Name: Lanalisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Impara una tecnica di microiniezione selettiva per tracciare le fibre uditive nel ganglio acustico di embrioni di pollo. Questo metodo consente di visualizzare le proiezioni centrali con alta risoluzione.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Candace Hsieh per suggerimenti e assistenza con le tecniche di imaging e Dr. Doris Wu consultare esperti di anatomia dell&#39;orecchio interno pulcino durante l&#39;embriogenesi precoce. Questo lavoro è stato sostenuto da NSF IOS-0642346, NIH-DC010775 T32, T32-NIH GM008620, NIH R01-DC010796, e il DOE GAANN P200A120165.

1. Preparare i seguenti strumenti di dissezione e reagenti <ul><li> Fluido cerebrospinale artificiale (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM di HEPES, 10 mM di glucosio, 2 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4) continuo infuso con 95% O 2/5% di CO 2 a temperatura ambiente. Per l&#39;infusione, riempire per 2/3 da 500 ml a bocca larga vaso Nalgene con un foro nel coperchio. Serbatoio sarà collegato mediante la tubazione di un calice gorgogliatore, che penetra la aCSF attraverso il foro nel coperchio vaso. Regolare la pressione per ottenere un flusso costante di bolle che raggiungono circa 1/3 del liquido, ma non sono abbastanza forte da causare spruzzi sul bordo. Submerge 5 ml fiale di vetro (fino a 6) nel vaso Nalgene per separare campioni singoli da loro e dalla turbolenza del flusso di gas. ACSF dovrebbe essere ossigenato per almeno 20 minuti prima di qualsiasi incubazione tessuto. </li><li> Piccolo dissezione piatto in silicone (35 mm x 10mm rivestito Petri utilizzando Sylgard elastomero Kit) con due perni dissezione inseriti in piccolo polistirolo esagonale inferiore (47 mm) peso barca. </li><li> Due fine-tip pinza, una curva punta pinze, da 50 becher ml, e un contenitore per i rifiuti del tessuto. </li><li> Tirato micropipetta di vetro (1,2 OD / 0,9 ID) spezzato a circa 20-50 micron apertura in punta e riempito con rodamina destrano ammina (RDA, MW = 3000, Invitrogen) in una soluzione di 6,25% con 0,4% Triton X-100 in PBS . Collegare con un tubo in bene per picospritzer e stabilizzare a micromanipolatore. </li></ul> 2. Micro-dissezione per svelare Papilla basilare a E8 4,5 <ol><li> Con pinze curve, tagliare E8 embrione appena sotto il tronco cerebrale, mettendo la testa direttamente sulla siliconata piatto dissezione all&#39;interno pesare barca. </li><li> Con perni dissezione, posizionare la testa con una vista ventrale così l&#39;orecchio sul lato di interesse è leggermente visibile, la testa leggermente inclinata dorsalmente e puntando 10-30 gradi di distanza dal center (Figura 2A). Immediatamente fissare la testa con perni. Se bilaterale analisi è desiderato, il centro della testa a 0 gradi, o una visione completa ventrale in modo da entrambi i lati è possibile accedere. Analogamente, per un lato sinistro iniezione, bloccare la testa a -10 a -30 gradi dal centro in modo che il lato sinistro è accessibile. </li><li> Con i 50 becher ml, trasferire 30 ml di aCSF ossigenata nel piatto, sommergendo completamente il tessuto. </li><li> Afferrare con delicatezza e la buccia verso il basso la mascella inferiore con punta fine pinze, quindi rimuovere la palpebra inferiore sul lato di interesse. </li><li> Rimuovere il tessuto vascolare sovrastante, compresa qualsiasi palato rimanente e gola. Questi tessuti molli dovrebbero staccarsi rivelando la superficie liscia di sviluppare chondrocranium con le arterie vertebrali distintivi sulla sua superficie. Da questo punto, la caratteristica massa bianca otoconial dovrebbe essere visibile. </li><li> Sezionare con cura la pelle intorno al meato esterno, cartilagine della mandibola e l&#39;orecchio medio, lasciando il diNER orecchio intatto. Utilizzare le pinze per tagliare delicatamente via queste strutture cartilaginee. </li><li> Rimuovere le arterie vertebrali e una pozza di sangue con un movimento gentile con le punte sottili pinze. Il sangue può oscurare vista e la coagulazione può collegare l&#39;apertura pipetta di iniezione. </li><li> Il condotto cocleare con adiacente epitelio sensoriale (basilare papilla) e ganglio acustico si trova direttamente sotto la chondrocranium 6 e può essere visualizzato come una forma allungata oa forma di dita proiezione si estende dall&#39;orecchio interno ventralmente, con la punta più distale (apice) in prossimità del anteriore linea mediana 5. Ci può essere un raggruppamento di sangue (rosso) dalla dissezione e / o calcificazioni otolitici (bianco) all&#39;apice del condotto cocleare (Figura 2B) che possono aiutare nella visualizzazione. Al vertice è la macula lagenar, una patch sensoriale pensato per essere della funzione vestibolare 7,8. </li></ol> 3. Etichettatura selettiva di CN VIII Fibre uditiva <ol><li&gt; Posizionare la pipetta di iniezione vicino alla superficie dell&#39;embrione nella regione cocleare papilla condotto e basilare. </li><li> Abbassare lentamente la micropipetta per forare prima il cranio. Questa regione cranica è più sottile di aree circostanti e richiede meno forza per penetrare. La micropipetta dovrebbe essere all&#39;interno del canale cocleare. Opzionale: una piccola iniezione di tracciabilità colorante può essere fatto qui per aiutare a visualizzare la papilla basilare. </li><li> Senza il riposizionamento della micropipetta, continuare ad abbassare fino a quando incomincia viola il confine profondo del condotto cocleare (Figura 1). Effettuare un&#39;iniezione qui e ripetere in più regioni lungo la lunghezza della papilla basilare (figure 2C, 2D), escludendo la punta più prossimale in cui si trova il lagena vestibolare. Con il picospritzer impostata tra 10-30 psi, diverse iniezioni sono fatte. Il volume del fluido iniettato colorante varia e dipende dal grado desiderato di etichettatura. Ogni iniezione dovrebbe portare a un colorante fluorescente-laposto Beled di circa 200-400 micron di diametro (Figura 2D). </li><li> Una volta che l&#39;iniezione è terminata, usare il forcipe per transetto il campione al di sopra del tronco cerebrale e utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare la porzione caudale in un piccolo vaso all&#39;interno del contenitore di aCSF continuamente perfuso con il 95% O 2/5% di CO 2. </li><li> Per ciascun embrione, 20-30 min per consentire il trasferimento di colore, a seconda della distanza del centro di traccia desiderata. </li><li> Rimuovere il tessuto e prepararsi per il sezionamento istologico. Nell&#39;esempio qui illustrato, il tessuto viene immerso in paraformaldeide al 4% (in 1X PBS) overnight, saccarosio 30% (in 1X PBS) per una notte. </li></ol> 4. Di contrasto e analisi <ol><li> Di contrasto è utile per contribuire a orientare l&#39;osservatore a localizzazione anatomica, nonché identificare le regioni di particolare interesse. Un contrasto efficace in questa preparazione è immunomarcatura neurofilamenti (figure 1, 3B, 3E), cui L fortementeAbels assoni e permette di demarcazione di tratti assonali nel SNC. </li><li> Analisi deve essere eseguita in tutta la regione etichettata, come le sporgenze possono estendere diverse centinaia di micron o più lungo l&#39;asse rostrocaudale. Alcuni esempi di analisi di base sono: tassi di errore di targeting, i tempi e / o modifiche divergenza di modelli di proiezione. Assoni RDA-etichettati sono visualizzati nel sistema nervoso centrale e periferico ad alta risoluzione (figure 3A, 3D). </li></ol>

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<li>Pflieger, J. F., Cabana, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vestibular+primary+afferents+and+the+vestibulospinal+projections+in+the+developing+and+adult+opossum%2C+Monodelphis+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The vestibular primary afferents and the vestibulospinal projections in the developing and adult opossum, Monodelphis domestica.</a> Anatomy and Embryology. 194, 75-88 (1996).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interesse sono dichiarati.

Studi di sviluppo precoce del nervo VIII sono stati limitati, in parte a causa della difficoltà di identificare assoni embrionali derivanti da più gangli distinti. Diversi studi hanno esplorato i segnali molecolari che guidano uditivo e vestibolare delle cellule sensoriali e destini delle cellule ganglionari durante lo sviluppo iniziale, 5,11,12 ma i processi che regolano innervazione centrale devono ancora essere determinati. Rapporti di proiezioni acustiche cellule gangliari di solito descrivere i processi ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Polistirene Pesare </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-202-101 </td><td></td></tr><tr><td> Petri Dish, 35 X 10 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820644 </td><td> Utilizzare per eseguire la dissezione piatto in silicone </td></tr><tr><td> Sylgard silicone elastomero Kit </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> SYLG184 </td><td> Cappotto Petri di fare piatto dissezione </td></tr><tr><td> Dissezione Pins </td><td> Vario </td><td></td><td> Tiene embrione in atto durante la dissezione </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td></tr><tr><td> Contenitore per aCSF. Suggerisci traslucido bocca larga Nalgene vaso, 500 ml (16 oz) con coperchio. </td><td> CPLabSafety </td><td> QP-PLC-03717 </td><td> Drill foro di apertura nella parte superiore del coperchio per stelo in vetro bubling liquido di penetrare </td></tr><tr><td> Vuoto flaconcino da 5 ml di vetro o comparabili flacone trasparente </td><td> American Pharmaceutical Partners, Inc </td><td> 6332300105 </td><td&gt; Uso durante l&#39;incubazione aCSF mantenere i campioni separati l&#39;uno dall&#39;altro e dal ruscello </td></tr><tr><td> Serbatoio di CarboGen (95% O 2/5% di CO 2) connesso con un tubo di gorgogliatore </td><td> Vario </td><td></td><td> Collegare con un tubo di vetro gorgogliatore staminali per infusione in aCSF </td></tr><tr><td> Calice gorgogliatore </td><td> Vario </td><td></td><td> Per infondere CarboGen in aCSF </td></tr><tr><td> Curvo-punta pinza </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 501008 </td><td> Per rimuovere la testa dell&#39;embrione da uova </td></tr><tr><td> Due fine-tip pinza </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 501985 </td><td> Per micro-dissezione </td></tr><tr><td> 50 ml Beaker </td><td> vario </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rodamina destrano Amine (RDA) </td><td> Invitrogen </td><td> vario </td><td> Tracciante fluorescente assone </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> ICN Biomedicals </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato, (1X PBS) </td><td> Vario </td><td></td><td> Lab reagente standard </td></tr><tr><td> Sottile parete di vetro capillari, 1.2 OD, ID 0,9 4 &quot;(100 mm) Lunghezza </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> TW120F-4 </td><td> Caricare con RDA. Ogni capillare fa due micropipette di vetro </td></tr><tr><td> Ago / Pipettare estrattore </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modello 720 </td><td> Impostazioni usate: Calore 16.4, solenoide 2,2 </td></tr><tr><td> Picospritzer </td><td> Parker Instrumentation </td><td> vario </td><td> Collegare con un tubo sottile al vetro micropipetta </td></tr><tr><td> Micromanipolatore </td><td> Narishige </td><td> vario </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a dissezione con fluorescenza </td><td> Vario </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> Paraformaldeide al 4% </td><td> Vario </td><td></td><td> Lab reagente standard </td></tr><tr><td> anticorpo anti-Neurofilament, opzionale </td><td> Millipore </td><td> AB1991 </td><td> Seguire il protocollo istologico raccomandato dal produttore </td></tr><tr><td> Criostato e materiali associati per sezionamento </td><td> Leica </td><td> vario </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio epifluorescente per l&#39;imaging </td><td> Zeiss, varie </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria nerve embryonic vestibolococleare

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Il pulcino embrionale è un modello ampiamente utilizzato per lo studio delle proiezioni gangliari periferiche e centrali cellulari. Nel sistema uditivo, etichettatura selettiva degli assoni uditivi all&#39;interno del nervo cranico VIII aumenterebbe lo studio dello sviluppo del circuito uditivo centrale. Questo approccio è impegnativo, perché di vari organi sensoriali dell&#39;orecchio interno contribuiscono al nervo VIII 1. Inoltre, marcatori che distinguono affidabile uditivo rispetto vestibolari gruppi di assoni all&#39;interno del nervo VIII aviaria devono ancora essere identificati. Vie uditive e vestibolari non si distinguono funzionalmente in embrioni precoci, come-sensoriali evocate risposte non sono presenti prima che i circuiti sono formati. Centrale sporgenti assoni dei nervi dell&#39;VIII sono stati rintracciati in alcuni studi, ma uditivo etichettatura assone è stata accompagnata da etichettare dagli altri componenti del nervo dell&#39;VIII 2,3. Qui, descriviamo un metodo per l&#39;analisi anterograda dal ganglio acustico in modo selettivo labeassoni uditive l all&#39;interno del nervo VIII in via di sviluppo. In primo luogo, dopo la dissezione parziale della regione anteriore cefalica di un 8 giorni di embrione di pollo immerso nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato, il condotto cocleare è identificato da punti di repere anatomici. Successivamente, una micropipetta di vetro sottile tirato è posizionata per iniettare una piccola quantità di rodamina destrano ammina nella regione di canale e adiacente profonda in cui si trovano le cellule gangliari acustici. Entro trenta minuti dopo l&#39;iniezione, assoni uditive sono tracciate a livello centrale nel cervello posteriore e possono poi essere visualizzati a seguito della preparazione istologica. Questo metodo fornisce un utile strumento per gli studi di sviluppo della periferica alla formazione circuito centrale uditivo.

I componenti del nervo VIII e l&#39;anatomia del nervo stesso sono complessi e contorti (figure 1, 3). Selettivamente rintracciamento fibre derivanti da cellule gangliari acustici, segmenti del nervo VIII nonché uditive afferenti primari all&#39;interno del tronco può essere pulito tracciata e distinti dalle loro controparti vestibolari (figure 2, 3). Analogamente, questa tecnica può essere usata per studiare sporgenze periferiche delle cellule gangliari acustiche (figura 3G),</...

Qui si descrive una tecnica di microdissezione seguito da iniezione di colorante fluorescente nel ganglio acustico di embrioni di pollo primi selettiva per rintracciare uditive fibre assoni nel nervo e rombencefalo.

L&#39;analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Lo scopo di questa procedura è tracciare selettivamente le fibre uditive dal sistema nervoso periferico al sistema nervoso centrale in un embrione. Ciò si ottiene innanzitutto eseguendo una sezione microdose per esporre il cranio cartilagineo ventrale e identificare il dotto cocleare aviario. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire un'iniezione microscopica nelle cellule del ganglio acustico sottostante e nei loro assoni.Successivamente, il campione viene incubato in un liquido cerebrospinale artificiale ossigenato per 20 minuti per consentire il trasferimento del DIA. Infine, una preparazione istologica e la sezionatura del tessuto permettono la visualizzazione microscopica delle proiezioni centrali del ganglio acustico. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consistono nella possibilità di effettuare un tracciamento selettivo del nervo ottavo.Le fibre uditive ad alta risoluzione permettono un rapido trasferimento del colorante in tessuto vivo e consentono esperimenti in una fase precoce dello sviluppo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sull'udito. Ad esempio, quali sono le molecole che guidano l

selective-tracing-auditory-fibers-avian-embryonic-vestibulocochlear

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Neuroscienze

Whole-cell patch-clamp registrazioni da dendriti delle fibre nervose uditivo interno alla sinapsi nastro capelli cellule nella coclea di mammifero.

Registrazioni postsinaptica a dendriti afferenti contattare cocleari cellule ciliate interne: Release multivescicolari monitoraggio a Synapse Ribbon

Questo video mostra il processo di preparazione di fette di cervello a forma di cuneo in un ambiente di laboratorio. Utilizzando un vibratomo, viene realizzata una fetta a forma di cuneo del cervello di un topo con spessore variabile. Questa fetta contiene la radice nervosa uditiva posizionata all'estremità più spessa, mentre i neuroni relativi all'udito si trovano all'estremità più sottile.

Preparazione di fette di cervello a cuneo per visualizzare i neuroni uditivi

Come le reti neuronali sono stabiliti nel cervello embrionale è una questione fondamentale nella neurobiologia dello sviluppo. Qui abbiamo combinato una tecnica di elettroporazione con nuovi strumenti genetici, come ad esempio Cre / Lox-plasmidi e PiggyBac-mediata sistema trasposizione del DNA nel romboencefalo aviaria di etichettare interneuroni dorsali e monitorare le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche a vari stadi di sviluppo.

Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

Presentiamo un metodo che descrive l'isolamento e la coltura di espianti cocleari dall'orecchio interno di topo embrionale.  Dimostriamo anche un metodo per il trasferimento genico in espianti cocleari tramite elettroporazione a onda quadra. La coltura di espianti in vitro abbinata alla tecnica di trasferimento genico consente ai ricercatori di studiare gli effetti dell'alterazione dell'espressione genica durante lo sviluppo.

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

L'organo uditivo media l'udito. Qui presentiamo un metodo di micro-elettroporazione in ovo modificato ottimizzato per lo studio della proliferazione e della differenziazione delle cellule progenitrici uditive nell'organo uditivo del pollo in via di sviluppo.

Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elettroporazione

I neuroni uditivi uditivi degli aviani e dei mammiferi sono specializzati per la codifica neuronale veloce, un processo fondamentale per le normali funzioni uditive. Questi neuroni nascono da precursori distinti dell'indietro embrionale. Presentiamo tecniche che utilizzano elettroporazione per esprimere i geni nell'hindbrain degli embrioni di pollo per studiare la funzione genica durante lo sviluppo uditivo.

In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo

Qui presentiamo un protocollo per ottenere fette uditive non coronali del tronco cerebrale dell'embrione di pollo per lo studio delle proprietà tonotopiche e delle traiettorie di sviluppo all'interno di una fetta del tronco cerebrale. Queste sezioni includono sezioni sagittali, orizzontali e orizzontali/trasversali che comprendono regioni tonotopiche più grandi all'interno di un singolo piano di fette rispetto alle sezioni coronali tradizionali.

Affettare il tronco cerebrale uditivo embrionale del pollo per valutare gradienti tonotopici e microcircuiti

Abbiamo usato tecniche standard di risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) e le abbiamo applicate ai polli da cova, un modello aviario precoce per la funzione uditiva. Il protocollo delinea in dettaglio le tecniche di preparazione degli animali e di acquisizione ABR, con passaggi che potrebbero tradursi in altri modelli aviari o roditori.

Valutazione della risposta uditiva del tronco cerebrale nei cuccioli di pollo

Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell'orecchio interno aviario.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

Utilizzando l'elettroporazione in ovo , abbiamo ideato un metodo per trasfettare selettivamente l'orecchio interno uditivo e il nucleo cocleare negli embrioni di pollo per ottenere un knockdown specifico del gruppo cellulare della proteina di ritardo mentale X fragile durante periodi discreti di assemblaggio del circuito.

Dissezione della funzione autonoma delle cellule della proteina del ritardo mentale dell'X fragile in un circuito uditivo mediante elettroporazione in ovo

Di seguito sono presentati metodi che forniscono istruzioni dettagliate per la dissezione, la dissociazione, la coltura e la registrazione di patch-clamp dai neuroni gangliari vestibolari e gangliari a spirale dell'orecchio interno.

Isolare e coltivare i somata gangliari vestibolari e spirali da roditori neonatali per registrazioni con patch-clamp

Impara una tecnica di microiniezione selettiva per tracciare le fibre uditive nel ganglio acustico di embrioni di pollo. Questo metodo consente di visualizzare le proiezioni centrali con alta risoluzione.

L'analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare

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