Name: Lanalisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Impara una tecnica di microiniezione selettiva per tracciare le fibre uditive nel ganglio acustico di embrioni di pollo. Questo metodo consente di visualizzare le proiezioni centrali con alta risoluzione.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Candace Hsieh per suggerimenti e assistenza con le tecniche di imaging e Dr. Doris Wu consultare esperti di anatomia dell&#39;orecchio interno pulcino durante l&#39;embriogenesi precoce. Questo lavoro è stato sostenuto da NSF IOS-0642346, NIH-DC010775 T32, T32-NIH GM008620, NIH R01-DC010796, e il DOE GAANN P200A120165.

1. Preparare i seguenti strumenti di dissezione e reagenti <ul><li> Fluido cerebrospinale artificiale (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM di HEPES, 10 mM di glucosio, 2 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4) continuo infuso con 95% O 2/5% di CO 2 a temperatura ambiente. Per l&#39;infusione, riempire per 2/3 da 500 ml a bocca larga vaso Nalgene con un foro nel coperchio. Serbatoio sarà collegato mediante la tubazione di un calice gorgogliatore, che penetra la aCSF attraverso il foro nel coperchio vaso. Regolare la pressione per ottenere un flusso costante di bolle che raggiungono circa 1/3 del liquido, ma non sono abbastanza forte da causare spruzzi sul bordo. Submerge 5 ml fiale di vetro (fino a 6) nel vaso Nalgene per separare campioni singoli da loro e dalla turbolenza del flusso di gas. ACSF dovrebbe essere ossigenato per almeno 20 minuti prima di qualsiasi incubazione tessuto. </li><li> Piccolo dissezione piatto in silicone (35 mm x 10mm rivestito Petri utilizzando Sylgard elastomero Kit) con due perni dissezione inseriti in piccolo polistirolo esagonale inferiore (47 mm) peso barca. </li><li> Due fine-tip pinza, una curva punta pinze, da 50 becher ml, e un contenitore per i rifiuti del tessuto. </li><li> Tirato micropipetta di vetro (1,2 OD / 0,9 ID) spezzato a circa 20-50 micron apertura in punta e riempito con rodamina destrano ammina (RDA, MW = 3000, Invitrogen) in una soluzione di 6,25% con 0,4% Triton X-100 in PBS . Collegare con un tubo in bene per picospritzer e stabilizzare a micromanipolatore. </li></ul> 2. Micro-dissezione per svelare Papilla basilare a E8 4,5 <ol><li> Con pinze curve, tagliare E8 embrione appena sotto il tronco cerebrale, mettendo la testa direttamente sulla siliconata piatto dissezione all&#39;interno pesare barca. </li><li> Con perni dissezione, posizionare la testa con una vista ventrale così l&#39;orecchio sul lato di interesse è leggermente visibile, la testa leggermente inclinata dorsalmente e puntando 10-30 gradi di distanza dal center (Figura 2A). Immediatamente fissare la testa con perni. Se bilaterale analisi è desiderato, il centro della testa a 0 gradi, o una visione completa ventrale in modo da entrambi i lati è possibile accedere. Analogamente, per un lato sinistro iniezione, bloccare la testa a -10 a -30 gradi dal centro in modo che il lato sinistro è accessibile. </li><li> Con i 50 becher ml, trasferire 30 ml di aCSF ossigenata nel piatto, sommergendo completamente il tessuto. </li><li> Afferrare con delicatezza e la buccia verso il basso la mascella inferiore con punta fine pinze, quindi rimuovere la palpebra inferiore sul lato di interesse. </li><li> Rimuovere il tessuto vascolare sovrastante, compresa qualsiasi palato rimanente e gola. Questi tessuti molli dovrebbero staccarsi rivelando la superficie liscia di sviluppare chondrocranium con le arterie vertebrali distintivi sulla sua superficie. Da questo punto, la caratteristica massa bianca otoconial dovrebbe essere visibile. </li><li> Sezionare con cura la pelle intorno al meato esterno, cartilagine della mandibola e l&#39;orecchio medio, lasciando il diNER orecchio intatto. Utilizzare le pinze per tagliare delicatamente via queste strutture cartilaginee. </li><li> Rimuovere le arterie vertebrali e una pozza di sangue con un movimento gentile con le punte sottili pinze. Il sangue può oscurare vista e la coagulazione può collegare l&#39;apertura pipetta di iniezione. </li><li> Il condotto cocleare con adiacente epitelio sensoriale (basilare papilla) e ganglio acustico si trova direttamente sotto la chondrocranium 6 e può essere visualizzato come una forma allungata oa forma di dita proiezione si estende dall&#39;orecchio interno ventralmente, con la punta più distale (apice) in prossimità del anteriore linea mediana 5. Ci può essere un raggruppamento di sangue (rosso) dalla dissezione e / o calcificazioni otolitici (bianco) all&#39;apice del condotto cocleare (Figura 2B) che possono aiutare nella visualizzazione. Al vertice è la macula lagenar, una patch sensoriale pensato per essere della funzione vestibolare 7,8. </li></ol> 3. Etichettatura selettiva di CN VIII Fibre uditiva <ol><li&gt; Posizionare la pipetta di iniezione vicino alla superficie dell&#39;embrione nella regione cocleare papilla condotto e basilare. </li><li> Abbassare lentamente la micropipetta per forare prima il cranio. Questa regione cranica è più sottile di aree circostanti e richiede meno forza per penetrare. La micropipetta dovrebbe essere all&#39;interno del canale cocleare. Opzionale: una piccola iniezione di tracciabilità colorante può essere fatto qui per aiutare a visualizzare la papilla basilare. </li><li> Senza il riposizionamento della micropipetta, continuare ad abbassare fino a quando incomincia viola il confine profondo del condotto cocleare (Figura 1). Effettuare un&#39;iniezione qui e ripetere in più regioni lungo la lunghezza della papilla basilare (figure 2C, 2D), escludendo la punta più prossimale in cui si trova il lagena vestibolare. Con il picospritzer impostata tra 10-30 psi, diverse iniezioni sono fatte. Il volume del fluido iniettato colorante varia e dipende dal grado desiderato di etichettatura. Ogni iniezione dovrebbe portare a un colorante fluorescente-laposto Beled di circa 200-400 micron di diametro (Figura 2D). </li><li> Una volta che l&#39;iniezione è terminata, usare il forcipe per transetto il campione al di sopra del tronco cerebrale e utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare la porzione caudale in un piccolo vaso all&#39;interno del contenitore di aCSF continuamente perfuso con il 95% O 2/5% di CO 2. </li><li> Per ciascun embrione, 20-30 min per consentire il trasferimento di colore, a seconda della distanza del centro di traccia desiderata. </li><li> Rimuovere il tessuto e prepararsi per il sezionamento istologico. Nell&#39;esempio qui illustrato, il tessuto viene immerso in paraformaldeide al 4% (in 1X PBS) overnight, saccarosio 30% (in 1X PBS) per una notte. </li></ol> 4. Di contrasto e analisi <ol><li> Di contrasto è utile per contribuire a orientare l&#39;osservatore a localizzazione anatomica, nonché identificare le regioni di particolare interesse. Un contrasto efficace in questa preparazione è immunomarcatura neurofilamenti (figure 1, 3B, 3E), cui L fortementeAbels assoni e permette di demarcazione di tratti assonali nel SNC. </li><li> Analisi deve essere eseguita in tutta la regione etichettata, come le sporgenze possono estendere diverse centinaia di micron o più lungo l&#39;asse rostrocaudale. Alcuni esempi di analisi di base sono: tassi di errore di targeting, i tempi e / o modifiche divergenza di modelli di proiezione. Assoni RDA-etichettati sono visualizzati nel sistema nervoso centrale e periferico ad alta risoluzione (figure 3A, 3D). </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interesse sono dichiarati.

Studi di sviluppo precoce del nervo VIII sono stati limitati, in parte a causa della difficoltà di identificare assoni embrionali derivanti da più gangli distinti. Diversi studi hanno esplorato i segnali molecolari che guidano uditivo e vestibolare delle cellule sensoriali e destini delle cellule ganglionari durante lo sviluppo iniziale, 5,11,12 ma i processi che regolano innervazione centrale devono ancora essere determinati. Rapporti di proiezioni acustiche cellule gangliari di solito descrivere i processi ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Polistirene Pesare </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-202-101 </td><td></td></tr><tr><td> Petri Dish, 35 X 10 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820644 </td><td> Utilizzare per eseguire la dissezione piatto in silicone </td></tr><tr><td> Sylgard silicone elastomero Kit </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> SYLG184 </td><td> Cappotto Petri di fare piatto dissezione </td></tr><tr><td> Dissezione Pins </td><td> Vario </td><td></td><td> Tiene embrione in atto durante la dissezione </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td&gt; </tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> Vario </td><td></td><td> parte della ricetta aCSF </td></tr><tr><td> Contenitore per aCSF. Suggerisci traslucido bocca larga Nalgene vaso, 500 ml (16 oz) con coperchio. </td><td> CPLabSafety </td><td> QP-PLC-03717 </td><td> Drill foro di apertura nella parte superiore del coperchio per stelo in vetro bubling liquido di penetrare </td></tr><tr><td> Vuoto flaconcino da 5 ml di vetro o comparabili flacone trasparente </td><td> American Pharmaceutical Partners, Inc </td><td> 6332300105 </td><td&gt; Uso durante l&#39;incubazione aCSF mantenere i campioni separati l&#39;uno dall&#39;altro e dal ruscello </td></tr><tr><td> Serbatoio di CarboGen (95% O 2/5% di CO 2) connesso con un tubo di gorgogliatore </td><td> Vario </td><td></td><td> Collegare con un tubo di vetro gorgogliatore staminali per infusione in aCSF </td></tr><tr><td> Calice gorgogliatore </td><td> Vario </td><td></td><td> Per infondere CarboGen in aCSF </td></tr><tr><td> Curvo-punta pinza </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 501008 </td><td> Per rimuovere la testa dell&#39;embrione da uova </td></tr><tr><td> Due fine-tip pinza </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 501985 </td><td> Per micro-dissezione </td></tr><tr><td> 50 ml Beaker </td><td> vario </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rodamina destrano Amine (RDA) </td><td> Invitrogen </td><td> vario </td><td> Tracciante fluorescente assone </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> ICN Biomedicals </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato, (1X PBS) </td><td> Vario </td><td></td><td> Lab reagente standard </td></tr><tr><td> Sottile parete di vetro capillari, 1.2 OD, ID 0,9 4 &quot;(100 mm) Lunghezza </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> TW120F-4 </td><td> Caricare con RDA. Ogni capillare fa due micropipette di vetro </td></tr><tr><td> Ago / Pipettare estrattore </td><td> David Kopf Instruments </td><td> Modello 720 </td><td> Impostazioni usate: Calore 16.4, solenoide 2,2 </td></tr><tr><td> Picospritzer </td><td> Parker Instrumentation </td><td> vario </td><td> Collegare con un tubo sottile al vetro micropipetta </td></tr><tr><td> Micromanipolatore </td><td> Narishige </td><td> vario </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a dissezione con fluorescenza </td><td> Vario </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> Paraformaldeide al 4% </td><td> Vario </td><td></td><td> Lab reagente standard </td></tr><tr><td> anticorpo anti-Neurofilament, opzionale </td><td> Millipore </td><td> AB1991 </td><td> Seguire il protocollo istologico raccomandato dal produttore </td></tr><tr><td> Criostato e materiali associati per sezionamento </td><td> Leica </td><td> vario </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio epifluorescente per l&#39;imaging </td><td> Zeiss, varie </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria nerve embryonic vestibolococleare

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Il pulcino embrionale è un modello ampiamente utilizzato per lo studio delle proiezioni gangliari periferiche e centrali cellulari. Nel sistema uditivo, etichettatura selettiva degli assoni uditivi all&#39;interno del nervo cranico VIII aumenterebbe lo studio dello sviluppo del circuito uditivo centrale. Questo approccio è impegnativo, perché di vari organi sensoriali dell&#39;orecchio interno contribuiscono al nervo VIII 1. Inoltre, marcatori che distinguono affidabile uditivo rispetto vestibolari gruppi di assoni all&#39;interno del nervo VIII aviaria devono ancora essere identificati. Vie uditive e vestibolari non si distinguono funzionalmente in embrioni precoci, come-sensoriali evocate risposte non sono presenti prima che i circuiti sono formati. Centrale sporgenti assoni dei nervi dell&#39;VIII sono stati rintracciati in alcuni studi, ma uditivo etichettatura assone è stata accompagnata da etichettare dagli altri componenti del nervo dell&#39;VIII 2,3. Qui, descriviamo un metodo per l&#39;analisi anterograda dal ganglio acustico in modo selettivo labeassoni uditive l all&#39;interno del nervo VIII in via di sviluppo. In primo luogo, dopo la dissezione parziale della regione anteriore cefalica di un 8 giorni di embrione di pollo immerso nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato, il condotto cocleare è identificato da punti di repere anatomici. Successivamente, una micropipetta di vetro sottile tirato è posizionata per iniettare una piccola quantità di rodamina destrano ammina nella regione di canale e adiacente profonda in cui si trovano le cellule gangliari acustici. Entro trenta minuti dopo l&#39;iniezione, assoni uditive sono tracciate a livello centrale nel cervello posteriore e possono poi essere visualizzati a seguito della preparazione istologica. Questo metodo fornisce un utile strumento per gli studi di sviluppo della periferica alla formazione circuito centrale uditivo.

I componenti del nervo VIII e l&#39;anatomia del nervo stesso sono complessi e contorti (figure 1, 3). Selettivamente rintracciamento fibre derivanti da cellule gangliari acustici, segmenti del nervo VIII nonché uditive afferenti primari all&#39;interno del tronco può essere pulito tracciata e distinti dalle loro controparti vestibolari (figure 2, 3). Analogamente, questa tecnica può essere usata per studiare sporgenze periferiche delle cellule gangliari acustiche (figura 3G),</...

Qui si descrive una tecnica di microdissezione seguito da iniezione di colorante fluorescente nel ganglio acustico di embrioni di pollo primi selettiva per rintracciare uditive fibre assoni nel nervo e rombencefalo.

L&#39;analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Lo scopo di questa procedura è tracciare selettivamente le fibre uditive dal sistema nervoso periferico al sistema nervoso centrale in un embrione. Ciò si ottiene innanzitutto eseguendo una sezione microdose per esporre il cranio cartilagineo ventrale e identificare il dotto cocleare aviario. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire un'iniezione microscopica nelle cellule del ganglio acustico sottostante e nei loro assoni.Successivamente, il campione viene incubato in un liquido cerebrospinale artificiale ossigenato per 20 minuti per consentire il trasferimento del DIA. Infine, una preparazione istologica e la sezionatura del tessuto permettono la visualizzazione microscopica delle proiezioni centrali del ganglio acustico. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consistono nella possibilità di effettuare un tracciamento selettivo del nervo ottavo.Le fibre uditive ad alta risoluzione permettono un rapido trasferimento del colorante in tessuto vivo e consentono esperimenti in una fase precoce dello sviluppo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della ricerca sull'udito. Ad esempio, quali sono le molecole che guidano l'assone verso le sue destinazioni centrali?O come risponde il circuito a un'influenza o a un'esposizione ototossica? Per prima cosa, aggiungere del liquido cerebrospinale artificiale in un barattolo Nalgene da 500 millilitri con bocca larga fino a riempirlo per due terzi. Rimettere il coperchio, che presenta un foro praticato, sul barattolo.Inserire un diffusore di gas collegato a una bombola di ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5% attraverso il foro nel coperchio e all’interno del liquido CSF. Accendere il gas e regolare la pressione in modo da ottenere un flusso costante di bollicine che raggiungano circa un terzo del livello del liquido, senza essere troppo intensi da causare schizzi oltre il bordo. Immergere fino a sei vial di vetro da cinque millilitri all’interno del contenitore per separare i singoli campioni l’uno dall’altro.E dalla turbolenza del flusso di gas. Lasciare ossigenare l'ACSF per almeno 20 minuti; mentre l'ACSF si ossigena, preparare le micropipette di vetro eseguendo il retrocaricamento della micropipetta con una soluzione al 6,25% di rodina Dexter e una soluzione immunitaria in PBS contenente 0,4% di Triton XX. Collegare la micropipetta al micromanipolatore e rompere la punta con pinzette fini per creare un'apertura compresa tra 20 e 50 micron. Utilizzare un tubicino sottile per collegare il micromanipolatore stabilizzato allo spruzzatore picospritzer.Impostare il pico spritzer tra 10 e 30 PSI per iniziare a completare il resto della configurazione. Assicurarsi che ci sia una piccola capsula di Petri in silicone con due spilli da dissezione posizionati in modo esagonale. Prendere due pinzette a punta fine.Pinze con punta curva, un becher da 50 millilitri e un contenitore per i rifiuti di tessuto nell'area di dissezione. Dopo aver rimosso l'embrione di pollo dall'uovo, posizionare la testa sulla piastra di dissezione rivestita di silicone. Nella barchetta di vetro, posizionare la testa con una vista ventrale in modo che l'orecchio sul lato di interesse, in questo caso il lato destro, sia visibile.Una volta nella posizione corretta, stabilizzare il tessuto con spilli da dissezione, evitando la regione del cervelletto. Utilizzare il becher da 50 millilitri per trasferire 30 millilitri di A CSF ossigenata nella piastra, immergendo completamente il tessuto. Quindi usare pinzette a punta fine per afferrare delicatamente e staccare la mandibola inferiore.Quindi rimuovere la palpebra inferiore dal lato di interesse. Successivamente, rimuovere i tessuti vascolari e molli sovrastanti, inclusi i resti del palato e dell'esofago. Una volta rimossi questi tessuti, dovrebbe apparire la superficie liscia del cranio ventrale e le arterie vertebrali distintive.Dissezionare con attenzione la pelle intorno al mito esterno fino alla cartilagine dell'articolazione della mascella e dell'orecchio medio, lasciando intatto l'orecchio interno. Utilizzare la pinzetta per tagliare delicatamente le strutture cartilaginee della mascella e dell'orecchio medio. Usare ora un movimento morbido e ampio con le punte della pinzetta fine per rimuovere le arterie vertebrali e il sangue accumulato.Questo è importante perché il sangue può ostacolare la vista e la coagulazione potrebbe ostruire l'apertura della pipetta di iniezione. A questo punto, dovrebbe essere visibile la caratteristica massa bianca del tialo. La freccia in questa figura indica il dotto cocleare con l'epitelio sensoriale adiacente e il ganglio acustico.Si trova direttamente al di sotto del cranio cartilagineo e, come mostrato qui, può essere visualizzato come una proiezione allungata di forma simile a un dito che si estende ventralmente dall'orecchio interno, con l'apice vicino alla linea mediana anteriore, per etichettare le fibre uditive. Posizionare innanzitutto la pipetta di iniezione vicino alla superficie embrionale del dotto cocleare e nella regione della cresta papillare, quindi abbassare lentamente la micropipetta fino a perforare per prima cosa il cranio. Questa zona del cranio è più sottile rispetto alle aree circostanti e richiede una forza minore per essere penetrata.La micropipetta dovrebbe ora trovarsi all'interno del dotto cocleare. Se necessario, è possibile effettuare una piccola iniezione di colorante tracciante qui per facilitare la visualizzazione della base dei pilastri; senza riposizionare la micropipetta, continuare ad abbassarla fino a quando non supera appena il margine profondo del dotto cocleare.Questa immagine mostra la posizione ideale della pipetta nella regione appropriata del ganglio acustico. Eseguire un'iniezione in questo punto e quindi ripetere in più regioni lungo l'estensione della papilla basale, a seconda dell'estensione della marcatura desiderata e escludendo la punta più prossimale dove si trova il legamento vestibolare.Con il pico spritzer impostato tra 10 e 30 PSI, ogni iniezione dovrebbe produrre un punto fluorescente marcato con DIA di circa 200-400 micron di diametro, come mostrato qui. Al termine dell'iniezione, utilizzare una pinzetta per sezionare il campione sopra il bulbo rachidiano come illustrato qui, quindi utilizzare una pipetta di trasferimento per posizionare la porzione midollare in uno dei piccoli barattoli all'interno del contenitore di perfusione. Un CSF.Per ogni embrione, prevedere da 20 a 30 minuti per il trasferimento del colorante, a seconda della distanza del tracciamento centrale desiderata. Trascorso il tempo di incubazione, rimuovere il tessuto e prepararlo per la sezione istologica. In questo caso, il tessuto viene immerso in paraformaldeide al 4% in PBS 1X per tutta la notte, seguito successivamente da una disidratazione notturna in soluzione di saccarosio al 30% in PBS 1X.Dopo che il tessuto è stato equilibrato durante la notte in saccarosio al 30%, viene sezionato in senso coronale mediante crio-microtomia. Dopo la sezione, l'etichettatura immunoistochimica con anticorpi appropriati può orientare l'osservatore rispetto alla localizzazione anatomica e identificare specifiche regioni di interesse. Questa immagine mostra la vista coronale del tronco encefalico di un embrione di sei giorni con gangli acustici bilaterali integri.La pipetta rossa schematizzata illustra il targeting accurato delle cellule del ganglio acustico a partire da un punto di ingresso dorsolaterale. Le sezioni sono immunoetichettate con anti-neurofilamento per evidenziare le proiezioni assonali. Gli organi vestibolari si trovano in posizione rostrale rispetto alla sezione mostrata.Il nervo vestibolococleare è etichettato così come il ganglio acustico e il ganglio vestibolare. Il lato dorsale è rivolto verso l'alto; la barra della scala corrisponde a 300 micron. Di seguito sono riportate immagini rappresentative a basso e alto ingrandimento del tracciamento selettivo delle fibre uditive in un embrione di E otto da 25 micron.Sezioni coronali prelevate dallo stesso embrione corrispondono a piani diversi, come mostrato qui. Gli assoni marcati con RDA possono essere tracciati dal sito di iniezione indicato dalla testa di freccia, attraverso il nervo cranico indicato dalla freccia, fino ai nuclei uditivi primari bersaglio indicati dalla doppia testa di freccia; la barra della scala corrisponde a 300 micron. La marcatura immunologica con anticorpo anti-neurofilamento evidenzia tutte le proiezioni assonali e le fibre marcate con RDA dell'immagine precedente si trovano all'interno del tragitto della proiezione uditiva.AP e VP indicano rispettivamente i componenti uditivo e vestibolare periferici rispetto al punto di entrata del nervo. L'immagine a colori sovrapposta mostra come gli assoni marcati con RDA si inseriscano nell'anatomia locale. Un'immagine ad alto ingrandimento dello stesso embrione in una posizione più caudale dimostra l'elevata risoluzione delle fibre nel punto di entrata del nervo, indicato da una freccia, e lungo il tragitto centrale, indicato da una doppia punta di freccia.La colorazione dei neurofilamenti di tutti gli assoni permette di delimitare il P-N-S-C-N-S, nonché le proiezioni uditive e vestibolari presunte. Ancora una volta, AP e VP indicano rispettivamente i componenti uditivo e vestibolare periferici rispetto al punto di ingresso del nervo, mentre AC e VC indicano rispettivamente le proiezioni uditiva e vestibolare centrali rispetto al punto di ingresso del nervo. Ancora una volta, la sovrapposizione di canali separati è mostrata come fusione cromatica.L'esame istologico del ganglio acustico rivela la posizione delle cellule del ganglio acustico marcate in seguito al tracciamento precedente e le loro proiezioni periferiche indicate dall'asterisco, un tracciamento retrogradamente esteso alla papilla basilare. Qui AG indica il ganglio acustico, bp la papilla basilare e lm la macula lagenare. La barra della scala corrisponde a 100 micron.Infine, questa illustrazione mostra un tracciato di 700 micron previsto con etichettatura specifica del VIII nervo uditivo all'E8. Il sito di iniezione, indicato dal cerchio rosso, è situato in posizione cordale rispetto al punto di entrata del nervo e le proiezioni centrali procedono in direzione rostrale e quarto-laterale. Una volta nel rombencefalo, qui, la barra della scala corrisponde a 300 micron.Nel tentativo di eseguire questa procedura, adattate le vostre iniezioni in modo da soddisfare al meglio i criteri di analisi. E ricordate che vi sarà una certa variabilità nel numero esatto e nella posizione degli assoni traccia tra i campioni.

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