Name: Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Impara la coltura di fette di embrione di pollo per studiare lo sviluppo dei motoneuroni spinali. Questo protocollo utilizza immunofluorescenza per analizzare la migrazione neuronale in neurobiologia dello sviluppo.

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Vorremmo ringraziare Boast Sharon per le discussioni penetranti molti e B. Novitch per il gentile dono degli anticorpi anti-FOXP1. Questo lavoro finanziato da una borsa di studio del Wellcome Trust a KCT e una borsa di studio del progetto del Wellcome Trust di SRP (Grant numero di riferimento 094399/B/10/Z).

1. Fai soluzioni necessarie <ol><li> Tampone fosfato 1 M:. Pesare 109,4 g di Na 2 HPO 4 e 32 g di NaH 2 PO 4 H 2 0, mescolare e sciogliere in acqua al volume totale di 1 litro. </li><li> Soluzione tampone fosfato (PBS): Preparare tampone fosfato 0,1 M, 0,15 M di NaCl. 100 ml di PBS dovrebbe essere sufficiente per il trattamento di fette da 10 embrioni. </li><li> Agarosio: Calore soluzione di PBS a circa 70 ° C e aggiungere solidi a bassa temperatura di fusione agarosio lentamente, mentre mescolando continuamente. Rendono la soluzione ad una concentrazione finale del 4% (w / v) di agarosio. Fare una scorta di 50 ml di questa soluzione. Lasciare questa soluzione in un bagno d&#39;acqua mantenuto a 48 ° C fino al momento dell&#39;uso. La soluzione di agarosio inutilizzata dopo l&#39;esperimento può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane. </li><li> Anticorpo soluzione blocco: Aggiungi il siero fetale di vitello e Triton X-100 a un Concentrazione finalezione del 1% (v / v) di siero fetale bovino, 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS. 10 ml di soluzione di blocco sarà sufficiente per la immunocolorazione su 5 vetrini di sezioni al criostato. </li><li> Fissativo: Preparare NaOH 0,75 millimetri, 4% (w / v) di paraformaldeide (ATTENZIONE). Per preparare fissativo quantità di calore necessaria di acqua a 70 ° C, aggiungere NaOH concentrato a concentrazione finale desiderata, aggiungere paraformaldeide solida e mescolare fino a dissoluzione. Raffreddare su ghiaccio a 4 ° C. 10 ml di questa soluzione è sufficiente per 20 pozzetti di fette embrioni. </li><li> Saccarosio Soluzione: Preparare 10 ml di una soluzione di saccarosio al 30% (w / v) contenente 0,1 M tampone fosfato. 10 ml di questa soluzione sarà sufficiente per 10 pozzetti di fette embrioni. </li><li> 70% (v / v) di etanolo. Diluire 70 ml di etanolo assoluto con 30 ml di acqua. </li><li> Cultura Media: Preparare una soluzione di estratto di pollo 1% degli embrioni, 1% penicillina / streptomicina, 0,35% L-Glutammina, 0,1% 2-mercaptoethanol, 4% siero di pollo, 2% B27 supplemento e 100 ng / ml fattore di crescita ciliaryneurotrophic (CNTF) tutti diluito in terreno Neurobasal; preparata su ghiaccio e usato lo stesso giorno. 10 ml di mezzo di coltura è richiesto per 20 pozzetti di fette embrioni. </li></ol> 2. Chick Embryo Preparazione <ol><li> Luogo fecondati uova di gallina con il lato più lungo in orizzontale in un tiraggio forzato incubatore a 38 ° C fino a quando si sviluppano in scena 15 24. Questo richiede di solito circa 4 giorni di incubazione. </li><li> Il secondo giorno di incubazione, sterilizzare il guscio dell&#39;uovo strofinando con un fazzolettino di carta imbevuto di etanolo al 70%. Attentamente forare l&#39;estremità piatta del guscio dell&#39;uovo utilizzando un ago da 21 attaccato ad una siringa da 5 ml e rimuovere 5 ml di albumina. Questo riduce l&#39;embrione di distanza dalla shell, quindi l&#39;embrione non è danneggiata quando il serbatoio è aperto. Riportare le uova per l&#39;incubatore e incubare loro per altri 2 giorni. </li><li> Utilizzando smussato Dumont # 5 pinze carefully forare il centro della parte superiore del guscio e rimuovere circa 9 cm 2 di shell. Tagliare intorno l&#39;embrione e con attenzione sollevare l&#39;embrione e il luogo in HBSS durante la dissezione. Gli embrioni devono essere messo in scena in base alle Hamburger e Hamilton (1992) 15. Tutti gli embrioni utilizzati dovrebbe essere vicino alla fase 24. Eventuali embrioni che mostrano segni di anomalia deve essere eliminata. </li><li> Rimuovere la membrana amniotica, corio-allantoico membrana, la testa, e allantoide con due Dumont # 5 forcipe. Eviscerate l&#39;embrione per rimuovere tutti gli organi interni. Per effettuare questa operazione, tagliare aprire la linea mediana ventrale dell&#39;embrione con micro forbici dissezione, tenere l&#39;embrione attorno alla regione del tronco rostrale con un paio di pinze, afferrare la parte rostrale del intestino e il cuore e tirare caudalmente. È importante che questo è fatto pulito. Si dovrebbe essere in grado di vedere l&#39;embrione somiti chiaramente. Tagliare l&#39;embrione a metà, trasversalmente tra il buds.Now arto superiore e inferiore tagliare il corpo toracicaparete con le forbici microdissezione. </li></ol> 3. Embrione Slice Preparazione <ol><li> Rimuovere la soluzione di agarosio dal bagnomaria. Tagliare 5 cm dal fondo di una plastica monouso 3 ml pipetta Pasteur. </li><li> Rimuovere delicatamente la parte lombare della dell&#39;embrione sezionato con due pinze per cullare l&#39;embrione dalla soluzione dissezione e mettere in un piatto asciutto Petri. Utilizzando la pipetta Pasteur, rimuovere circa 2 ml di agarosio, pipetta circa 0,5 ml sopra dell&#39;embrione e quindi aspirare la fetta embrione nella pipetta. Trasferire l&#39;embrione e agarosio ad una buccia di distanza stampo di plastica fare attenzione a non introdurre bolle nel agarosio. Abbassare delicatamente l&#39;embrione al fondo del agarosio nello stampo di plastica con la sezione toracica rivolto verso il basso. L&#39;embrione deve essere posizionata per essere direttamente utilizzando un ago calibro 21. Le fette conterrà anche parte dell&#39;arto sviluppo ed è importante che l&#39;orientamento dell&#39;embrione in agarose lo consentiranno. Collocare l&#39;imbarcazione su ghiaccio per impostare l&#39;agarosio. Fare attenzione che l&#39;embrione non cambia l&#39;orientamento in questo periodo (circa 2 min). </li><li> La Leica VT1000S vibratomo (Velocità 3, frequenza 4, 400 micron di spessore fette) deve essere istituito con la camera piena di HBSS affettare e circondato da acqua ghiacciata. Il blocco di agarosio viene quindi attaccato alla piattaforma vibratomo con colla super. Il blocco di agarosio viene tagliato con una lama di rasoio per lasciare il pezzo embrione con 1-3 mm di agarosio circonda. Le fette che includono sezioni gemma degli arti con una chiara apicale ectodermica Rigde vengono selezionati e queste fette vengono poi poste in HBSS. Generalmente, ci sono solo 1-2 fette adatti per embrione. Rimuovere delicatamente l&#39;agarosio intorno alle fette di tessuto con due aghi. È essenziale che questo è fatto accuratamente. </li></ol> 4. Coltura embrioni Fette <ol><li> Aggiungere 500 ml di soluzione di coltura (di cui sopra) al required il numero di pozzetti di una 24 pozzetti bassissimo piastra di fissaggio del tessuto trattato della cultura. Trasferire le fette attentamente dalla soluzione HBSS nel pozzo. In generale, cerchiamo di avere due o tre fette in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra a 24 pozzetti in coltura tissutale incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 per 24 ore. </li></ol> 5. Sezionamento delle slice per i Immunostaining <ol><li> A seguito del periodo di coltura, aggiungere 500 microlitri di correzione unbuffered a ciascun pozzetto di fette embrioni e lasciare in ghiaccio per 20 min. La soluzione totale viene poi rimosso con attenzione e tre lavaggi PBS sono effettuate, con intervalli di 5 minuti. Le fette vengono poi lasciati in soluzione di saccarosio a 4 ° C, fino al lavello fette, circa 6 ore, ma può essere lasciato a lungo (ad esempio durante la notte). </li><li> Togliere le fette e tamponare una soluzione di saccarosio in più ed equilibrare in circa 1 ml di ottobre per circa 5 minuti a 20 ° C. Montare ogni appartamento fetta in un PTOM pieno di staccarsi stampi in plastica.Dopo il montaggio, mettere gli stampi in verticale su ghiaccio secco a solidificare. </li><li> Montare i blocchi ottobre nel criostato ed equilibrare i blocchi a -24 ° C per circa 20 min. Tagliare ogni fetta con 15 sezioni mm montato su Superfrost-Plus diapositive. Vetrini possono essere conservati a -80 ° C fino al loro utilizzo. </li></ol> 6. Immunofluorescenza <ol><li> Pipettare 1-2 ml di PBS sulle slitte orizzontali tenuti in una camera umidificata con le slitte sollevate dal fondo della camera (usiamo 1 o 2 ml pipette di plastica fissati con nastro autoclave). Incubare le sezioni in PBS per 5 min a 20 ° C per rimuovere l&#39;eccesso ottobre Rimuovere la soluzione PBS dal vetrino e aggiungere 500 ml di soluzione di blocco sulle sezioni, incubare per 30 min a 20 ° C. Rimuovere la soluzione di blocco e immediatamente aggiungere 500 ml di anticorpo primario diluito aggiunto ai vetrini, incubare a 4 ° C per 18-22 ore. </li><li> Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi e subito è statoh i vetrini con 1 ml di PBS per 5 minuti, tre volte a 20 ° C per rimuovere l&#39;eccesso di soluzione di anticorpo primario. Aggiungere 500 ml di soluzione diluita di anticorpo secondario fra le diverse sezioni. I vetrini vengono quindi lasciati a 20 ° C per 30 min. La soluzione di anticorpo secondario viene quindi rimosso e la slitta lavata 3 volte 5 min in PBS a 20 ° C. </li><li> A seguito di queste soluzioni di lavaggio, rimuovere la finale PBS lavaggio, tamponare il bordo della diapositiva per rimuovere l&#39;eccesso di PBS, aggiungere due gocce di Vectashield sulle slitte e appoggiare delicatamente un coprioggetto di vetro sopra le sezioni, evitando la formazione di bolle. Rimuovere Vectashield eccesso tamponando dal bordo delle diapositive prima di imaging. </li></ol> 7. Imaging <ol><li> Immagine le sezioni immunocolorate. Usiamo un Nikon Eclipse E80i microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera digitale ORCA Hamammatsu ER e 10 X, 40 X 20X e lenti degli obbiettivi. </li></ol>

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Nessuno degli autori concorrenti hanno interessi o conflitti di interesse.

Il protocollo qui descritto permette una fetta embrione di pollo da incubare per più di un giorno mantenendo motoneuroni viva e continuando a migrare durante il periodo di coltura. Nel chiarire le condizioni per mantenere in vita i neuroni motori, abbiamo identificato diverse caratteristiche fondamentali richieste. Sembra che il siero del pulcino fino al 4% è fondamentale per la sopravvivenza dei motoneuroni e la sua sostituzione con il siero di una specie diversa non è tollerato. È interessante notare, abbiamo trovato che la presenza di elevate concentrazioni di siero erano dannosi per le fette in quanto promosse crescita eccessiva del tessuto che porta a gravi distorsioni nella forma slice. Ancora più importante, la presenza del fattore neurotrofico ciliare anche dimostrato critico. Esso rimane possibile che le fette possono essere in grado di essere coltivate per periodi notevolmente più lunghi che solo 24 ore, forse anche consentendo la visualizzazione di input sensoriali afferenti al midollo spinale. Inoltre, la culcondizioni tura qui può anche rivelarsi utile per affettare culture del tronco encefalico in via di sviluppo e il mesencefalo / cervelletto. Forse il più grande potenziale beneficio nell&#39;uso di queste condizioni di coltura fetta è che essi facilitano la possibilità di manipolazione farmacologica della funzione della proteina minimizzando la possibilità di effetti negativi sul resto dell&#39;embrione, come il cuore. Un gran numero di inibitori e agonisti di diverse vie di segnalazione può essere utilizzato per valutare la migrazione dei diversi sottotipi di neuroni spinali e, potenzialmente, l&#39;effetto della formazione di circuiti locali spinali durante lo sviluppo. Inoltre, alcune perturbazioni genetiche di espressione della proteina, come quelli che fanno uso di siRNA e oligonucleotidi morfolino, soffrono per il fatto che essi possono essere introdotti precocemente nello sviluppo (a causa delle limitazioni nelle procedure in ovo elettroporazione) e gli effetti durano solo un breve periodo di time (tipicamente un giorno). La nostra cultura fetta viene avviato in fasi successive e offre la possibilità di utilizzare questa tecnologia in seguito in fase di sviluppo in fase di taglio per vedere i loro effetti durante il periodo della cultura della fetta. Il protocollo cultura fetta potrebbe anche permettere la visualizzazione di entrambi neurone spinale motore così come la migrazione interneurone dorsale in tempo reale tramite microscopia time-lapse video. Ciò potrebbe essere realizzato mediante microscopio a contrasto di fase a luce bianca o attraverso l&#39;uso di imaging di fluorescenza. Se quest&#39;ultima tecnica sono da utilizzare quindi l&#39;introduzione di etichette fluorescenti è necessaria. Ciò potrebbe essere realizzato mediante introduzione dei coloranti fluorescenti come DiI o DiO sia tramite marcatura retrograda dall&#39;arto o etichettatura anterograda dal ventricolo o elettroporazione in ovo di costrutti di guidare proteine ​​fluorescenti in un sottoinsieme di neuroni.

Durante lo sviluppo embrionale normale, molti tipi cellulari diversi sono generati che devono migrare dal loro punto di origine a dove finirà funzione nell&#39;organismo maturo. All&#39;interno del midollo spinale sviluppo, cellule progenitrici sono situati nella zona ventricolare alla linea mediana e generare molti sottotipi di neuroni e cellule gliali postmitotici che devono migrare da integrare in circuiti neuronali funzionali richieste per la trasformazione sensoriale e uscite motore 1. Neuroni motori spinali che controllano la contrazione dei muscoli degli arti sono stati ampiamente studiati e si sa molto delle molecole e dei meccanismi che guidano la formazione delle loro diverse sottoclassi. Tuttavia, molto meno si sa dei meccanismi attraverso i quali motoneuroni migrano, segregare e ricevere ingressi sinaptici. Motore identità sottotipo neurone viene acquisita durante lo sviluppo in modo gerarchico. Motore sottotipi dei neuroni può essere generalmente classificati into colonne distinte, le divisioni e le piscine che sono definiti dalle loro proiezioni assone. Motore colonne assoni progetto sia per i muscoli assiali, viscerali o di un arto. Divisioni motore suddividere l&#39;arto sporgente motoneuroni della colonna motore laterale (LMC) in quelli a sbalzo muscoli ventrali o dorsale 2. All&#39;interno delle divisioni, gruppi di neuroni motori del motore denominato progetto piscine per i singoli muscoli dell&#39;arto 2, 3. Arto-sporgenti neuroni motori sono definite dalla loro espressione del fattore di trascrizione FOXP1 4, 5, mentre l&#39;identità divisionale è caratterizzato dalla espressione dei fattori di trascrizione omeodominio Islet-1 (ventrale sporgente) o LHX-1 (dorsalmente sporgente) 6. Infatti, LHX-1 l&#39;espressione è necessario per le proiezioni appropriate dorsali dei motoneuroni 7. Ognuno di questi sottotipi occupano posizioni distinte all&#39;interno del midollo spinale, i neuroni motori ventrali proiettano venire a risiedere mediale dorsalmente projecting motoneuroni. Il risultato è la LMC essere separati in cosiddetta LMCmedial (LMCM) e LMClateral (LMCl) divisioni. Organizzazione divisionale piscina e il motore è acquisito in due fasi 8. Nella prima fase, la segregazione divisionale è ottenuta tramite una migrazione dei motoneuroni una caratteristica mediale a laterale moda. Le cellule LMCl sono generati dopo che le cellule LMCM e così LMCl migra attraverso la LMCM di raggiungere la sua posizione finale decantazione. La seconda fase si motoneuroni all&#39;interno di una divisione e cluster li in motori neuron piscine, presumibilmente attraverso un dorso-ventrale smistamento dei motoneuroni. Membri della famiglia catenina-dipendente caderina classica hanno dimostrato di essere fondamentale per entrambe le fasi di motoneuroni 8-10 dell&#39;organizzazione. Tuttavia, come funzione caderina controlla il movimento delle cellule è poco conosciuta. L&#39;acquisizione di identità colonnare, divisionali e la piscina sono necessari i segnali estrinseci quel modello intrinsecamenc espressione di fattori di trascrizione 11. Inoltre, circa il 50% di tutti i motoneuroni muoiono per apoptosi durante lo sviluppo normale in un processo che richiede segnali estrinseci dal arto, in gran parte attraverso il sostegno neurotrofico di sopravvivenza dei motoneuroni. Così, motor neuron sviluppo richiede il contesto più idoneo deve essere mantenuta in un timecourse relativamente lungo. Per questo motivo, le pratiche di generare culture fetta midollo spinale di mantenere la sopravvivenza dei neuroni motori richiedono la delucidazione delle appropriate condizioni di coltura. Precedenti culture fetta embrioni sono stati utilizzati per seguire il comportamento di estrinsecamente aggiunto purificato popolazioni neuronali 12-14. Tuttavia, per le condizioni di conoscenza nostra cultura che facilitano in situ di sopravvivenza dei motoneuroni e la migrazione all&#39;interno della stessa sezione non sono stati pubblicati. Abbiamo modificato una condizione standard cultura che facilita la sopravvivenza di purificato, dissociate motoneuroni craniali di agevolare motore sviluppo dei neuroni all&#39;interno di un sistema di coltura degli embrioni fetta. Abbiamo anche monitorato il posizionamento dei motoneuroni superstiti e dimostrano che le posizioni ampiamente normali del motoneurone divisioni viene acquisita durante il periodo di coltura.

<table border="1"><tbody><tr><td> Uova </td><td> Henry Stewart Farms, Regno Unito </td><td></td><td> Le uova fecondate Brown Bovan Hen Gold (Henry Farms Stewart, Regno Unito), conservati a 14 ° C fino a quando l&#39;incubazione </td></tr><tr><td> 21 gauge </td><td> BD-Microlance-3 </td><td> 304432 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa da 5 ml </td><td> BD Plastipak </td><td> 302187 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 forcipe Dumont </td><td> Roboz </td><td> RS 5045 </td><td></td></tr><tr><td> Micro forbici per dissezione </td><td> Roboz </td><td> RS 5910SC </td><td> (3.5 in diritto) </td></tr><tr><td> Embrione formelle: Peel distanza stampi </td><td> Agar Scientific </td><td> G3764 </td><td> Piramidale sagomata 22 mm a 12 mm </td></tr><tr><td> Super Glue </td><td></td><td></td><td> Power Flex, Loctite </td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> SIGMA </td><td> 32221 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Sodio di-idrogeno fosfato, mono-idrato </td><td> BDH </td><td> 102454R </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio mono-idrogeno fosfato </td><td> VWR / BDH </td><td> 102494C </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> VWR / BDH </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosio a bassa temperatura di fusione </td><td> Invitrogen </td><td> 16520 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Gibco </td><td> 10500-064 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> SIGMA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Soda caustica </td><td> FLUKA </td><td> 71689 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> VWR / BDH </td><td> 28794.295 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette Pasteur in plastica usa e getta </td><td> Elkay di precisione laboratorio di consumo </td><td> 127-P503-000 </td><td> Liquipette 3 ml di volume </td></tr><tr><td> Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> SIGMA </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Carbonato acido di sodio </td><td> SIGMA </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Embrione di pollo estratto </td><td> Seralabs </td><td> CE650-J </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina soluzione </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutammina soluzione </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanolo </td><td> Gibco </td><td> 21985 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di cavallo </td><td> Southern Group Labs </td><td> 9028B </td><td></td></tr><tr><td> B27 supplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Media Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> Cat ~ 2103 </td><td></td></tr><tr><td> CilliaryNeurotrophic fattore (CNTF) </td><td> R e Sistemi D </td><td> 557-NT-010 </td><td></td></tr><tr><td> Chick Siero </td><td> SIGMA </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi primari </td><td></td><td></td><td> sono stati acquistati da Developmental Studies Ibridoma Bank, con l&#39;eccezione di anticorpi anti-FOXP1, che erano un gentile dono da Bennett Novitch di UCLA. Primari diluizioni anticorpi erano coniglio anti-FOXP1 (1/32000), Topo anti-Lhx1 / 2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FOXP1 (1/1000). Tutti gli anticorpi sono stati conservati a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Anticorpi secondari </td><td></td><td></td><td> Donkey anti-Guinea Pig (Cy3) (1:1000) acquistato da Jackson Laboratories Inc. Immunoreseach Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-coniglio (Alexa Fluor 594) (1:1000) acquistato da Invitrogen Tutti gli anticorpi sono stati conservati a 4 ° C. </td></tr><tr><td> 24-pozzetti </td><td> Corning COSTAR </td><td> 3473 </td><td> bassissimo attacco 24-pozzetti </td></tr><tr><td> Ottobre </td><td> Tissue Tek, Sakura </td><td> 4583 </td><td> Temperatura ottimale di taglio </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H1000 </td><td> Vectashield fluorescente mezzo di montaggio </td></tr><tr><td> Diapositive </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td> SuperFrost-Plus vetrini caricati positivamente, 25 x 75 x 1,0 mm </td></tr><tr><td> Copertura in vetro </td><td> VWR International </td><td> 631-0167 </td><td> 25x60 millimetri </td></tr><tr><td> Forzato progetto di incubatore: </td><td> Lione Electric Company </td><td></td><td> mantenuto umido garantendo livelli dell&#39;acqua sempre sufficienti, mantenuta a 38 ° C </td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Brite, Huntingdon, UK </td><td></td><td> -36 ° C </td></tr><tr><td> Tissue Culture Incubator </td><td> DH Autoflow </td><td></td><td> Nuaire 38 ° C CO, 5% 2 </td></tr><tr><td> Vibratomo </td><td> Leica </td><td></td><td> Leica VT1000-S </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon Eclipse E80i microscopio a fluorescenza </td></tr><tr><td> Macchina fotografica digitale </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon DS5M e Hamammatsu ORCA ER </td></tr></tbody></table>

embrione di pollo midollo spinale fetta protocollo cultura

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Culture fetta può facilitare la manipolazione dello sviluppo embrionale sia farmacologicamente e attraverso manipolazioni genetiche. In questo sistema ridotto, potenziali effetti collaterali letali a causa di applicazioni farmacologiche sistemiche possono essere superati. Tuttavia, condizioni di coltura devono garantire che lo sviluppo procede normali nell&#39;ambiente ridotto della fetta. Abbiamo focalizzato sullo sviluppo del midollo spinale, in particolare quello dei motoneuroni spinali. Abbiamo sistematicamente variati condizioni di coltura di fette di embrione di pollo dal punto in cui i motoneuroni spinali più era nato. Abbiamo analizzato il numero e il tipo di motoneuroni sopravvissute durante il periodo di coltura e la posizione di tali neuroni motori rispetto a quella in vivo. Abbiamo trovato che tipo di siero e fattori neurotrofici sono stati richiesti durante il periodo di coltura e sono stati in grado di mantenere in vita i neuroni motori per almeno 24 ore e consentire che i neuroni motori di migrare verso posizioni appropriate nelmidollo spinale. Vi presentiamo queste condizioni di coltura e la metodologia di preparazione delle culture embrione fetta utilizzando embrioni di pollo eviscerati incorporati in agarosio e tagliata con una vibratomo.

L&#39;uso di sezioni colti per seguire lo sviluppo dei neuroni interneuroni e proiezione ha influenzato progredire la nostra comprensione della generazione di organizzazione all&#39;interno della corteccia 16. Nel midollo spinale, il motore dello sviluppo dei neuroni è stato seguito utilizzando colture di embrioni di zebrafish interi 17. Tuttavia, spinale motoneurone organizzazione in zebrafish è relativamente semplice (a causa della mancanza di muscoli degli arti grandi pesci). I meccanismi molecolari che guidano una gerarchia di organizzazione spinale motoneurone durante lo sviluppo dei vertebrati superiori sono attualmente poco compresi. Le condizioni di coltura che facilitano la sopravvivenza dei neuroni e il corpo migrazione cellulare in colture di embrioni fetta di vertebrati superiori sono quindi necessari. Attualmente, midollo spinale culture fetta di vertebrati superiori sono stati utilizzati per neuroni dissociate seme sopra le fette 12-14, indagare assoni contrassegnati in modo fluorescente nella periferia della fetta18, o del comportamento di cellule progenitrici nei primi stadi dello sviluppo del midollo spinale 19. Affettare condizioni di coltura per i cavi dopo spinale, in particolare quelli che mantengono motoneuroni sviluppo attualmente mancano. Per tentare di seguire spinale lo sviluppo neuronale, in particolare quella dei motoneuroni spinali, abbiamo studiato diverse condizioni di coltura che potrebbero promuovere la sopravvivenza dei neuroni motori e l&#39;acquisizione di ordine iniziale nell&#39;organizzazione del motore attraverso la migrazione laterale dei neuroni. Prove iniziali tramite stadio 18 allo stadio 20 fette di pollo del midollo spinale di embrioni si sono rivelati infruttuosi, non siamo stati in grado di mantenere in vita i neuroni motori per più di un paio d&#39;ore e sono stati in grado di dimostrare la generazione di un numero considerevole di cellule LMCl nel periodo di coltura (dati non mostrato). Abbiamo quindi studiato le culture fetta di stadio 24 embrioni, una TimePoint quando la maggior parte dei neuroni LMCM LMCl e sono stati generati, ma quando LMCl neurone migrazione è ancora nella sua infancy (Figura 1a-c). Questa migrazione laterale dei neuroni LMCl è in gran parte completa per fase 27, circa 24-36 ore più tardi (Figura 1 df). Il nostro test potrebbe quindi essere semplificata per essere in grado di mantenere in vita i neuroni e di facilitare la loro migrazione lateralmente nel corno ventrale. Abbiamo iniziato i nostri esperimenti con condizioni di coltura relativamente semplici contenenti solo Hank soluzione equilibrata salina con o senza siero di pollo o di estratto di embrione di pollo. In tutti i casi, anche se siamo stati in grado di mantenere i neuroni LMC nella fetta, abbiamo trovato poche prove di neuroni LMCl mantenuto (almeno da espressione di LHX-1). Inoltre, abbiamo trovato espressione di geni appropriati come HB9 nel midollo spinale dorsale, una situazione che non si verifica in vivo (dati non mostrati). Quindi, queste condizioni di coltura semplici non sono adatte per lo studio dell&#39;acquisizione di organizzazione dei motoneuroni. Abbiamo così cercato conditio più complessans e come base utilizzata una formulazione che è stato pubblicato per favorire la sopravvivenza del dissociate motoneuroni embrionali di pollo cranici. Questa condizione 20 (1% estratto di embrione di pollo, 1% Pen Strep, 0,35% L-Glutammina, 0,1% 2-mercaptoetanolo, siero di cavallo 2%, 2% B27 supplemento e 50 ng / ml di fattore di crescita ciliaryneurotrophic (CNTF) nel mezzo Neurobasal (qui chiamato Guthrie media) ha mantenuto motoneuroni più viva che i mezzi di comunicazione più semplici. Inoltre, non ha comportato l&#39;espressione dei fattori di trascrizione spuria del midollo spinale dorsale. Tuttavia, la sopravvivenza dei neuroni LMCl era scarsa (Figura 1 gi, p). Pertanto ciò che varia considerati fattori chiave nel mezzo Guthrie, cioè l&#39;animale di origine del siero, la concentrazione del siero e la concentrazione del CNTF nel mezzo. Abbiamo trovato che cambiando il siero di siero di cavallo Chick siero e un aumento nella concentrazione del CNTF da 50 ng / ml e 100 ng / ml sostanzialmente aumentato tegli sopravvivenza delle cellule e LMCl LMCM e anche permesso loro migrazione nel corno ventrale sul hr 24 delle condizioni di coltura (figura 1 jl, p). Il numero totale di neuroni motore, il rapporto di LMCM a LMCl e, in effetti, la migrazione delle cellule LMCl nel corno ventrale appariva molto simile a sezioni di embrioni che era stato permesso di sviluppare in ovo piuttosto che nella cultura slice (Figura 1 KO, p). Pertanto, riteniamo che in base al numero fattore di trascrizione cellulare espressione, e la posizione dei motoneuroni, le nostre condizioni di coltura fetta ricapitolare il normale sviluppo del motoneurone spinale, almeno per un periodo di 24 ore. <img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" /> Figura 1. a - c. Stato di generazione di LMC (FOXP1 colorazione inb), e LMCl (LHX-1 in una colorazione) nella prima fase 24. c è una fusione dei due canali. La linea mediana è mostrato come una linea tratteggiata in A e D, V mostra l&#39;orientamento del dorsoventrale (D, V) asse del midollo spinale d -. F. . Stato della LMC (FOXP1 colorazione in d) e LMCl (LHX-1 in colorazione e) l&#39;organizzazione nella fase 27 f è una fusione dei due canali g -. I. LHX-1 (g) e FOXP1 (h) espressione in sezioni di una fetta coltivate in un mezzo che supporta cranica motor neuron sopravvivenza cellulare (media Guthrie, il nostro &quot;iniziale media&quot; vedi riferimento 20). LHX-1 non è più espresso in neuroni motori, anche se vi è qualche sopravvivenza delle cellule LMC rappresentati da FOXP1 espressione. D, V in (g) mostra l&#39;orientamento del dorsoventrale (D, V) asse del midollo spinale. ML mostra l&#39;orientamento del mediolaterale (M, L) dell&#39;asse della scavo di Pinal j - l. Cellule LMCl (LHX-1 nel corno ventrale in j) e la LMC in generale (FOXP1 in k) può essere osservato in fette coltivate in mezzo contenente 4% di siero pulcino e 100 ng / ml CNTF. Si noti che alcune cellule LMCl si trovano in una posizione laterale nel corno ventrale. La freccia a (j) indica la posizione laterale di alcune delle cellule LMCl. (L) è una fusione dei due canali m -. O. Stato di espressione di LHX-1 (m) e FOXP1 (n) in sezioni di un embrione mantenuto in ovo durante la coltura fetta dell&#39;embrione mostrato nella j - l. (O) è una fusione dei due canali. P. La quantificazione della percentuale di LMCl (FOXP1 + ve / Lhx1 + ve), le cellule contro LMC (FOXP1 + ve / Lhx1-ve) cellule che si trovano nelle culture fetta in condizioni diverse compared controllare embrioni conservati in ovo (che rappresentano il 100%). Student t-test rappresenta *** p &lt;0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

Culture fetta facilitare la manipolazione dello sviluppo embrionale di gene e perturbazioni farmacologiche. Tuttavia, le condizioni di coltura deve garantire che il normale sviluppo può procedere nell&#39;ambiente ridotto della fetta. Illustriamo un protocollo che facilita il normale sviluppo del midollo spinale procedere per almeno 24 ore.

Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Lo scopo generale di questa procedura è coltivare fettine di embrione di pollo per mantenere uno sviluppo neuronale normale, in particolare dei neuroni motori spinali. Questo risultato si ottiene innanzitutto dissezionando l'embrione di pollo per rimuovere gli organi viscerali. Il secondo passaggio consiste nel preparare e tagliare l'embrione incorporato in un blocco di agarosio.Successivamente, la sezione dell'embrione viene rimossa con attenzione dall'agarro. L'ultimo passaggio consiste nel trasferire la sezione embrionale in un mezzo di coltura, che viene incubato per 24 ore a 37 gradi Celsius. Infine, l'immunofluorescenza mediante microscopia su sezioni sottili della sezione embrionale viene utilizzata per evidenziare la presenza e la localizzazione dei neuroni motori spinali al termine del periodo di coltura.Pertanto, questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurobiologia dello sviluppo. Ad esempio, ai meccanismi e alle molecole coinvolti nella migrazione dei neuroni motori spinali. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà, poiché è necessaria molta attenzione durante le fasi di dissezione del protocollo.Posizionare 10 uova fecondate con il lato più lungo in posizione orizzontale in un incubatore a circolazione forzata a 38 gradi Celsius fino a quando raggiungono lo stadio di hamburger e Hamilton 24. Ciò richiede solitamente circa quattro giorni di incubazione. Nel secondo giorno di incubazione, sterilizzare il guscio dell'uovo tamponandolo con carta assorbente imbevuta di Etanolo al 70%, quindi praticare con attenzione un foro nel fondo piatto del guscio dell'uovo utilizzando un ago da 21 gauge collegato a una siringa da cinque millilitri ed estrarre cinque millilitri di albume.Questo allontana l'embrione dal guscio, in modo che l'embrione non venga danneggiato quando il guscio viene aperto. Rimettere le uova nell'incubatrice e farle sviluppare per altri due giorni. Trascorsi i due giorni, utilizzare un oggetto arrotondato.Fare di più. Numero cinque, utilizzare la pinzetta per forare con attenzione la parte superiore centrale del guscio e rimuovere un quadrato di guscio di circa nove centimetri di lato. Tagliare intorno all'embrione ed estrarlo con cura, quindi posizionarlo in HBSS.Per la dissezione. Tutti gli embrioni utilizzati devono essere prossimi allo stadio 24. Gli embrioni che mostrano segni di anomalie devono essere scartati.Posizionare la piastra contenente l'embrione sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzare due pinze n. 5 per rimuovere la membrana amniotica. Rimuovere la membrana corioallantoidica, l'allantoide e la testa; quindi eviscerare l'embrione rimuovendo tutti gli organi interni, praticando un'incisione lungo la linea mediana ventrale dell'embrione con forbici microchirurgiche.Poi afferrare l'embrione intorno alla regione del tronco rostrale con una pinzetta. Afferrare la parte rostrale dell'intestino e del cuore e tirare. Si dovrebbero vedere chiaramente i somiti dell'embrione.Ora tagliare la parete corporea toracica utilizzando forbici da microdissezione. Successivamente, tagliare l'embrione a metà trasversalmente tra gli abbozzi degli arti superiori e inferiori. Rimuovere delicatamente la metà lombare dell'embrione dissezionato utilizzando due pinzette per sostenere l'embrione dalla soluzione di dissezione e posizionarlo in una piastra di Petri asciutta usando una pipetta di plastica monouso lunga circa cinque centimetri.Tagliare dal basso, aspirare circa due millilitri di agarosio fuso al 4% peso/volume. Aggiungere in PBS circa 0,5 millilitri di agarosio sopra l'embrione, quindi aspirare il frammento di embrione nella pipetta. Trasferire l'embrione e l'agarosio in uno stampo di plastica rimovibile, evitando di introdurre bolle nell'agarosio.Abbassare delicatamente l'embrione sul fondo degli aros nello stampo di plastica con la sezione toracica rivolta verso il basso e utilizzare un ago da 25 gauge per assicurarsi che l'embrione sia dritto. Negli aros sarà presente anche parte dell'arto in via di sviluppo ed è importante posizionare gli embrioni verticalmente negli aros; posizionare quindi lo stampo di plastica sul ghiaccio per circa due minuti. Per solidificare gli aros, prestare attenzione affinché l'orientamento dell'embrione non cambi durante questo periodo.Impostare un dispositivo simile al VT 1000 S in modo che la camera sia riempita con HBSS e circondata da ghiaccio. Acqua fredda. Utilizzare colla cianoacrilica per fissare il blocco di agarosio alla piattaforma del vibrometro, quindi tagliare il blocco con una lametta in modo da lasciare il frammento di embrione con uno o tre millimetri di agarosio intorno.Avviare il vibratomo e iniziare a sezionare l'embrione. Vengono selezionati i tagli che includono sezioni dell'abbozzo degli arti con una chiara cresta ectodermica apicale, quindi trasferiti in una piastra contenente HBSS. Generalmente, vi è soltanto uno o due tagli adatti per embrione.Rimuovere delicatamente l'agarosio intorno alle fette di tessuto utilizzando due aghi. È fondamentale eseguire questa operazione in modo accurato e attento. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di coltura al numero richiesto di pozzetti di una piastra da coltura tessutale a 24 pozzetti con attacco ultra basso.Trasferire con attenzione le fette dalla soluzione HBSS nella piastra, posizionando due o tre fette in ogni pozzetto; quindi inserire la piastra a 24 pozzetti nell'incubatrice per colture cellulari a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 24 ore. Al termine del periodo di coltura, aggiungere 500 microlitri di fissativo non tampone in ciascun pozzetto contenente le fette embrionali e lasciare sul ghiaccio per 20 minuti. Successivamente, aspirare con cura tutta la soluzione e lavare tre volte con PBS a intervalli di cinque minuti. Quindi aggiungere il 30% di saccarosio in PBS nei pozzetti e collocare la piastra a quattro gradi Celsius per circa sei ore o più, fino a quando le fette affonderanno.Dopo che le sezioni sono affondate, trasferirle in una piastra di Petri pulita da 10 centimetri e asciugare delicatamente l'eccesso di soluzione di saccarosio. Quindi aggiungere un millilitro di OCT e lasciare equilibrare le sezioni per cinque minuti a 20 gradi Celsius. Montare ogni sezione in modo piatto in uno stampo di plastica rimovibile riempito di OCT dopo il montaggio.Posizionare i contenitori verticalmente sul ghiaccio secco per solidificare; montare i blocchi di OCT sul criostato ed equilibrare i blocchi a meno 24 gradi Celsius per circa 20 minuti. Quindi tagliare ciascun blocco in sezioni da 15 micron e montarle su vetrini SuperFrost Plus. I vetrini possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo per la colorazione immunofluorescente, come indicato nella sezione testuale del protocollo; questa immagine mostra lo stato di formazione della colonna motoria laterale allo stadio Hamburger e Hamilton 24.La divisione laterale della colonna motoria laterale è visualizzata mediante colorazione con LH X uno nel pannello di sinistra. La colonna motoria laterale è visualizzata mediante colorazione con Fox P uno nel pannello centrale e il pannello di destra rappresenta la sovrapposizione dei due canali. La linea mediana è indicata come una linea tratteggiata e DV indica l'asse dorso-ventrale.Lo stato della divisione laterale della colonna motoria laterale è nuovamente mostrato dalla colorazione con LH X uno nel pannello sinistro e dalla colonna motoria laterale mediante colorazione con Fox P uno nel pannello centrale, con l'immagine sovrapposta a destra. Queste immagini mostrano lo sviluppo allo stadio 27. Le immagini mostrano l'espressione di LH X uno a sinistra e l'espressione di Fox P uno nel pannello centrale in sezioni di una fetta coltivata in un mezzo che supporta la sopravvivenza di neuroni motori cranici dissociati.LH X uno non &egrave; pi&ugrave; espresso nei neuroni motori, anche se &egrave; presente una certa sopravvivenza delle cellule del LMC, evidenziata dall'espressione di Fox P uno. DV rappresenta l'orientamento dell'asse dorso-ventrale del midollo spinale, e ML rappresenta l'orientamento dell'asse mediale-laterale della colonna laterale dei motoneuroni. Le cellule della divisione laterale, di nuovo colorate per LH X uno nel corno ventrale nel pannello sinistro e il LMC in generale colorato per Fox P uno nel pannello centrale, possono essere osservate in sezioni coltivate in un mezzo contenente 4% di siero di pollo e 100 nanogrammi per millilitro di CNTF.Si noti che alcune cellule della divisione laterale della colonna motoria laterale si trovano in posizione laterale nel corno ventrale, come indicato dalla freccia nel pannello di sinistra. Questa immagine mostra lo stato di espressione di LH X uno e Fox P uno in sezioni di un embrione mantenuto in OVO durante la coltura di fette dell'embrione precedentemente mostrata. Questo istogramma mostra i risultati della quantificazione della percentuale di cellule della divisione laterale della colonna motoria laterale, che risultano positive a FOX P uno e LHX uno, rispetto alle cellule della colonna motoria laterale, che risultano positive a FOX P uno e LHX uno.I dati negativi sono mostrati per le cellule trovate nelle colture di tessuto in diverse condizioni rispetto agli embrioni di controllo mantenuti in ovo, che rappresentano il 100%. I dati sono stati analizzati utilizzando il test t di Student. Le tre asterischi indicano un livello di significatività inferiore a 0,01. Durante l'esecuzione di questo protocollo, è importante prestare attenzione durante la dissezione dell'embrione e quando si rimuovono gli agros dalle sezioni, poiché è fondamentale mantenere l'integrità degli assoni motori nel lembo limbico.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo video dimostra nuova cultura, un metodo con cui sono coltivati ​​embrioni di pollo al di fuori l'uovo per un massimo di 24 ore. Questo metodo permette di studiare lo sviluppo precoce (stria primitiva a 14 som.), Un periodo corrispondente a E7-9 nel topo. Le applicazioni di questa tecnica sono elettroporazione, ibridazione in situ e immunoistochimica.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

In questo articolo presentiamo un metodo per il trapianto di cellule staminali umane in varie regioni del sistema nervoso centrale di un embrione di pollo. Ciò fornisce...

Lo xenotrapianto di cellule staminali umane in embrioni di pollo

Vi presentiamo un metodo per preparare le fette di organotipica metà gestazione embrioni di topo per l'imaging coltivazione e time-lapse di escrescenza dei nervi periferici.

Slice Cultura organotipica di GFP che esprimono embrioni di topo per imaging in tempo reale della crescita degli nervi periferici

Il tronco cerebrale uditivo pollo è costituita da nuclei responsabile per l'elaborazione del suono binaurale. Una preparazione singola fetta coronale mantiene l'intero circuito mentre l'approccio colto fornisce una preparazione unica di studiare lo sviluppo della struttura neuronale e della funzione uditiva a livello molecolare, cellulare e di rete.

La preparazione e la cultura di fette di pollo uditive tronco

Imaging del tessuto embrionale in real-time è una sfida per lunghi periodi di tempo. Qui vi presentiamo un test per monitorare i cambiamenti cellulari e sub-cellulare del midollo spinale pulcino per lunghi periodi con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questa tecnica può essere adattato ad altre regioni del sistema nervoso e sviluppo embrionale.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

Un metodo di espressione genica nel tubo neurale può essere downregulated in una cella di tipo-specifico, tracciabile modo descritto. Noi dimostrare...

In elettroporazione ovo di miRNA-based plasmidi nel tubo neurale sviluppo e valutazione di fenotipi da Injection DiI in Open-book Preparazioni

Il video dimostra la rigenerazione funzionale delle connessioni propriospinali utilizzando un test basato su array multi-elettrodo (MEA). Le fette del midollo spinale vengono posizionate sul MEA e possono fondersi. Le fette fuse vengono separate meccanicamente creando una lesione, inducendo i neuroni propriospinali a crescere sopra la lesione e collegare le fette. L'attività elettrica delle fette viene valutata per identificare la rigenerazione delle connessioni funzionali.

Studio della rigenerazione delle connessioni funzionali tra le fette del midollo spinale utilizzando un array multi-elettrodo

Modelli di coltura cellulare forniscono un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e quindi forniscono una potente piattaforma per chiarire numerosi aspetti della biologia delle cellule neuronali. Descriviamo un metodo rapido, economico e affidabile per isolare, dissociare, e la cultura neuroni sensoriali da embrioni di pollo. Sono forniti anche i dettagli di preparazione substrati e immunocitochimica.

Isolamento e Cultura della dissociato neuroni sensoriali da embrioni di gallina

Qui vi presentiamo un protocollo che si basa su fette midollo spinale coltivate su array multi-elettrodo per studiare la rigenerazione funzionale delle connessioni propriospinali in vitro.

Indagare rigenerazione funzionale in organotipiche midollo spinale Co-culture Grown in array multi-elettrodo

Qui, presentiamo un organotipiche coltura protocollo per crescere organi embrionali di pollo in vitro. Utilizzando questo metodo, lo sviluppo del tessuto embrionale pollo può essere studiato, pur mantenendo un elevato grado di controllo dell'ambiente di cultura.

Metodo di coltura organotypic per studiare lo sviluppo dei tessuti embrionali di pollo

Qui presentiamo un protocollo per ottenere fette uditive non coronali del tronco cerebrale dell'embrione di pollo per lo studio delle proprietà tonotopiche e delle traiettorie di sviluppo all'interno di una fetta del tronco cerebrale. Queste sezioni includono sezioni sagittali, orizzontali e orizzontali/trasversali che comprendono regioni tonotopiche più grandi all'interno di un singolo piano di fette rispetto alle sezioni coronali tradizionali.

Affettare il tronco cerebrale uditivo embrionale del pollo per valutare gradienti tonotopici e microcircuiti

Impara la coltura di fette di embrione di pollo per studiare lo sviluppo dei motoneuroni spinali. Questo protocollo utilizza immunofluorescenza per analizzare la migrazione neuronale in neurobiologia dello sviluppo.

Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

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