Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di coltivare fette di embrioni di pollo per mantenere il normale sviluppo neuronale, in particolare dei motoneuroni spinali. Ciò si ottiene sezionando prima l'embrione di pollo per rimuovere gli organi viscerali. Il secondo passo consiste nel preparare e affettare l'embrione incorporato in un blocco di agarro.

Successivamente, la fetta di embrione viene accuratamente rimossa dall'agarro. Il passaggio finale consiste nel trasferire la fetta di embrione in un terreno di coltura, che viene incubato per 24 ore a 37 gradi Celsius. In definitiva, la microscopia a immunofluorescenza su sezioni sottili della fetta di embrione viene utilizzata per mostrare la presenza e la posizione dei motoneuroni spinali dopo il periodo di coltura.

Quindi questo metodo può aiutare ad affrontare le domande chiave nel campo della neurobiologia dello sviluppo. Ad esempio, i meccanismi e le molecole coinvolte nella migrazione dei motoneuroni spinali. Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché è necessaria molta attenzione durante le fasi di dissezione del protocollo.

Metti 10 uova fecondate con il lato più lungo orizzontalmente in un'incubatrice a tiraggio forzato a 38 gradi Celsius fino a quando non si sviluppano fino allo stadio 24 di hamburger e Hamilton. Questo di solito richiede circa quattro giorni di incubazione. Il secondo giorno di incubazione, sterilizzare il guscio d'uovo strofinandolo con una carta velina imbevuta di etanolo al 70%, perforare con cura l'estremità piatta del guscio d'uovo usando un ago calibro 21 attaccato a una siringa da cinque millilitri e rimuovere cinque millilitri di albumina.

Questo abbassa l'embrione lontano dal guscio in modo che l'embrione non venga danneggiato quando il guscio viene aperto. Rimetti le uova nell'incubatrice e incubale per altri due giorni. Trascorsi i due giorni, utilizzare smussato.

Fai di più. Numero cinque, pinza per perforare con cura la parte superiore centrale del guscio e rimuovere circa nove centimetri quadrati di guscio. Taglia intorno all'embrione e solleva con cura l'embrione e mettilo in HBSS.

Per la dissezione. Tutti gli embrioni utilizzati dovrebbero essere vicini allo stadio 24. Tutti gli embrioni che mostrano segni di anomalia devono essere scartati.

Posizionare la capsula contenente l'embrione sotto un microscopio da dissezione. Utilizzare due pinze du al numero cinque per rimuovere la membrana dell'amnio. Il coro Alan alla membrana, l'Alan Tous e la testa poi eviscerano l'embrione per rimuovere tutti gli organi interni utilizzando forbici da dissezione micro per aprire la linea mediana ventrale dell'embrione.

Quindi tieni l'embrione attorno alla regione del tronco rostrale con un paio di pinze. Afferra la parte rostrale dell'intestino e il cuore e tira. Trimestrale. Dovresti essere in grado di vedere chiaramente i somiti dell'embrione.

Ora taglia la parete del corpo toracico usando le forbici per microdissezione. Successivamente, taglia l'embrione a metà trasversalmente tra le gemme dell'arto superiore e inferiore. Rimuovere delicatamente la metà lombare dell'embrione sezionato usando due pinze per cullare l'embrione fuori dalla soluzione di dissezione e metterlo in una capsula di Petri asciutta usando una pipetta per pasta usa e getta di circa cinque centimetri.

Tagliare dal basso, aspirare circa due millilitri di fuso al 4% in peso per volume. Aros in PBS, pipettare circa 0,5 millilitri di aros sopra l'embrione, quindi aspirare il pezzo di embrione nella pipetta. Trasferisci l'embrione e gli aros in uno stampo di plastica staccabile senza introdurre bolle negli aros.

Abbassare delicatamente l'embrione sul fondo dell'aros nello stampo di plastica con la sezione toracica rivolta verso il basso e utilizzare un ago calibro 25 per assicurarsi che l'embrione sia dritto. L'agros conterrà anche parte dell'arto in via di sviluppo ed è importante che gli embrioni posizionati verticalmente nell'aros per consentire questo pongano lo stampo di plastica sul ghiaccio per circa due minuti. Per impostare l'aros, fare attenzione che l'embrione non cambi orientamento durante questo periodo.

Installare il VT 1000 S per applicazioni simili in modo che la camera sia riempita di HBSS e circondata da ghiaccio. Acqua fredda. Usa la super colla per fissare il blocco aros alla piattaforma Vibram e poi taglia il blocco con una lama di rasoio per lasciare il pezzo di embrione con uno o tre millimetri di aros che lo circondano.

Inizia il vibrato e inizia ad affettare l'embrione. Le fette che includono sezioni di gemme degli arti con una chiara cresta elettrodermica apicale vengono selezionate e poi trasferite in una capsula di HBSS. Generalmente, ci sono solo una o due fette adatte per embrione.

Rimuovere delicatamente l'agarosio attorno alle fette di tessuto utilizzando due aghi. È essenziale che ciò avvenga fatto in modo accurato e attento. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di coltura al numero richiesto di pozzetti di una coltura tissutale a 24 pozzetti a bassissimo attacco.

Trasferire con cura le fette dalla soluzione HBSS nel pozzetto, posizionando due o tre fette in ciascun pozzetto, quindi posizionare la piastra da 24 pozzetti nell'incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore dopo il periodo di coltura a 500 microlitri di fix non tamponato su ciascun pozzetto di fette di embrione e lasciare in ghiaccio per 20 minuti. Quindi aspirare accuratamente la soluzione totale e lavare tre volte in PBS a intervalli di cinque minuti. Quindi aggiungere il 30% di saccarosio in PBS ai pozzetti e posizionare la piastra a quattro gradi Celsius per circa sei ore o più fino a quando le fette non affondano.

Dopo che le fette sono affondate, spostale in una capsula di Petri pulita di 10 centimetri e tampona la soluzione di saccarosio extra. Quindi aggiungere un millilitro di OCT e lasciare che le fette si equilibrino per cinque minuti a 20 gradi Celsius. Montare ogni fetta in un OCT riempito, staccare lo stampo di plastica dopo il montaggio.

Posizionare gli stampi verticalmente sul ghiaccio secco per solidificare, montare i blocchi OCT sul criostato ed equilibrare i blocchi a meno 24 gradi Celsius per circa 20 minuti. Quindi tagliare ogni fetta in sezioni da 15 micron e montarla su super frost più vetrini. I vetrini possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius fino a quando non sono necessari per la colorazione immunofluorescente come indicato nella parte di testo del protocollo, questa immagine mostra lo stato di generazione della colonna motoria laterale allo stadio 24 di Hamilton e Hamilton.

La divisione laterale della colonna motore laterale è visualizzata dalla colorazione LH X one nel pannello sinistro. La colonna motore laterale viene visualizzata mediante colorazione con Fox P one nel pannello centrale e il pannello destro è una fusione dei due canali. La linea mediana è mostrata come una linea tratteggiata e DV denota l'asse ventrale dorsale qui.

Lo stato della divisione laterale della colonna motore laterale è nuovamente mostrato dalla colorazione LH X one nel pannello sinistro e la colonna motore laterale dalla colorazione Fox P one nel pannello centrale con l'immagine unita a destra. Queste immagini mostrano lo sviluppo nella fase 27. Queste immagini mostrano l'espressione di LH X uno a sinistra e l'espressione di Fox P uno nel pannello centrale in sezioni di una fetta coltivate in un mezzo che supporta la sopravvivenza dissociata delle cellule del motoneurone cranico.

LH X one non è più espresso nei motoneuroni, sebbene vi sia una certa sopravvivenza delle cellule LMC evidenziata dall'espressione di Fox P one. DV rappresenta l'orientamento dell'asse dorso ventrale del midollo spinale e ML rappresenta l'orientamento dell'asse laterale medio della colonna motoria laterale del midollo spinale. Le cellule a divisione laterale, ancora una colorazione per LH X, una nel corno ventrale nel pannello sinistro e la LMC in generale, colorate per Fox P, una nel pannello centrale possono essere osservate in fette, coltivate in terreno contenente il 4% di siero di pollo e 100 nanogrammi per millilitro di CNTF.

Si noti che alcune cellule di divisione laterale della colonna motoria laterale si trovano in posizione laterale nel corno ventrale, come indicato dalla freccia nel pannello di sinistra. Questa immagine mostra lo stato di espressione di LH X one e Fox P one in sezioni di un embrione conservato in OVO durante la coltura a fette dell'embrione precedentemente mostrato. Questo istogramma mostra i risultati della quantificazione della percentuale di cellule di divisione laterale della colonna motoria laterale, che colorano FOX P un positivo e LHX uno positivo rispetto alle cellule della colonna motoria laterale, che colorano FOX P un positivo e LHX uno.

I dati negativi sono mostrati per le cellule trovate in colture a fette in condizioni diverse rispetto agli embrioni di controllo tenuti in ovo, che rappresentano il 100% dei dati sono stati analizzati utilizzando il T-test degli studenti. Il triplo asterisco rappresenta un livello di significatività inferiore a 0,01 durante il tentativo di questo protocollo. È importante prestare attenzione quando si seziona l'embrione e quando si rimuovono gli agro dalle fette perché è importante mantenere l'integrità degli assoni motori nella gemma dell'arto.