Name: Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Impara la microdissezione laser per isolare neuroni ippocampali da sezioni congelate di cervello di ratto dopo trauma cranico. Questa tecnica consente analisi dell'espressione genica in popolazioni cellulari specifiche.

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Questo lavoro è finanziato da R01 NS052532 (a HLH), la Fondazione Moody, e il Dipartimento di Anestesiologia. Ringraziamo Laurie Bolding, Christine Courteau Butler e Christy Perry per la loro assistenza editoriale, e Christy Perry per il layout e la produzione eccellente di tutte le tabelle, figure e opere d&#39;arte.

1. Procedure chirurgiche e Percussioni Fluid TBI <ol><li> Tutti gli esperimenti sugli animali vengono prima approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas e il National Institutes of Health Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (8 ° Edizione, Consiglio Nazionale delle Ricerche). </li><li> I ratti (maschi adulti Sprague-Dawley, 400-500 gr ottenuto dal fornitore Rivers Charles, Portland, Maine) sono alloggiati due per gabbia e ha fornito cibo e acqua ad libitum in un vivaio con queste condizioni costanti: ciclo di luce (600 ore a 1.800 hr), temperatura (21 ° C a 23 ° C) e umidità (40% al 50%) una settimana prima dell&#39;uso. </li><li> Anestetizzare ratti con il 4% isoflurano, intubate, e meccanicamente ventilare (NEMI scientifico, New England Medical Instruments, Medway, MA) i ratti con 1,5-2,0% isoflurano in ossigeno: aria (70:30) e li prepara per parasagittale fluido percussioni lesioni, come precedentemente descritto. 8, 10 </li><li> Sacrificare ratti al punto di tempo appropriato dopo lesione seconda del disegno sperimentale. Rimuovere rapidamente il cervello, congelare immediatamente in ghiaccio secco, e conservare a -80 ° C in un tubo da 50 ml o procedere immediatamente da incorporare nel PTOM per sezionamento congelati. </li></ol> 2. Sezionamento e colorazione di cervello di ratto <ol><li> Tessuto cerebrale che non viene utilizzato immediatamente possono essere conservati a -80 ° C fino ad un mese se mantenuta ad una temperatura costante. I cervelli che vengono congelati a -80 ° C, poi scongelati a -20 ° C per il sezionamento, e poi ri-congelati non danno RNA di qualità dopo lo scongelamento secondo. Una volta che il cervello è scongelato, montato in OCT e sezionata, vetrini devono essere colorati entro 24 ore e utilizzati per LCM entro 30 minuti ad un&#39;ora di colorazione. Ciò garantirà RNA di buona qualità. A seguito di LCM, cellule catturate su tappi LCM possono essere memorizzati in un tampone di lisi a -80 ° C per un massimo di una settimana, ma l&#39;RNA devono essere isolati in modo tempestivo per garantire la massima qualità. &lt;/ Li&gt; <li> Prima di sezionare il cervello, pulire il criostato con RNasi-Zap e pulire le spazzole con EtOH (sostituire la lama usa e getta tra ogni cervello). </li><li> Recuperare il cervello nel tubo 50 ml dal congelatore a -80 ° C; posizionarlo nel criostato ad una temperatura di -22 ° C e scongelare nel tubo per circa 10 min. Rimuovere il cervello dal tubo e il luogo sul palco su garza, lato ventrale in alto. </li><li> Usando una lama di rasoio, la fetta di cervello per rimuovere la parte posteriore del cervello appena rostrale al cervelletto e la porzione anteriore al chiasma ottico. Riempire un cryomold con il mezzo di montaggio ottobre (Tissue Tek), e inserire il cervello nello stampo con la parte anteriore verso il basso. Lasciare che il tessuto cerebrale di congelare nel liquido di montaggio fino a che non diventa bianco (circa 10 min). </li><li> Congelare il disco di preparato (Tissue Tek) sul cervello con ottobre Rimuovere il cervello dallo stampo. Inserire il cervello nella testa del preparato e serrare le viti. </li><li> Inserire un Disposabile, lama a basso profilo (Fisher Scientific) nel porta-lama e serrare la leva verso il basso. </li><li> Iniziare il taglio del cervello a 20 micron per rimuovere lo strato esterno di ottobre Una volta che la regione ippocampale è raggiunta, posizionare il selettore a 10 micron. Raccogliere coronali sezioni seriali mettendo un vetrino o plus-vetrini sulla sezione di tessuto (Fisher Scientific). Vetrini vengono conservati a -20 ° C in un RNase-free cremagliera colorazione fino sezionamento è completa. </li><li> Per rimuovere tutte le RNasi dal vetro in cui sono trattati sezioni di tessuto, pulire tutti i contenitori di colorazione e cilindri graduati con ELIMINase (Fisher Scientific) e sciacquare con acqua Milli-Q. Preparare tutte le soluzioni con acqua priva di RNasi e filtrare il violetto cresolo (Sigma-Aldrich) e Fluoro-Jade (Histo-chem) macchia con un 0,2 micron filtro prima dell&#39;uso. </li><li> Scongelare sezioni di cervello a temperatura ambiente per 30 sec e fissare in% ETOH 75 (1 min). </li><li> Per LCM di singoli neuroni danneggiati dopo la fissazione, sciacquare i vetrini in acqua RNase-free (1 min), Di contrasto con 1% di violetto cresolo (15-20 sec), sciacquare in acqua priva di RNasi (2 × 30 sec), macchia con Fluoro-Jade (4 min), sciacquare in acqua priva di RNasi (3 × 1 min), Disidratare con 95% EtOH fatto da acqua priva di RNasi (30 sec), 100% EtOH (30 sec), e xilene (2 × 3 min). </li><li> Per LCM di andane di neuroni dopo la fissazione, sciacquare i vetrini in acqua RNase-free (1 min), macchia con 1% di violetto cresolo (1 min), sciacquare in acqua priva di RNasi per (3 × 1 min), disidratazione con il 95% ETOH (2 × 30 sec), 100% EtOH (2 × 30 sec), e xilene (2 × 3 min). </li><li> Asciugare tutte le sezioni in una cappa di aspirazione per 15 minuti prima di LCM. I vetrini possono essere conservati, i lati di sezione fino, in una scatola rivestita di disseccante, se hanno bisogno di essere trasferiti da una stanza all&#39;altra. Tuttavia, i migliori risultati si ottengono se LCM viene eseguito immediatamente dopo sezioni sono secche. LCM dovrebbe essere limitata da 30 minuti a 1 ora. Nella prossima sezione, si descrive prima come catturare andane continue di cellule, che è eaSiest da padroneggiare per coloro che stanno imparando questa tecnica. Poi si descrive come catturare con precisione singoli neuroni. Nella nostra procedura, identifichiamo i neuroni che muoiono per la loro affinità per Fluoro-Jade-un marcatore di neuroni in degenerazione. Cellule Fluoro-Jade-negativi si presume essere sopravvissuto neuroni. </li></ol> 3. Microdissezione Laser Capture (LCM) LCM di andane di popolazioni arricchite di neuroni ippocampali <ol><li> LCM viene eseguita utilizzando un microscopio PixCell IIe con un laser a diodo ad infrarossi (Life Technologies). </li><li> Regolare il joystick al centro in posizione verticale. Ruotare e bloccare l&#39;obiettivo 4X in posizione. </li><li> Collocare una diapositiva al centro del portaoggetti e regolare manualmente fino alla regione dell&#39;ippocampo è in vista. Utilizzare regolazione del fuoco grossolana e fine per portare l&#39;immagine a fuoco. </li><li> Attivare la morsa a vuoto premendo il pulsante vuoto sul controller. Ruotare e bloccare l&#39;obiettivo 10X in place. Messa a fuoco ancora una volta con regolazioni grossolane e fini. </li><li> Caricare il CapSure Macro LCM tappi (Life Technologies) nel modulo cassetta CapSure e posizionare un tappo nella posizione della linea di carico. Ruotare il braccio di posizionamento Cap e posizione intorno al tappo. Sollevare il braccio del Collocamento Cap per rimuovere il tappo CapSure dal modulo cassetta. </li><li> Ruotare il braccio di posizionamento Cap sul vetrino e abbassare il braccio verso il basso sul vetrino, questo mettere il tappo sulla diapositiva. Regolare la messa a fuoco micrometrica e muovere il joystick per verificare se le cellule sono all&#39;interno del cerchio nero sul tappo. Tutte le catture cellule dovrebbero essere all&#39;interno di questo cerchio nero. </li><li> Impostare i parametri laser. In primo luogo, premere il pulsante di abilitazione laser sul controller. Lo spot laser bersaglio sarà visibile come un punto rosa nel campo visivo sul monitor del computer. </li><li> Impostare la dimensione dello spot laser a piccole (7,5 micron) per mettere a fuoco il laser e regolare la potenza e la durata a 65 - 75 mW, per 1,0-2,0 msec come necessario per la cattura cellulare ottimale. </li><li> Per test il laser, utilizzare il joystick per spostare il punto laser in una zona dove non ci sono le cellule a raccogliere. Fuoco il laser con l&#39;interruttore pollice. Utilizzare il joystick per spostare il punto laser di distanza dal punto polimero fuso e controllare per vedere se un anello scuro visibile circonda uno spazio libero in cui è stato sparato il laser. </li><li> Per catturare celle, utilizzare il joystick per spostare il punto laser sulla superficie di cellule di catturare. Fuoco il laser con l&#39;interruttore pollice. Spostare il joystick mentre si aziona il laser per catturare una grande area di celle. Quando il laser viene sparato scioglie il film di polimero termoplastico sul tappo alla superficie delle cellule bersaglio. Il polimero assorbe la radiazione laser, quindi non alterando l&#39;, DNA RNA o proteina garantire l&#39;integrità del campione per future applicazioni molecolari. </li><li> Dopo la cottura tutte le cellule di interesse, sollevare il braccio di posizionamento Cap. Le cellule raccolte si separerà dal sezione di tessuto e aderire al tappo CapSure. Il tessuto residuo e le cellule mancanti saranno visbile nel campo di vista. Le cellule del tappo può anche essere visualizzato posizionando il tappo su una parte vuota della diapositiva. </li><li> Sollevare il braccio di posizionamento Cap e ruotarla per Scaricare il Cap stazione. Abbassare il coperchio nella stazione e ruotare il braccio di posizionamento Cap nella sua posizione precedente. </li><li> Far scorrere lo strumento CapSure inserimento lungo la piattaforma e sul cappuccio. Sollevare lo strumento dalla piattaforma. Il tappo resterà attaccato. Toccare leggermente il tappo al pad CapSure pulito per pulire via i tessuti indesiderati. </li><li> Mettere il tappo in un ml 0.5 RNasi-free tubo riempito con 100 ml di tampone di lisi ottenuto dalla RNAqueous Micro-Kit di isolamento. Immediatamente vortex il tappo per 30 sec per lisare le cellule. Incubare i campioni a 42 ° C per 30 min e congelare a -80 ° C fino isolamento dell&#39;RNA. </li></ol> LCM di singoli FJ + neuroni nell&#39;ippocampo <ol start="15"><li> Per catturare singole cellule, caricare CapSure HS LCM tappi nel modulo cassetto CapSure e positisu un tappo nella posizione della linea di carico. Ruotare il braccio di posizionamento Cap e posizionarla intorno al tappo. Sollevare il braccio del Collocamento Cap per rimuovere il tappo CapSure dal modulo cassetta. </li><li> Impostare la dimensione dello spot laser a piccole (7,5 micron) per mettere a fuoco il laser e regolare la potenza del laser e la durata di 65 -75 mW per 0,45-0,50 msec per la cattura cellulare ottimale di cellule singole. </li><li> Ruotare il braccio di posizionamento Cap sul vetrino e abbassare il braccio verso il vetrino. Questo metterà il cappuccio sulla diapositiva. Il CAPSURE HS superficie della calotta si siede elevato dal campione durante il LCM. </li><li> Utilizzare il joystick per spostare il laser su singoli FJ + cellule. Tutte le cellule di essere catturati devono essere all&#39;interno del piccolo anello nero sul tappo. Fuoco il laser con l&#39;interruttore pollice. </li><li> Quando tutte le celle all&#39;interno dell&#39;area cerchio nero sono stati sparati con il laser, sollevare il braccio di posizionamento Cap. Le cellule catturate separerà dalla sezione di tessuto e aderire alla HS CapSure tappo. </li><li> Posizionare un altro vetrino sul Microsfar fronte palco e raccogliere FJ + cellule fino a quando il tappo HS è pieno. Mettere il tappo in un ml 0.5 RNasi-free tubo riempito con 40-50 ml di tampone di lisi. Immediatamente vortex il tappo per 30 sec per lisare le cellule. Incubare i campioni a 42 ° C per 30 min e congelare a -80 ° C fino isolamento dell&#39;RNA. </li></ol> 4. Totale isolamento di RNA da campioni di LCM (Questa sezione sarà solo essere descritta nel video di presentazione) <ol><li> RNA totale da cellule viene isolato impiegando la RNAqueous Micro-Kit (Ambion) seguendo i protocolli del produttore. Tutti i reagenti e le soluzioni di lavaggio sono forniti in questo kit. Pre-bagnato del microfiltro cartuccia aggiungendo 30 pl di tampone di lisi soluzione al filtro. Dopo 5 min, centrifugare il filtro per 30 sec a 10.000 × g. </li><li> Aggiungere 3 ml di additivo LCM al lisato campione, pipetta per mescolare e centrifugare. </li><li> Aggiungere 52 ml di ETOH 100% (1/2 volume) al lisato campione; pipetta per mescolare, e trasferire il lisato al filtrocolonna. </li><li> Centrifugare la colonna filtro a 10.000 g per 1 min per legare l&#39;RNA alla colonna. Se ci sono tappi multiple per un campione, ruotare ciascun lisato attraverso la colonna stessa separatamente. </li><li> Completare la procedura di isolamento di RNA come descritto nel kit RNAqueous Micro. </li><li> Eseguire DNasi trattamento e inattivazione di DNasi LCM campioni di RNA, come descritto nel kit, trasferire l&#39;RNA a una RNasi-free tubo e conservare a -80 ° C. </li></ol> 5. Quantificazione RNA e applicazioni a valle Valutazione della qualità dell&#39;RNA e la quantificazione viene eseguita con un Bioanalyzer Agilent utilizzando reagenti del kit di Pico (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) seguendo il protocollo del produttore. <ol><li> RNA totale è analizzato su un Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies). Il software valuta la concentrazione e l&#39;integrità del campione RNA assegnando un numero integrità dell&#39;RNA (RIN) di ciascun campione f vannorom 1 a 10. 1-5 indica RNA degradate e 7-10 indica RNA di buona qualità. </li><li> RNA intatto non degradati saranno utilizzati per Real-Time PCR, singoli saggi TaqMan o RT2 array profiler con Sybr-chimica verde. L&#39;RNA può essere utilizzato anche per l&#39;analisi microarray mRNA e microRNA microarray. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Questa tecnica LCM ci ha permesso di fare significativi passi avanti nella comprensione dei meccanismi molecolari di trauma cranico. 8,10,11,12,13 Siamo stati i primi a investigatori utilizzano questa tecnica per dimostrare che subregioni distinte dell&#39;ippocampo di ratto hanno profili di espressione genica che correlano con la loro vulnerabilità selettiva per infortunio. I nostri studi hanno dimostrato che possiamo quantificare l&#39;espressione genica, per qPCR, da un minimo di 10 celle laser catturati e che potrebbe svolgere il genoma analisi microarray da un minimo di 600 celle catturati. LCM potrebbe essere un valido strumento in studi analoghi di altre regioni del cervello che sono noti per essere implicati in diversi disturbi neurologici e neuropsichiatrici. Per esempio, gli studi che utilizzano LCM hanno fatto luce sulla patogenesi della malattia di Parkinson nei neuroni dopaminergici della substantia nigra, 14 e aiutato genoma studi di profilazione del nucleus accumbens, che è coinvolto in circuiti di ricompensa implicati in substance disturbi da abuso di 15. Eterogeneità neuronale si riflette a livello del genoma 16 e possono contribuire alla mancanza di successo di trattamenti sperimentali per TBI in studi clinici. Così, il nostro obiettivo è quello di utilizzare questa tecnica per studiare gli elementi critici che influenzano la sopravvivenza neuronale dopo trauma cranico. Nostro recente studio genoma profiling di morire e adiacente superstite neuroni ippocampali dopo TBI suggerito che un reostato cellulare che riflette il rapporto tra i livelli di espressione dei geni per la sopravvivenza delle cellule morte cellulare regola destino cellulare dopo TBI. Questi studi in corso contribuiranno alla progettazione e sviluppo di strategie farmacologici in grado di influenzare positivamente il reostato sopravvivenza cellulare. Inoltre, attualmente in uso LCM per seguire e controllare gli effetti di potenziali trattamenti farmacologici terapeutici in neuroni ippocampali dopo trauma cranico. Così, i nostri studi dimostrano che i dati accurati RNase-free e alcune tecniche di manipolazionemodifiche di protocolli esistenti, è possibile ottenere elevate qualità campioni di RNA da LCM per accurate analisi quantitativa dell&#39;espressione genica. Tuttavia ci sono alcuni trabocchetti associati a tecniche di LCM. Per esempio, raccogliendo solo le cellule neuronali senza contaminazioni microglia può essere quasi impossibile. Nello strato di cellule piramidali dell&#39;ippocampo è stato stimato che il 95% delle cellule sono neuroni con il 90% di questa popolazione da cellule piramidali e interneuroni 10%, lasciando una piccola percentuale di tipi di cellule gliali e altri. 8,17, 18 Nei nostri studi utilizziamo Fluoro-giada un colorante fluorescente che etichetta specificamente solo i neuroni danneggiati nel tessuto cerebrale. Una macchia differente che è un marcatore per GFAP sarebbe necessario per colorare microglia. 19 Raccolta solo le Fluoro-Jade macchiati singoli corpi neuronali garantisce una popolazione omogenea di neuroni. Un altro problema comune che può richiedere la risoluzione dei problemi è che un cerchio non èt definito quando il laser viene sparato. Se ciò si verifica, è necessario controllare le impostazioni laser e regolare la potenza e la durata necessarie. Inoltre è importante accertarsi che il cappuccio sia appiattito sul tessuto e posizionati correttamente nel braccio. Facendo riferimento al manuale LCM tecnico o chiamando il supporto tecnico a volte sarà necessario. Seguendo LCM e isolamento dell&#39;RNA, la qualità del RNA deve sempre essere valutato utilizzando un bioanalizzatore prima di qualsiasi analisi di espressione genica. Ci sono diversi tipi di strumenti di cattura laser attualmente presenti sul mercato, tra cui taglio laser (Life Technologies, Leica Microsystems) e laser catapultando (Zeiss) strumenti. Il nostro sistema di LCM funziona bene per l&#39;acquisizione di un piccolo numero di cellule. Altri sistemi ad alto rendimento e più automatizzato può essere più adatto per ottenere un maggior numero di cellule per analisi genomica e proteomica particolare. Infatti, LCM utilizzando questi sistemi automatici ha un grande potenziale per l&#39;analisi dei protein espressione in cellule identificate o popolazioni arricchite di cellule. 20 Inoltre, LCM può facilitare l&#39;analisi di espressione genica di cellule immunolabeled, 21 consentono di investigare l&#39;espressione genica in cellule tipi definiti indipendentemente dalla complessità nei tessuti più eterogenei. Così, LCM è un ottimo strumento per gli studi molecolari all&#39;avanguardia di popolazioni singole o arricchito di cellule.

Analisi di espressione genica dei tessuti eterogenei è sempre stato problematico,. Ciò è particolarmente vero nel cervello dei mammiferi, che ha circa 5.000 diversi tipi di cellule 4 Prima dello sviluppo della cattura microdissezione laser (LCM) tecnica, studi genomici degli effetti di TBI in vivo erano basate su analisi di espressione genica in una popolazione mista di cellule cerebrali compresi, non solo di differenti tipi di cellule neuronali, ma anche di supportare cellule gliali e immunomodulatori. I relativi complessi profili di espressione genica ottenuti da questi tessuti eterogenei, e gli schemi spesso conflittuali di segnali cellulari lesioni indotte, può essere una spiegazione del fallimento nel corso degli studi clinici di strategie terapeutiche dimostrato efficace in studi pre-clinici di trauma cranico. 5 Per ottenere una chiara comprensione di lesione indotta l&#39;espressione del gene in popolazioni vulnerabili di neuroni dal fianco rattopocampus, abbiamo adottato la tecnica della LCM, la prima volta da Emmert-Buck et al. 3 Successivamente, abbiamo modificato e ottimizzato questa tecnica per la cattura microdissezione efficiente delle popolazioni arricchite di neuroni e neuroni singoli per il profiling mRNA utilizzando quantitativa PCR in tempo reale e l&#39;analisi microarray . Per mantenere l&#39;integrità del mRNA in sezioni congelate di tessuto cerebrale per analisi genomica, abbiamo modificato protocolli esistenti per il fissaggio, colorazione e acquisizione rapida dei neuroni da sezioni congelate di cervello di ratto. Per l&#39;identificazione e l&#39;isolamento dei neuroni ippocampali feriti e moribondi, abbiamo anche ottimizzato il Fluoro-Jade tecnica di pittura per LCM. Fluoro-Jade non distingue tra la morte cellulare per apoptosi e necrosi. Così, tutti i tipi di neuroni in degenerazione può essere rilevato da questa macchia. 6,7 Qui, descriviamo il protocollo utilizzato nel nostro laboratorio per ottenere pool di singoli neuroni morenti o di reversibilità, nonché di andane arricchito populaticomponenti di diversi tipi di cellule neuronali (cioè CA1-CA3 neuroni per l&#39;analisi di espressione genica dopo TBI). La procedura per lesioni fluido cerebrale percussioni eseguite nel nostro laboratorio è descritto in dettaglio in Shimamura et al., 8 ed è molto simile al fluido laterale-percussioni protocollo pregiudizio per topi pubblicati JoVE da Alder et al. 9 Poiché la tecnica LCM ha dimostrato di avere un effetto minimo o nullo sulla integrità del DNA, RNA e proteine ​​nei tessuti, questo è un ottimo strumento per l&#39;analisi molecolare e proteine ​​di tipi cellulari definiti.

<table><tbody><tr><td>Microscopio a cattura laser PixCell IIe</td> Life <td>Technologies (Arcturus)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizzatore Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Kit RNAqueous</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Kit Agilent 6000 Pico</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Capsure LCM caps</td><td>Applied Biosystems</td><td>LCM0211/LCM0214</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Jade</td><td>Histo-chem Inc.</td><td></td><td></td>#1FJ</tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Xilene (grado istologico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof (grado istologico)</td><td>UTMB pharmacy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase free barrier pipette tips</td> Fisher <td></td><td>Scientific 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/cms_086283.pdf" target="_blank">Sistema di microdissezione a cattura laser Arcturus (Life Technologies)</a> <a href="http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/brochure-downloads.html?catalog=laser_microdissection" target="_blank">Microdissezione laser Zeiss La famiglia PALM </a> <a href="http:// www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20DM6000%20B/Brochures/Leica_DM4000-6000_B-Brochure_en.pdf" target="_blank">Leica Microsystems</a></td></tr></tbody></table>

laser microdissezione cattura di popolazioni arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

A lungo termine disabilità cognitiva dopo TBI è associato a lesioni neurodegenerazione indotta nell&#39;ippocampo, una regione del lobo temporale mediale, che è fondamentale per l&#39;apprendimento, la memoria e la funzione esecutiva. 1,2 Da qui i nostri studi si concentrano su analisi di espressione genica di neuronale specifica popolazioni in subregioni distinte dell&#39;ippocampo. La tecnica di cattura microdissezione laser (LCM), introdotta nel 1996 da Emmert-Buck, et al., 3 ha permesso significativi progressi nella analisi di espressione genica di cellule singole e arricchito popolazioni di cellule di tessuti eterogenei quali il cervello dei mammiferi che contiene migliaia di tipi di cellule funzionali. 4 Usiamo LCM e un modello di ratto ben consolidata delle lesioni cerebrali traumatiche (TBI) per studiare i meccanismi molecolari che sono alla base della patogenesi della TBI. A seguito di fluido-percussioni TBI, cervelli vengono rimossi a orari prestabiliti post-infortunio, immediatamente congelati in ghiaccio secco,e preparati per il sezionamento in un criostato. I cervelli di ratto può essere incorporato in OCT e sezionato immediatamente, o memorizzati diversi mesi a -80 ° C prima del taglio per microdissezione laser. Inoltre, noi adottiamo LCM per studiare gli effetti del trauma cranico sui ritmi circadiani. Per questo, si colgono i neuroni del nucleo soprachiasmatico che contengono il master clock del cervello dei mammiferi. Qui, viene illustrato l&#39;utilizzo di LCM per ottenere singoli neuroni identificati (infortunato e degenerando, Fluoro-Jade-positivo, o illeso, Fluoro-Jade-negativi) e le popolazioni arricchite di neuroni ippocampali per la successiva analisi di espressione genica mediante real time PCR e / o intero genoma microarrays. Questi LCM abilitati studi hanno rivelato che la vulnerabilità selettiva di regioni anatomicamente distinte del ippocampo di ratto si riflettono nei diversi profili di espressione genica di diverse popolazioni di neuroni ottenuta con LCM da queste regioni distinte. I risultati dei nostri studi a cella singola, dovemettiamo a confronto i profili trascrizionali di morire e adiacente superstite neuroni dell&#39;ippocampo, suggeriscono l&#39;esistenza di un reostato sopravvivenza cellulare che regola la morte cellulare e la sopravvivenza dopo TBI.

Nel nostro studio LCM in primo luogo, siamo stati in grado di dimostrare che le sub-regioni funzionalmente distinte (CA1 e CA3) dell&#39;ippocampo di ratto hanno profili di espressione genica che riflettono la loro vulnerabilità al trauma cranico. 8 Figura 1A-1C mostra cattura laser di neuroni piramidali dell&#39;ippocampo (CA1- CA3), i neuroni giro dentato e neuroni SCN prima, e dopo il LCM. Cattura Pulire piramidale, granulo o neuroni SCN, rispettivamente, sono mostrati i tappi macro. Figura 2A-2B illustra morire, i neuroni positivi Fluoro-Jade piramidali e sopravvivere, i neuroni negativi Fluoro-Jade piramidali prima e dopo la LCM. La cattura pulita del morire o sopravvivere neuroni è indicata visualizzando le cellule catturate sui cappelli LCM. Dopo LCM, l&#39;RNA totale può essere utilizzato per una gamma diversificata di studi molecolari compresi quantitativa real-time PCR dell&#39;espressione genica utilizzando TaqMan o SYBR chimiche verdi (Figura 3A), piccolo focused array PCR con sonde SYBR Green (Figura 3B) o interi genoma studi microarray (Figura 3C). <img alt="Figura 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig1.jpg" /> Figura 1. Cattura microdissezione laser di andane di popolazioni di cellule definite dal cervello di ratto. Congelati 10 sezioni micron coronali del cervello di ratto sono fissati in etanolo, tinto con un Nissl macchia (cresile viola) e preparati per LCM. Vengono mostrati foto dell&#39;ippocampo di ratto e nucleo soprachiasmatico prima e dopo LCM e le cellule catturate come visualizzato sul tappo macro. Neuroni piramidali A. dai CA1-CA3 sottocampi dell&#39;ippocampo di ratto. Cellule granulari B. nel giro dentato dell&#39;ippocampo. C. bilaterale nucleo soprachiasmatico posta a cavallo del terzo ventricoloe si trova al di sopra del chiasma ottico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" src="/files/ftp_upload/50308/50308fig2.jpg" /> Figura 2. Cattura microdissezione laser di singoli neuroni di ippocampo di ratto. Vengono mostrati A. Degenerare, Fluoro-Jade-positivi (tinto) ippocampali CA3 neuroni e B. Surviving, Fluoro-Jade-negativi (non colorati) CA3 neuroni prima e dopo LCM. Cellule catturate vengono visualizzate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src=&quot;/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. L&#39;analisi dell&#39;espressione genica di RNA totale isolato da neuroni laser catturati. A. quantitativi in tempo reale PCR dati di espressione genica orologio circadiano in SCN. Heatmap B. di espressione genica nel morire e sopravvivere neuroni dell&#39;ippocampo che mostrano espressione di apoptosi geni correlati con focalizzati array PCR . C. Agilent dell&#39;intero genoma analisi microarray di espressione genica in ippocampali CA1-CA3 neuroni di ratti che hanno ricevuto lesioni finzione, trauma cranico o trauma cranico più un ricombinante adeno-associato virus siRNA progettata per atterramento espressione di geni indotti da lesioni cerebrali (ossido nitrico neuronale sintasi e glutatione perossidasi-1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

Ci viene descritto come utilizzare la cattura microdissezione laser (LCM) per ottenere popolazioni arricchite di neuroni ippocampali o neuroni singoli da sezioni congelate di cervello di ratto feriti per la successiva analisi di espressione genica mediante real time PCR quantitativa e / o dell&#39;intero genoma microarray.

Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come ottenere popolazioni arricchite di neuroni ippocampali e singoli neuroni da sezioni di tessuto congelate mediante microdissezione a cattura laser per la successiva analisi dell'espressione genica. Ciò si ottiene con la prima anestetizzazione, un topo in una camera di anestesia. Il ratto viene quindi intubato, ventilato meccanicamente e posto in un supporto per la testa stereotassico per preparare il ratto Per la lesione cerebrale a percussione fluida, viene eseguita una craniotomia.Il secondo passo è somministrare la lesione cerebrale a percussione fluida. Successivamente, le sezioni coronali del cervello vengono tagliate su un criostato e colorate con l'aiuto del fluoro, un marcatore per i neuroni degenerati, o con il violetto reale, una colorazione missilistica. Il passaggio finale consiste nell'eseguire la micro dissezione a cattura laser e raccogliere singoli neuroni o pool di neuroni.In definitiva, l'RNA totale viene isolato dalle cellule catturate, analizzato per verificarne la qualità e quantificato utilizzando un bioanalizzatore Agilent e utilizzato in applicazioni a valle come la PCR quantitativa in tempo reale e l'analisi di microarray focalizzata sul percorso o sull'intero genoma. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la micro dissezione manuale, è che possiamo ottenere popolazioni arricchite di neuroni o altri tipi di cellule cerebrali come le cellule gliali o immunomodulatorie, o singoli neuroni da sezioni di tessuto. Questo ci permette di eseguire l'analisi dell'espressione genica in tipi di cellule identificati distinti nel cervello e in altri tessuti eterogenei composti da più tipi di cellule, la dimostrazione di questa procedura sarà persa.Debbie Boone, ricercatrice senior associata nel nostro laboratorio. Per prima cosa recupera il tessuto cerebrale ottenuto da ratti con percussione fluida, lesione cerebrale traumatica o lesione fittizia dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e trasferiscilo a meno 22 gradi Celsius. Criostato per 10 minuti per portare il cervello alla temperatura di sezione mentre il cervello si sta scongelando.Pulire il criostato con RNA zap contenente etanolo e pulire le spazzole con etanolo. Trascorsi i 10 minuti, rimuovere il cervello dal tubo e posizionarlo con il lato ventrale rivolto verso l'alto su un pezzo di garza sul criostato, utilizzare una lama di rasoio fresca e affettare il cervello per rimuovere la parte posteriore del cervello. Solo rostrale al cervelletto e la porzione anteriore al chiasma ottico.Riempi uno stampo criogenico con il mezzo di montaggio OCT e posiziona il cervello nello stampo con il lato anteriore rivolto verso il basso. Lasciare che il tessuto cerebrale si congeli nel mezzo di montaggio fino a quando non diventa bianco. L'operazione dovrebbe richiedere circa 10 minuti.Ora congelare il disco del campione sul cervello con OCT. Quindi rimuovere lo stampo. Inserire il disco con il cervello attaccato nella testa del campione e serrare le viti.Inserire una lama monouso a basso profilo nel portacoltello e serrare la leva verso il basso. Inizia ad affettare il cervello a 20 micron per rimuovere lo strato esterno di OCT. Una volta raggiunta la regione dell'ippocampo, impostare il quadrante dei micron su 10.Raccogliere le sezioni seriali coronali posizionando un vetrino o un vetro più. Far scorrere sulla sezione di tessuto. Posizionare i vetrini in un rack di colorazione privo di RNA a meno 20 gradi Celsius fino al completamento del sezionamento.Prima di procedere alla colorazione delle sezioni, pulire con ese tutti i contenitori di colorazione e i cilindri graduati e sciacquare con acqua milli Q. Assicurarsi che tutte le soluzioni siano state preparate con acqua priva di RNA e che la colorazione crestale viola e fluoro giada siano passate prima attraverso un filtro da 0,2 micron. Usa le sezioni cerebrali di Thor a temperatura ambiente per 30 secondi e fissa in etanolo al 75% per un minuto.Quindi procedere alla colorazione di contrasto appropriata per LCM di strisce di neuroni o singoli neuroni per LCM di strisce di neuroni dopo la fissazione, sciacquare i vetrini in acqua libera di RNA per un minuto, colorare con cresta viola all'1% per un minuto. Sciacquare in acqua priva di RNA tre volte per un minuto ciascuna, disidratare con etanolo al 95% due volte per 30 secondi ciascuna. Quindi etanolo al 100% due volte per 30 secondi e xilene due volte per tre minuti ciascuno.Dopo la colorazione, asciugare all'aria tutte le sezioni in una cappa aspirante per 15 minuti e poi procedere a LCM.Qui. Viene eseguita la LCM. Utilizzando un microscopio a celle P due E con un laser a diodi a infrarossi, regolare prima il joystick centrale in posizione verticale.Quindi ruota e blocca l'obiettivo Forex in posizione. Posizionare un vetrino con sezioni dell'ippocampo colorate al centro del tavolino del microscopio e regolare manualmente fino a quando la regione dell'ippocampo non è in vista. Usa il corso e trova le regolazioni della messa a fuoco.Per mettere a fuoco la sezione, attivare il mandrino a vuoto premendo il pulsante del vuoto sul controller. Quindi ruota e blocca l'obiettivo 10 x in posizione. Metti a fuoco di nuovo con la rotta e le regolazioni di precisione.Carica i tappi macro LCM nei tappi, nel modulo cassetta e posiziona un tappo nella posizione della linea di carico. Ruotare il braccio di posizionamento del tappo e posizionarlo attorno al tappo. Quindi sollevare il braccio di posizionamento del tappo per rimuovere i tappi dal modulo cassetta.Ruotare il braccio di posizionamento del cappuccio sopra il vetrino e quindi abbassarlo sopra il vetrino per posizionare il cappuccio sul vetrino. Regola la messa a fuoco fine e muovi il joystick per verificare se le celle sono all'interno del cerchio nero sul cappuccio. Tutte le cellule da catturare dovrebbero essere all'interno di questo cerchio nero.Ora imposta i parametri del laser. Per prima cosa premi il pulsante di abilitazione laser sul controller. Il punto del bersaglio laser sarà visibile in rosa.nel campo visivo sul monitor del computer. Impostare la dimensione dello spot laser su un valore piccolo per mettere a fuoco il laser e regolare la potenza e la durata da 65 a 75 milliwatt per uno o due millisecondi, a seconda delle necessità, per un'acquisizione ottimale delle cellule. Per testare il laser, utilizzare il joystick per spostare il punto laser in un'area in cui non ci sono celle da raccogliere.Spara il laser usando l'interruttore a pollice. Quindi utilizzare il joystick per allontanare il punto laser dal punto del polimero fuso e verificare se c'è un anello scuro visibile che circonda un'area libera in cui è stato sparato il laser. Per catturare le cellule, utilizzare il joystick per spostare il punto laser sull'area delle celle per catturare e sparare il laser.Usando l'interruttore a pollice, muovi il joystick mentre spari il laser per catturare un'ampia area di cellule. Dopo aver sparato tutte le celle di interesse, sollevare il braccio di posizionamento del cappuccio. Le cellule catturate si separeranno dalla sezione di tessuto e aderiranno al cappuccio.Il tuo tappo, il tessuto rimanente e le cellule mancanti saranno visibili nel campo visivo. Le celle sul cappuccio possono essere visualizzate anche posizionando il tappo su una parte vuota del vetrino. Sollevare il braccio di posizionamento del tappo e ruotarlo fino alla stazione di scarico del tappo.Abbassare il tappo nella stazione e ruotare il braccio di posizionamento del tappo nella posizione precedente. Far scorrere il tappo con lo strumento di inserimento lungo la piattaforma e sul tappo. Sollevare l'utensile con il cappuccio attaccato dalla piattaforma.Toccare leggermente il tappo sulla parte adesiva di un post-it per pulire il tessuto indesiderato. Posizionare il tappo in una provetta da 0,5 millilitri priva di RNA riempita con 100 microlitri di tampone di lisi ottenuto dal kit di microisolamento acquoso RN. Immediatamente agitare il tappo per 30 secondi per mentire.Le cellule incubano i campioni a 42 gradi Celsius per 30 minuti e si congelano a meno 80 gradi Celsius fino all'isolamento dell'RNA. La procedura di colorazione per LCM di singoli neuroni danneggiati dopo la fissazione è simile alla procedura per strisce di neuroni. Tuttavia, alcuni tempi di incubazione differiscono e le sezioni sono state sostenute con fluoro per quattro minuti prima del risciacquo e della disidratazione, vedere la parte di testo del protocollo per i dettagli dopo la colorazione.Anche in questo caso, asciugare all'aria tutte le sezioni in una cappa aspirante per 15 minuti. Prima di procedere con LCM per l'acquisizione di singole cellule, l'acquisizione del carico HS LCM si inserisce nel tappo o nel modulo a cassetta utilizzando la stessa procedura utilizzata per il macro condensatore LCM. Anche in questo caso, impostare la dimensione dello spot laser su un valore piccolo per mettere a fuoco il laser, ma questa volta regolare la potenza e la durata del laser da 65 a 75 milliwatt per 0,45-0,5 millisecondi per una cattura ottimale delle singole cellule.Ruotare il braccio di posizionamento del cappuccio sulla slitta e abbassare il braccio verso il basso verso la slitta. Per posizionare il tappo sopra il vetrino, la superficie del tappo HS di cattura si trova sollevata dal campione. Durante LCM, utilizzare il joystick per spostare il laser su singole celle positive di coadiuvante al fluoro.Tutte le cellule catturate devono essere all'interno del piccolo anello nero sul cappuccio e sparare il laser utilizzando l'interruttore a pollice. Quando tutte le cellule all'interno dell'area del cerchio nero sono state attivate con il sollevamento laser, il braccio di posizionamento del cappuccio, le cellule catturate si separeranno dalla sezione del tessuto e aderiranno al tappo hs di cattura. Ora posiziona un altro vetrino sul tavolino del microscopio e raccogli le cellule positive al fluroaiuto fino a riempire il tappo HS.Quindi posizionare il tappo in una provetta priva di RNA da 0,5 millilitri riempita con 40-50 microlitri di lisi, tampone e vortice e incubatori prima di congelare nuovamente a meno 80 gradi Celsius. In caso contrario, eseguire immediatamente l'isolamento dell'RNA secondo le istruzioni nella parte di testo del protocollo. Le immagini seguenti mostrano la microdissezione a cattura laser di strisce di specifiche popolazioni cellulari dal cervello di ratto congelate in sezioni coronali da 10 micron del cervello di ratto.Sono stati preparati secondo questo protocollo e colorati con viola crestale e colorazione a missile. Questa immagine mostra i neuroni parametallici dal circa uno al circa tre sottocampi dell'ippocampo di ratto. Qui, sono state catturate le cellule dei granuli nel giro dentato dell'ippocampo.Infine, mostriamo strisce di neuroni catturati dai nuclei bilaterali del soprachiasma situati su entrambi i lati del terzo ventricolo e sopra il chiasma ottico. L'SCN contiene l'orologio circadiano principale che controlla i ritmi circadiani in tutto il corpo. Le immagini seguenti mostrano la microdissezione a cattura laser di singoli neuroni da ippocampo di ratto.Qui sono mostrati i ca/c. ippocampali positivi al fluururo degenerativo, tre neuroni qui, sopravvissuti all'aiuto fluro-negativo, ca, tre neuroni prima e dopo la LCM, vengono mostrati, le cellule catturate vengono visualizzate sul cappuccio LCM. Le immagini seguenti hanno mostrato l'analisi dell'espressione genica dell'RNA totale, isolato da neuroni catturati al laser. Questa immagine mostra i dati quantitativi di PCR in tempo reale dell'espressione genica dell'orologio circadiano nel SCN.Questa mappa termica dell'espressione genica nei neuroni ippocampali morenti e sopravvissuti mostra il profilo di espressione dei geni correlati all'apoptosi utilizzando array PCR focalizzati. Infine, mostriamo un esempio di una mappa di calore generata da un'analisi microarray ORL dell'intero genoma dell'espressione genica in circa uno a circa tre neuroni da ratti che hanno ricevuto un trauma cranico fittizio o un trauma cranico più un virus siRNA adeno-associato sdraiato progettato per abbattere l'espressione dell'ossido nitrico neuronale, della sintasi o della glutatione perossidasi, entrambi sono geni indotti da lesioni cerebrali Dopo il suo sviluppo. Queste tecniche hanno aperto la strada agli scienziati in molti campi di ricerca, tra cui le lesioni cerebrali e il cancro, che utilizzano modelli animali di questi disturbi per eseguire profili genomici, proteomici e metabolici di specifiche popolazioni cellulari.Ad esempio, stiamo attualmente utilizzando queste tecniche per catturare al laser specifiche popolazioni cellulari dalla corteccia prefrontale e dalle aree cerebrali del nucleo accumbens che sono note per essere coinvolte nella dipendenza.

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In questo video-articolo vi presentiamo un metodo per isolare singoli o...

Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

Il profilo dell'espressione dell'RNA in regioni cerebrali murine discrete richiede una strategia di raccolta dei tessuti precisa e ripetibile. Viene qui descritto un protocollo che utilizza sia il sezionamento coronale del cervello sia la microdissezione assistita da corer tissutale. Il rendimento e la qualità dell'RNA totale ottenuti dai campioni risultanti confermano l'utilità del metodo delineato.

Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

Cellule neuroprogenitor umane (NPC) sono stati ampliati in condizioni proliferanti. NPC sono stati differenziati in colture ricche di neuroni in presenza di una combinazione di neurotrofine. Marcatori neuronali sono state rilevate mediante immunofluorescenza. Per isolare una popolazione pura di neuroni, NPC sono stati differenziati sulla penna scivoli di membrana e cattura microdissezione laser è stata eseguita.

Microdissezione laser di neuroni da cellule differenziate Neuroprogenitor umani in coltura

L'isolamento dei singoli neuroni dopaminergici o l'area tegmentale ventrale con immunoistochimica diretta o indiretta è dimostrata tramite microdissezione laser. Parametri per isolamento di tessuto da un vetrino utilizzando un laser a infrarossi e da diapositive membrana utilizzando la combinazione di un laser infrarosso ed ultravioletto sono discussi.

Laser Capture Microdissezione - Una dimostrazione dell&#39;isolamento individuale dopamina neuroni e l&#39;intera area ventrale tegmentale

Analisi dell'espressione genica di un sottogruppo di cellule in un tessuto specifico rappresenta una grande sfida. In questo articolo si descrive come isolare RNA totale di alta qualità da una popolazione di cellule specifiche, combinando un metodo immunomarcatura rapida con microdissezione laser.

RNA isolamento da cellulari sottopopolazioni specifiche utilizzando laser-capture Microdissection combinazione con Rapid immunomarcatura

Descriviamo l'uso di laser capture microdissection per ottenere campioni di popolazioni distinte delle cellule dalle regioni differenti del cervello per l'analisi del gene e microRNA. Questa tecnica permette lo studio di effetti differenziali del trauma cranico in regioni specifiche del cervello del ratto.

Atlas-guida stereotassica del Laser Capture Microdissection di regioni del cervello colpite da lesione traumatica

Qui, descriviamo un protocollo per una microdissezione laser riproducibile (LCM) per isolare il trabecolato (TM) per analisi di RNA a valle. La capacità di analizzare i cambiamenti nell'espressione genica nella TM vi aiuterà a comprendere i meccanismi molecolari delle malattie oculari correlate a TM.

Microdissezione laser di elevata purezza trabecolato dai Mouse occhi per analisi dell'espressione genica

Questo protocollo spiega come raccogliere singoli neuroni, microglia e astrociti dal nucleo centrale dell'amigdala con alta precisione e specificità anatomica utilizzando la microdissezione di cattura laser. Inoltre, spieghiamo il nostro uso di RT-qPCR microfluidico per misurare un sottoinsieme del trascrittoma di queste cellule.

Combinazione di microdissezione laser di cattura e qPCR microfluidico per analizzare i profili trascrizionali di singole cellule: un approccio di biologia dei sistemi alla dipendenza da oppioidi

La microdissezione laser (LMD) è una tecnica sensibile e altamente riproducibile che può essere utilizzata per scoprire percorsi che mediano l'eterogeneità e l'invasione del glioma. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per isolare le aree discrete dal tessuto glioma utilizzando LMD laser seguito da analisi trascrittomica.

Microdissezione di cattura laser delle sottoregioni del Glioma per la caratterizzazione spaziale e molecolare dell'eterogeneità intratutuale, dell'Oncoflusso e dell'invasione

Descriviamo qui un metodo per biopsying mucosa olfattiva di ratto e umano cavità nasali. Queste biopsie può essere usato sia per identificare le anomalie molecolari nelle malattie cerebrali o isolare le cellule staminali adulte multipotenti che possono essere utilizzati per il trapianto di cellule in modelli animali di trauma cerebrale /...

Isolare cellule staminali olfattivo nasale da roditori o Umani

Impara la microdissezione laser per isolare neuroni ippocampali da sezioni congelate di cervello di ratto dopo trauma cranico. Questa tecnica consente analisi dell'espressione genica in popolazioni cellulari specifiche.

Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico (Video) | JoVE Journal

Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

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