/10 VOLume di miRNA Additivo Omogenato (30 ml) e incubare in ghiaccio per 10 min. </li><li> Estrarre con un volume di acido-fenolo: cloroformio pari al volume iniziale lisato. Centrifugare e recuperare la fase superiore in una nuova provetta. </li><li> Aggiungere 1,25 volumi 100% di etanolo (375 ml). Vortex. Applicare al filtro a cartuccia e centrifugare 15 sec a 10.000 x g. </li><li> Aggiungere la metà del volume di raccomandata miRNA soluzione di lavaggio 1 (350 ml) e centrifugare 15 sec a 10.000 x g. </li><li> Aggiungere 10 microlitri DNasi 1-70 microlitri tampone RDD (Qiagen) per ogni campione. Aggiungere 80 microlitri di colonna e incubare 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungi Soluzione di lavaggio 1 (350 ml) e centrifugare 15 sec a 10.000 x g. </li><li> Aggiungi Soluzione di lavaggio 2/3 (500 microlitri) e centrifugare 15 sec a 10.000 x g. REPEAT. </li><li> Eluire con 40 microlitri 95 ° C nucleasi H 2 O. </li><li> Determinare la concentrazione di RNA e diluire l&#39;RNA a 100 ng / ml. </li></ol> 3. miRNA Profiling di Exosomes da Blood Utilizzando Taqman Low Density Array (TLDA) Cards (~ 6,5 ore) CONSIGLI <ul><li class="jove_content"> Preparare l&#39;area per l&#39;isolamento di RNA da indossare PPE, asciugandosi le superfici e pipette con RNasi Zap, e l&#39;utilizzo di puntali con filtro sterili e tubi. </li><li class="jove_content"> Pre-amplificazione fase (pre-amp) è consigliato per 1-350 ng RNA (350-1,000 campioni ng non richiedono fase di pre-amp dopo sintesi del DNA). E &#39;importante determinare se pre-amp è necessario per il vostro campione, perché è necessario trattare tutti i campioni in condizioni di parità. Fase di pre-amp aggiunge costi e dei valori Ct hanno un basso cut off accettabile (32 invece di 40). </li><li class="jove_content"> È utile preparare la reazione cDNA in tubi striscia invece di una piastra a seconda del numero di carte che possono essere eseguiti in un solo giorno. Questo ridurrà al minimo congelamento-scongelamento dei campioni di cDNA che non saranno trattate il giorno stesso. </li><li class="jove_content"> Exosomes raccolti da diverse fonti hanno diffeaffittare quantità di RNA. Questo protocollo consente un massimo di 3 microlitri stampo di RNA per la reazione di sintesi di cDNA. A seconda della sorgente, la quantità di RNA exosomal che può essere isolata forse limitato. Mentre un tessuto tipico produrrebbe abbastanza RNA che cDNA sarebbe composto da 100 ng di RNA in 3 volumi microlitri, exosomes dal sangue o dal mezzo di coltura di cellule umane spesso contengono meno RNA e cDNA deve essere effettuato da meno materiale di partenza. Exosomes sangue topo presentano livelli di RNA e almeno 100 ng in 3 ml possono essere ottenuti. </li></ul><ol><li> Per preparare cDNA da RNA purificato utilizzando Piscine Megaplex trascrittasi inversa primer (Pool A e Pool B contenere primer per i miRNA su schede di microfluidica array A e B), scongelare i componenti di reazione in ghiaccio. </li><li> Etichetta due provette da 1,5 ml RNasi-free per la reazione RT con piscina A primer o Pool B primer e aggiungere componenti in modo grafico. Aggiungi almeno un volume aggiuntivo di componenti per 2 o più reazioni o fare un master mix come consigliato da tegli venditore. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente reazione RT </td><td> Concentrazione Componente </td><td> Volume per 1 campione (totale V / campione = 4,5 ml) </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td></td><td> 0.20 ml </td></tr><tr><td> Megaplex RT Buffer (10X) </td><td> 1X </td><td> 0,80 ml </td></tr><tr><td> dNTP (100 mm) </td><td> 4.4 mM </td><td> 0.20 ml </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 5 mM </td><td> 0,90 ml </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (20U/μl) </td><td> 2 U </td><td> 0,10 ml </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer A o B (10 volte) </td><td> 1X </td><td> 0,80 ml </td></tr><tr><td> MultiScribe trascrittasi inversa </td><td> 75 U </td><td> 1,50 ml </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Invertire i tubi 6 volte e centrifuge brevemente. Poi, pipetta 4,5 microlitri mix di reazione RT in MicroAmp strisce da 8 provette o una piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp. </li><li> Aggiungere 100 ng di RNA e di regolare il volume a 3 ml con acqua trattata DEPC o aggiungere 3 RNA totale microlitri, mescolate con la punta della pipetta, e sigillare le provette o la piastra. Spin brevemente e incubare in ghiaccio per 5 min. </li><li> Caricare la reazione nella macchina di PCR e correre con le seguenti condizioni (come raccomandato dal Biosystems protocollo Piscine Megaplex Applicata): </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Tappa </td><td> Temp </td><td> Volta </td></tr><tr><td> Ciclo (40x) </td><td> 16 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td></td><td> 42 ° C </td><td> 1 min </td></tr><tr><td></td><td> 50 ° C </td><td> 1 sec </td></tr><tr><td> Tenere </td><td> 85 ° C </td><td> 5 min </td></tr><tr><td> Tenere </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> Conservare cDNA a -20 ° C (buono per almeno una settimana) o passare alla fase di pre-Amp, che possono essere conservati per una settimana. </li><li> Scongelare primer preamplificazione per la Pool A e Pool B sul ghiaccio e miscelare. Swirl Taqman Pre-Amp Master Mix e tenere in ghiaccio anche. </li><li> Seguire la tabella aggiungendo almeno un volume aggiuntivo di componenti per 2 o più reazioni o fare un master mix come raccomandato dal produttore. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente Reazione Pre-Amp </td><td> Volume per 1 campione </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 7,5 microlitri </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Master Mix (2X) </td><td> 12,5 ml </td></tr><tr><td> Megaplex Primer PreAmp A o B (10 volte) </td><td> 2,5 microlitri </td></tr></tbody></table><ol start="9"><li> Pipettare 2,5 ml RT produttorict in MicroAmp Strips 8-tubo o una piastra di reazione ottica a 96 pozzetti MicroAmp ed erogare 22,5 ml mix di reazione PreAmp in ciascun pozzetto. </li><li> Sigillare la piastra, incubare in ghiaccio 5 min e quindi caricare il campione nella macchina PCR. Eseguire le seguenti condizioni. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Tappa </td><td> Temp </td><td> Volta </td></tr><tr><td> Tenere </td><td> 95 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Tenere </td><td> 55 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Tenere </td><td> 72 ° C </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Ciclo (12x) </td><td> 95 ° C </td><td> 15 sec </td></tr><tr><td></td><td> 60 ° C </td><td> 4 min </td></tr><tr><td> Tenere </td><td> 99,9 ° C </td><td> 10 min </td></tr><tr><td> Tenere </td><td> 4 ° C </td><td> ∞ </td></tr></tbody></table><ol start="11"><li> Dopo la reazione preamplificatore è finito, centrifugare brevemente le provette o la piastra e poi aggiungere 75 ml 0,1 X. TE pH 8.0 per ciascun bene o un tubo. </li><li> Sigillare e mescolare e centrifugare brevemente. Conservare il prodotto diluito per una settimana a -20 ° C o proseguire per caricare la piastra. </li><li> Unire la segue in un RNase-free 1,5 ml tubo in ghiaccio. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume per 1 scheda </td></tr><tr><td> TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) </td><td> 450 microlitri </td></tr><tr><td> PREAMP prodotto diluito </td><td> 9 ml </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 441 microlitri </td></tr></tbody></table><ol start="14"><li> Capovolgere la provetta per mescolare e centrifugare brevemente. Dispensare 100 ul miscela di reazione PCR in ogni porta della scheda Array MicroRNA Taqman. </li><li> Centrifugare la scheda 2 x 1.000 xg per 1 minuto. Sigillare la carta ed eseguirlo utilizzando il modello fornito con i primer nel manuale Applied Biosystems e le Taqman impostazioni Array 384 e bassa densità. Usiamo Applied Biosystems 7900HT veloce Real-Time PCR. </li></ol> 4. mRNA Analisi per Taqman (~ 1,5 ore) <ol><li> Per preparare reazione di qPCR, miscelare i componenti di reazione nell&#39;ordine nel grafico. Tutti i campioni saranno analizzati con sonde di primer per il gene di interesse e 18S rRNA come il gene normalizzatore. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Componente Reazione Taqman </td><td> Volume per 1 campione </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 7 ml (regolare sulla base del campione individuale) </td></tr><tr><td> Taqman Veloce Master Mix (2X) </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> Sonde TaqMan Primer (20x) </td><td> 1 microlitri </td></tr><tr><td> cDNA da 100 ng di RNA </td><td> 2 &amp; mu, L (regolare sulla base del campione individuale) </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Esegui il pozzo piastra 96 ​​tramite il blocco a 96 pozzetti veloce come consigliato dal produttore (Biosystems 7900HT veloce Real-Time PCR System Applicata). </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo protocollo, mostriamo la quantificazione dei miRNA e mRNA da exosomes purificati mediante centrifugazione differenziale di sangue e di cultura dei media. Exosomes hanno diverse componenti che dipendono dalla loro origine e sono coinvolti in una serie di funzioni biologiche, compresa la risposta immunitaria, presentazione dell&#39;antigene, comunicazione intracellulare, e il trasferimento di RNA e proteine ​​9,11,12,19,20. Mentre la dimensione e la forma è un determinante di purezza exosome, una seri...

Brevi non codificanti miRNA modulano l&#39;espressione genica legandosi al mRNA bersaglio. Seme sequenza di complementarità ~ 7 coppie di basi miRNA consente di legarsi al mRNA bersaglio conseguente inibizione della traduzione o nella riduzione della stabilità del mRNA, entrambi i quali possono portare a diminuzione dell&#39;espressione della proteina bersaglio 1. La ricerca negli ultimi dieci anni ha inequivocabilmente dimostrato un ruolo fondamentale per il miRNA nel mediare le funzioni cellulari. C&#39;è stato anche un notevole sforzo diretto verso la dissezione miRNA cambiamenti molecolari alla base di diverse malattie mediate 2,3. Inoltre, la recente identificazione di miRNA stabili in fluidi corporei 4-6 aperto la strada per il loro uso come nuovi biomarcatori suscettibili di diagnosi clinica. Un modo di trasporto miRNA nei fluidi corporei è via exosomes, piccole vescicole che trasportano mRNA, proteine, mediatori lipidici, e miRNA alle cellule riceventi tramite cir arteriosa sistemicaione 7-14. Ciò si traduce in modulazione dell&#39;espressione genica in cellule riceventi e rappresenta un nuovo meccanismo di comunicazione cellulare. Per esempio, le cellule possono modulare processi immuno-regolatori secernendo e / o exosomes assorbenti contenenti biomolecole coinvolte nella infiammazione, come interleuchina-1β (IL1β), fattore di necrosi tumorale-α (TNFa), fattore di crescita trasformante-β5 (TGFβ5), e i miRNA che regolano questi geni 13. Come espressione di miRNA aberrante è una caratteristica comune in una varietà di malattie umane, queste molecole offrono nuove interessanti opportunità per la scoperta e la validazione di nuovi bersagli terapeutici 2. MicroRNA circolanti sono presenti in tutti i fluidi corporei ed è noto che la composizione del exosomes è diverso in base alle celle di origine da cui sono stati rilasciati. Così essi offrono una via per studiare lo stato fisiologico delle cellule e come le cellule cambiano a segnalazione anchets in risposta a stress comprese malattie. Studiare le alterazioni nella composizione exosome può fornire indicazioni in trasduzione del segnale e studiare il loro potenziale utilità come biomarcatori o percorsi di intervento terapeutico. Qui dimostreremo la purificazione exosomes provenienti da fonti multiple basate su protocolli pubblicati. Questi exosomes saranno utilizzati per l&#39;isolamento dell&#39;RNA seguito da qPCR per identificare e misurare i livelli di miRNA presenti nelle exosomes.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer rivestito in EDTA (provette da 10 ml)</td><td>BD Diagnostics</td><td>366643</td><td>Per la purificazione di esosomi da sangue umano</td></tr><tr><td>Vacutainer rivestito in EDTA (provette da 2 ml)</td><td>BD Diagnostics</td><td>367841</td><td>Per la purificazione di esosomi da sangue di topo</td></tr><tr><td>PAXgene Blood RNA Tube</td><td>BD Diagnostics</td><td>762165</td><td>Per l'isolamento di miRNA da sangue totale</td></tr><tr><td>Kit di isolamento di microRNA miRVana</td><td>Ambion</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>Acido-Fenolo: CHCl3</td><td>Ambion</td><td>9721G</td><td></td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4326614</td><td>Per schede TLDA</td></tr><tr><td>Megaplex RT roditore Pool Set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444746</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex preamplificatore roditore Pool set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4444747</tr><tr><td>Taqman Array Roditore MicroRNA A+B set V3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444909</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex RT Human Pool set V3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444745</td><td></td></tr><tr><td>Megaplex Preamp Human Pool set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444748</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444913</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Kit MicroRNA RT</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman master mix universale rapido per PCR </td><td>Applied Biosystems</td><td>4366072</td><td>Per mRNA qRT-PCR</td></tr><tr><td>Fattore di necrosi tumorale (sonda primer)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs01113624_g1</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita endoteliale vascolare A (sonda primer)</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs00900055_m1</td><td></td></tr><tr><td>Maxima First Strand cDNA Kit di sintesi per RT-qPCR</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1642</td><td>Per mRNA</td></tr><tr><td>HSP70 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab94368</td><td>Per western blot</td></tr><tr><td>Anti-coniglio IgG-Gold</td><td>Sigma</td><td>G7402</td><td>Per microscopia</td></tr><tr><td>elettronica Coniglio-anti CD81</td><td>Sigma</td><td>SAB3500454</td><td></td></tr><tr><td>Nichel 300 mesh carbon formvar griglie</td><td>Microscopia elettronica</td><td>Scienze FCF300-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Griglie di rame 300 mesh carbon formvar</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 1. Tabella dei reagenti specifici.</td></tr></tbody></table>

purificazione e microrna profiling di exosomes derivati ​​dal sangue e cultura dei media

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

MiRNA stabili sono presenti in tutti i fluidi corporei e di alcuni microRNA circolanti sono protetti dalla degradazione di sequestro in piccole vescicole chiamate exosomes. Exosomes possono fondersi con la membrana plasmatica con conseguente trasferimento di RNA e proteine ​​per la cellula bersaglio. Le loro funzioni biologiche includono la risposta immunitaria, presentazione dell&#39;antigene, e la comunicazione intracellulare. Consegna dei miRNA che possono regolare l&#39;espressione genica nelle cellule riceventi attraverso il sangue ha aperto nuove strade per l&#39;intervento di destinazione. Oltre ad offrire una strategia per la consegna di farmaci o RNA agenti terapeutici, contenuti exosomal possono servire come biomarcatori che possono aiutare nella diagnosi, determinare le opzioni di trattamento e la prognosi. Qui descriveremo la procedura per analizzare quantitativamente miRNA e RNA messaggero (mRNA) da exosomes secreti nel sangue e nei mezzi di coltura cellulare. Exosomes purificati saranno caratterizzati mediante analisi Western Blot per exosmarcatori Omal e PCR per mRNA di interesse. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e l&#39;etichettatura immunogold verranno utilizzati per convalidare la morfologia e l&#39;integrità exosomal. L&#39;RNA totale saranno purificati da questi exosomes per assicurare che siamo in grado di studiare sia l&#39;mRNA e miRNA dallo stesso campione. Dopo la convalida integrità dell&#39;RNA da Bioanalyzer, eseguiremo una produttività quantitativa real time PCR media (qPCR) per identificare il miRNA exosomal utilizzando Taqman Low Density Array (TLDA) carte e studi di espressione genica per le trascrizioni di interesse. Questi protocolli possono essere usati per quantificare variazioni miRNAs exosomal in pazienti, modelli di roditori e terreni di coltura cellulare prima e dopo l&#39;intervento farmacologico. Contenuto Exosomal variabili per la fonte di origine e le condizioni fisiologiche di cellule che secernono exosomes. Queste variazioni possono fornire informazioni su come le cellule e sistemi di far fronte allo stress o perturbazioni fisiologiche. I nostri dati rappresentativi mostrano variations in miRNA presenti in exosomes purificate dal sangue del mouse, sangue umano e mezzi di coltura di cellule umane. Qui descriveremo la procedura per analizzare quantitativamente miRNA e RNA messaggero (mRNA) da exosomes secreti nel sangue e nei mezzi di coltura cellulare. Exosomes purificati saranno caratterizzati mediante analisi western blot per i marcatori exosomal e PCR per mRNA di interesse. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e l&#39;etichettatura immunogold verranno utilizzati per convalidare la morfologia e l&#39;integrità exosomal. L&#39;RNA totale saranno purificati da questi exosomes per assicurare che siamo in grado di studiare sia l&#39;mRNA e miRNA dallo stesso campione. Dopo la convalida integrità dell&#39;RNA da Bioanalyzer, eseguiremo una produttività quantitativa real time PCR media (qPCR) per identificare il miRNA exosomal utilizzando Taqman Low Density Array (TLDA) carte e studi di espressione genica per le trascrizioni di interesse. Questi protocolli possono essere usati per quantificare variazioni miRNA exosomal in pazienti, modelli di roditori e terreni di coltura delle cellule prima e dopo l&#39;intervento farmacologico. Contenuto Exosomal variabili per la fonte di origine e le condizioni fisiologiche di cellule che secernono exosomes. Queste variazioni possono fornire informazioni su come le cellule e sistemi di far fronte allo stress o perturbazioni fisiologiche. I nostri dati rappresentativi mostrano variazioni di miRNA presenti in exosomes purificate dal sangue del mouse, sangue umano e mezzi di coltura di cellule umane

Dopo aver isolato exosomes da sangue o terreni di coltura cellulare, la purezza dei exosomes può essere testata mediante microscopia elettronica (EM) e western blot (Figure 1A e 1B). Abbiamo confermato la nostra preparazione exosome da varie fonti con EM e western blot utilizzando anticorpi multipli. Figura 1A mostra EM immagini confermando che exosomes sono intatte con un diametro di ~ 30 -100 nm e contengono CD81 mediante l&#39;etichettatura immunogold. Marcatori exos...

La presenza di microRNA stabili (miRNA) in exosomes ha generato enorme interesse come un romanzo modalità di comunicazione intercellulare, per la loro potenziale utilità come biomarcatori e come via per l&#39;intervento terapeutico. Qui mostriamo purificazione exosome dal sangue e cultura mediatica seguita da PCR quantitativa per identificare miRNA trasportati.

Purificazione e microRNA profiling di Exosomes derivati ​​dal sangue e cultura dei media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare e quantificare i microRNA presenti negli esosomi ottenuti da sangue o da terreni di coltura cellulare. Questo viene realizzato innanzitutto purificando gli esosomi da sangue o da terreni di coltura cellulare mediante centrifugazione differenziale. Il secondo passaggio consiste nella purificazione dell'RNA totale di origine esosomiale, utilizzando un kit di isolamento del microRNA Nirvana.Dopo aver confermato l'integrità e la concentrazione dell'RNA purificato, questo viene convertito in CDNA utilizzando i reagenti del kit di reazione della trascrittasi inversa Megaplex. Successivamente, viene eseguito un passaggio di preamplificazione utilizzando i primer Megaplex preamp e la miscela maestra attack man preempt. Per amplificare i microRNA, l'ultimo passaggio consiste nell'eseguire una reazione di PCR in tempo reale utilizzando 2 carte microfluidiche da 384 pozzetti oppure carte TAC man low density array contenenti primer probe TAC MAN liofilizzati.In definitiva, questa procedura permetterà il rilevamento di fino a 758 microRNA noti. Questa tecnica misura le variazioni nel contenuto di microRNA extracellulari dipendenti dalla fonte e dalle condizioni fisiologiche in cui vengono secreti. Le implicazioni della quantificazione di queste firme uniche si estendono allo sviluppo di biomarcatori e di nuove strategie terapeutiche.Per iniziare questa procedura, capovolgere un tubo rivestito con EDTA contenente 10 millilitri di sangue intero per cinque volte per assicurare il mescolamento dell'agente anticoagulante e posizionarlo in posizione verticale a temperatura ambiente per 10-60 minuti; quindi centrifugare il campione a 2000 ×g e a 4 °C per 15 minuti per separare il sangue. Dopo 15 minuti, rimuovere il tubo dalla centrifuga e raccogliere il plasma in un nuovo tubo da 15 millilitri. Posizionare il plasma sul ghiaccio e diluirlo con un volume uguale di PBS.Quindi mescolare delicatamente il campione e posizionarlo nella centrifuga a 2000 volte G e 4 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, rimuovere il campione dalla centrifuga. Trasferirlo in un nuovo tubo da centrifuga.Aggiungere un XPBS a 24 millilitri e centrifugare a 12.000 ×g e 4 °C per 45 minuti. Successivamente, trasferire il soprannatante in un tubo per ultracentrifuga e centrifugare a 110.000 ×g e 4 °C per due ore. Dopo due ore.Rimuovere il campione dall'ultra e rimuovere con attenzione il soprannatante mediante pipetta. Risospendere il pellet in PBS freddo e riposizionare il campione nell'ultracentrifuga. Centrifugare a 100.000 ×g e 4 gradi Celsius per un'ora, a seguito della centrifugazione.Rimuovere con attenzione il soprannatante mediante pipetta e risospendere il pellet in 300 microlitri di tampone di lisi per RNA. In alternativa, il campione può essere sospeso in PBS o in tampone RIPPA. Per l'analisi mediante microscopia elettronica e western blot, rispettivamente, preparare l'area per l'isolamento dell'RNA indossando dispositivi di protezione individuale, pulendo le superfici e le pipette con R a's zap e utilizzando punte e tubi sterili con filtro.Quindi, determinare se è necessaria la preamplificazione dell'RNA quantificando l'RNA isolato mediante spettrometro: per campioni con più di 350 nanogrammi di RNA, la preamplificazione potrebbe non essere necessaria, a meno che il trascritto di interesse non sia poco abbondante. Successivamente, preparare il cDNA a partire dall'RNA purificato utilizzando i pool Megaplex e i primer della trascrittasi inversa.Iniziare scongelando i primer sul ghiaccio. Mentre si scongelano, etichettare due tubi da 1,5 millilitri privi di RNA per la trascrizione inversa con i primer del pool A o del pool B, poiché il pool A e il pool B contengono i primer per i microRNA sulle schede microfluidiche rispettivamente array A e array B. Preparare una miscela maestra per ciascun pool separatamente, utilizzando i componenti come descritto nel protocollo testuale. Prestare attenzione a mantenere separati i primer del pool A e del pool B.Quindi capovolgere i tubi con la miscela master per sei volte e centrifugare brevemente; pipettare 4,5 microlitri della miscela di reazione di RT in ciascun tubo degli strip da otto tubi. Successivamente, aggiungere 3 microlitri del campione di RNA contenente da 1 a 350 nanogrammi di RNA in ciascun tubo. Mescolare il campione con la punta della pipetta e chiudere i tubi con il cappuccio.Centrifugare brevemente i campioni e incubarli sul ghiaccio per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, caricare i tubi di reazione nel termociclatore ed eseguire la reazione alle seguenti condizioni. Al termine della PCR, conservare il cDNA a meno 20 gradi Celsius per un massimo di una settimana oppure procedere alla preamplificazione per i campioni con meno di 350 nanogrammi.O se il trascritto di interesse è poco abbondante, eseguire i seguenti passaggi di preamplificazione. Iniziare seguendo i primer per preamplificazione per il pool A e il pool B su ghiaccio e capovolgerli per mescolare. Successivamente, agitare delicatamente il master mix preamplificazione Tack Man e mantenerlo sul ghiaccio. Quindi, preparare il master mix per l'amplificazione.Successivamente, pipettare 2,5 microlitri del prodotto CD NA in strip di tubi microamp da otto e aggiungere poi 22,5 microlitri del master mix della reazione di preamplificazione. Infine, incubare i tubi sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi caricare il campione nella macchina PCR ed eseguire la reazione alle seguenti condizioni.Al termine della reazione di preamplificazione, centrifugare brevemente i tubi e quindi aggiungere 75 microlitri di tris, EDTA 0,1 x a pH 8,0 in ciascun tubo. Successivamente, mescolare brevemente i tubi e centrifugarli. Procedere quindi con il caricamento dell'array tach man per microRNA oppure conservare il prodotto diluito fino a una settimana a meno 20 gradi Celsius.Per preparare i campioni per l'array di microRNA tac MAN, unire 450 microlitri del master mix universale per PCR tac man, 9 microlitri del prodotto di amplificazione preamplificato diluito e 441 microlitri di acqua priva di nucleasi in un tubo da 1,5 millilitri privo di RNA, posto sul ghiaccio. Mescolare quindi il tubo capovolgendolo sei volte e centrifugare il campione. Distribuire brevemente 100 microlitri del mix di reazione PCR in ciascuna porta della scheda per array di microRNA tac man.Successivamente, centrifugare la card due volte a 1000 ×g per un minuto, quindi sigillare la card. Successivamente, caricare l'array nel termociclatore. Successivamente, eseguire i campioni utilizzando le condizioni di termociclaggio predefinite fornite insieme ai primer nel manuale di Applied Biosystems per l'array TAC Man a bassa densità da 384 pozzetti, al fine di eseguire l'analisi dell'mRNA nel sistema PCR in tempo reale Applied Biosystems 7900HG Fast.Per prima cosa, modificare i blocchi termici per eseguire una piastra a 96 pozzetti. L'immagine ottenuta al microscopio elettronico a trasmissione mostrata a sinistra rappresenta esosomi isolati dal sangue di topo, utilizzando i metodi descritti in questo video.L'immagine a destra mostra esosomi purificati da terreni di coltura cellulare e successivamente marcati con oro anti-CD81; gli esosomi hanno generalmente un diametro compreso tra 30 e 100 nanometri. L'abbondanza relativa di microRNA normalizzati, trovati negli esosomi isolati dal sangue di roditore, dal sangue umano e dai terreni di coltura delle cellule endoteliali aortiche umane, è mostrata qui come valori delta CT normalizzati rispetto al controllo endogeno U6 RNA; valori positivi di delta CT indicano che il microRNA è meno abbondante, mentre valori negativi di delta CT indicano che il microRNA è più abbondante.Non tutti i microRNA sono presenti in ogni tipo di campione. Ad esempio, il microRNA 126 non è stato rilevato negli esosomi del sangue di roditore e il microRNA 200c è assente negli esosomi di H-A-O-E-C. I quattro microRNA rimanenti sono presenti in tutti e tre i campioni in quantità variabili.Sebbene questo protocollo si concentri sulla caratterizzazione di microRNA exosomiali, singoli trascritti di RNA possono essere quantificati anche dagli esosomi mediante qPCR, confrontandoli con l'RNA del sangue intero. L'RNA exosomiale ha mostrato un'espressione simile sia per TNF-α sia per il fattore di crescita dell'endotelio vascolare A. La combinazione di queste tecniche ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dell'RNA per esplorare la funzione degli RNA circolanti nella modulazione dei cambiamenti nell'espressione genica e nell'identificazione di firme molecolari associate agli esosomi in condizioni fisiologiche e patologiche.

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Biologia

In questo documento vengono utilizzati dei metodi per la purificazione isolamento, e la rilevazione di esosomi, nonché le tecniche per l'analisi del loro contenuto molecolare. Questi metodi sono adattabili per l'isolamento exosome da supporti sia la cultura di cellule e fluidi biologici, e può al di là di analisi del contenuto molecolare essere utile anche per studi funzionali.

Isolamento e caratterizzazione di RNA contenenti esosomi

Vengono descritte le tecniche che descrivono una procedura a gradiente per separare gli esosomi dalle particelle del virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Questa procedura è stata utilizzata per isolare gli esosomi dalle particelle di HIV nel plasma umano da individui infetti da HIV. Gli esosomi isolati sono stati analizzati per il contenuto di citochine/chemochine.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Il fluido biliare è una preziosa fonte di vescicole/esosomi extracellulari che contengono biomarcatori potenzialmente importanti. Questo protocollo rappresenta un metodo robusto per isolare gli esosomi dalla bile umana per ulteriori analisi, tra cui la profilazione dei miRNA.

Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

I microRNA svolgono un ruolo regolatore importante e stanno emergendo come nuovi bersagli terapeutici per varie malattie umane. E 'stato dimostrato che i miRNA sono effettuate in lipoproteine ​​ad alta densità. Abbiamo sviluppato un metodo semplificato per isolare rapidamente HDL purificata per l'analisi miRNA dal plasma umano.

Veloce e semplificato Metodo per alta through-put Isolamento dei miRNA da altamente purificato lipoproteine ​​ad alta densità

Le vescicole extracellulari presenti nel sangue sono state suggerite come nuovi biomarcatori per varie malattie. Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento di microvescicole derivate da grandi membrane plasmatiche da campioni di sangue periferico e la loro successiva analisi mediante citometria a flusso convenzionale e Western Blotting.

Isolamento e caratterizzazione di microvescicole da sangue periferico

Qui, presentiamo un protocollo per purificare gli esosomi da siero con ridotta co-purificazione non-exosomal di proteine del sangue e del plasma. Il protocollo ottimizzato include ultrafiltrazione, trattamento con proteasi e cromatografia di esclusione di formato. Una maggiore purificazione di esosomi analisi a valle di vantaggi, tra cui più accurata quantificazione delle vescicole e caratterizzazione proteomica.

Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare l'isolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano

Qui, descriviamo due protocolli di isolamento delle vescicole extracellulari, centrifugazione di ultrafiltrazione e ultracentrifugazione con centrifugazione su gradiente densità, per isolare le vescicole extracellulari da campioni di liquido di lavaggio broncoalveolare murino. Le vescicole extracellulari derivate dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino con entrambi i metodi sono quantificate e caratterizzate.

Isolamento delle vescicole extracellulari dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino usando una tecnica di centrifugazione di ultrafiltrazione

Questo protocollo viene illustrato come purificare i microRNA extracellulari da terreni di coltura cellulare per piccoli RNA libreria costruzione e sequenziamento di nuova generazione. Vari punti di controllo di controllo di qualità sono descritti per permettere ai lettori di capire cosa aspettarsi quando si lavora con campioni di ingresso bassi come exRNAs.

Isolare, sequenziamento e analisi dei microRNA extracellulari dalle cellule staminali mesenchimali umane

Un esosomi sono una nuova generazione di vettori di consegna di droga. Abbiamo stabilito un protocollo di isolamento da esosomi con alta resa e purezza per la consegna di siRNA. Abbiamo anche incapsulato fluorescente coniugato non specifici siRNA in esosomi e studiato l'assorbimento cellulare di esosomi siRNA-caricato in cellule tumorali.

Preparazione degli esosomi per siRNA consegna alle cellule tumorali

Questo protocollo illustra 1) l'isolamento e la coltura di fibroblasti primari dal muscolo gastrocnemio di topo adulto e 2) la purificazione e la caratterizzazione degli esosomi utilizzando un metodo di ultracentrifugazione differenziale combinato con gradienti di densità del saccarosio seguito da analisi western blot.

Isolamento e caratterizzazione di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici

Impara a purificare esosomi da sangue e mezzi di coltura per analizzare i microRNA mediante centrifugazione differenziale e PCR in tempo reale. Questo metodo consente di identificare biomarcatori per ricerche in neuroscienza e biologia cellulare.

Purificazione e microRNA profiling di Exosomes derivati ​​dal sangue e cultura dei media

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