Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come ottenere popolazioni arricchite di neuroni ippocampali e singoli neuroni da sezioni di tessuto congelate mediante microdissezione a cattura laser per la successiva analisi dell'espressione genica. Ciò si ottiene con la prima anestetizzazione, un topo in una camera di anestesia. Il ratto viene quindi intubato, ventilato meccanicamente e posto in un supporto per la testa stereotassico per preparare il ratto Per la lesione cerebrale a percussione fluida, viene eseguita una craniotomia.

Il secondo passo è somministrare la lesione cerebrale a percussione fluida. Successivamente, le sezioni coronali del cervello vengono tagliate su un criostato e colorate con l'aiuto del fluoro, un marcatore per i neuroni degenerati, o con il violetto reale, una colorazione missilistica. Il passaggio finale consiste nell'eseguire la micro dissezione a cattura laser e raccogliere singoli neuroni o pool di neuroni.

In definitiva, l'RNA totale viene isolato dalle cellule catturate, analizzato per verificarne la qualità e quantificato utilizzando un bioanalizzatore Agilent e utilizzato in applicazioni a valle come la PCR quantitativa in tempo reale e l'analisi di microarray focalizzata sul percorso o sull'intero genoma. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la micro dissezione manuale, è che possiamo ottenere popolazioni arricchite di neuroni o altri tipi di cellule cerebrali come le cellule gliali o immunomodulatorie, o singoli neuroni da sezioni di tessuto. Questo ci permette di eseguire l'analisi dell'espressione genica in tipi di cellule identificati distinti nel cervello e in altri tessuti eterogenei composti da più tipi di cellule, la dimostrazione di questa procedura sarà persa.

Debbie Boone, ricercatrice senior associata nel nostro laboratorio. Per prima cosa recupera il tessuto cerebrale ottenuto da ratti con percussione fluida, lesione cerebrale traumatica o lesione fittizia dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e trasferiscilo a meno 22 gradi Celsius. Criostato per 10 minuti per portare il cervello alla temperatura di sezione mentre il cervello si sta scongelando.

Pulire il criostato con RNA zap contenente etanolo e pulire le spazzole con etanolo. Trascorsi i 10 minuti, rimuovere il cervello dal tubo e posizionarlo con il lato ventrale rivolto verso l'alto su un pezzo di garza sul criostato, utilizzare una lama di rasoio fresca e affettare il cervello per rimuovere la parte posteriore del cervello. Solo rostrale al cervelletto e la porzione anteriore al chiasma ottico.

Riempi uno stampo criogenico con il mezzo di montaggio OCT e posiziona il cervello nello stampo con il lato anteriore rivolto verso il basso. Lasciare che il tessuto cerebrale si congeli nel mezzo di montaggio fino a quando non diventa bianco. L'operazione dovrebbe richiedere circa 10 minuti.

Ora congelare il disco del campione sul cervello con OCT. Quindi rimuovere lo stampo. Inserire il disco con il cervello attaccato nella testa del campione e serrare le viti.

Inserire una lama monouso a basso profilo nel portacoltello e serrare la leva verso il basso. Inizia ad affettare il cervello a 20 micron per rimuovere lo strato esterno di OCT. Una volta raggiunta la regione dell'ippocampo, impostare il quadrante dei micron su 10.

Raccogliere le sezioni seriali coronali posizionando un vetrino o un vetro più. Far scorrere sulla sezione di tessuto. Posizionare i vetrini in un rack di colorazione privo di RNA a meno 20 gradi Celsius fino al completamento del sezionamento.

Prima di procedere alla colorazione delle sezioni, pulire con ese tutti i contenitori di colorazione e i cilindri graduati e sciacquare con acqua milli Q. Assicurarsi che tutte le soluzioni siano state preparate con acqua priva di RNA e che la colorazione crestale viola e fluoro giada siano passate prima attraverso un filtro da 0,2 micron. Usa le sezioni cerebrali di Thor a temperatura ambiente per 30 secondi e fissa in etanolo al 75% per un minuto.

Quindi procedere alla colorazione di contrasto appropriata per LCM di strisce di neuroni o singoli neuroni per LCM di strisce di neuroni dopo la fissazione, sciacquare i vetrini in acqua libera di RNA per un minuto, colorare con cresta viola all'1% per un minuto. Sciacquare in acqua priva di RNA tre volte per un minuto ciascuna, disidratare con etanolo al 95% due volte per 30 secondi ciascuna. Quindi etanolo al 100% due volte per 30 secondi e xilene due volte per tre minuti ciascuno.

Dopo la colorazione, asciugare all'aria tutte le sezioni in una cappa aspirante per 15 minuti e poi procedere a LCM.Qui. Viene eseguita la LCM. Utilizzando un microscopio a celle P due E con un laser a diodi a infrarossi, regolare prima il joystick centrale in posizione verticale.

Quindi ruota e blocca l'obiettivo Forex in posizione. Posizionare un vetrino con sezioni dell'ippocampo colorate al centro del tavolino del microscopio e regolare manualmente fino a quando la regione dell'ippocampo non è in vista. Usa il corso e trova le regolazioni della messa a fuoco.

Per mettere a fuoco la sezione, attivare il mandrino a vuoto premendo il pulsante del vuoto sul controller. Quindi ruota e blocca l'obiettivo 10 x in posizione. Metti a fuoco di nuovo con la rotta e le regolazioni di precisione.

Carica i tappi macro LCM nei tappi, nel modulo cassetta e posiziona un tappo nella posizione della linea di carico. Ruotare il braccio di posizionamento del tappo e posizionarlo attorno al tappo. Quindi sollevare il braccio di posizionamento del tappo per rimuovere i tappi dal modulo cassetta.

Ruotare il braccio di posizionamento del cappuccio sopra il vetrino e quindi abbassarlo sopra il vetrino per posizionare il cappuccio sul vetrino. Regola la messa a fuoco fine e muovi il joystick per verificare se le celle sono all'interno del cerchio nero sul cappuccio. Tutte le cellule da catturare dovrebbero essere all'interno di questo cerchio nero.

Ora imposta i parametri del laser. Per prima cosa premi il pulsante di abilitazione laser sul controller. Il punto del bersaglio laser sarà visibile in rosa.

nel campo visivo sul monitor del computer. Impostare la dimensione dello spot laser su un valore piccolo per mettere a fuoco il laser e regolare la potenza e la durata da 65 a 75 milliwatt per uno o due millisecondi, a seconda delle necessità, per un'acquisizione ottimale delle cellule. Per testare il laser, utilizzare il joystick per spostare il punto laser in un'area in cui non ci sono celle da raccogliere.

Spara il laser usando l'interruttore a pollice. Quindi utilizzare il joystick per allontanare il punto laser dal punto del polimero fuso e verificare se c'è un anello scuro visibile che circonda un'area libera in cui è stato sparato il laser. Per catturare le cellule, utilizzare il joystick per spostare il punto laser sull'area delle celle per catturare e sparare il laser.

Usando l'interruttore a pollice, muovi il joystick mentre spari il laser per catturare un'ampia area di cellule. Dopo aver sparato tutte le celle di interesse, sollevare il braccio di posizionamento del cappuccio. Le cellule catturate si separeranno dalla sezione di tessuto e aderiranno al cappuccio.

Il tuo tappo, il tessuto rimanente e le cellule mancanti saranno visibili nel campo visivo. Le celle sul cappuccio possono essere visualizzate anche posizionando il tappo su una parte vuota del vetrino. Sollevare il braccio di posizionamento del tappo e ruotarlo fino alla stazione di scarico del tappo.

Abbassare il tappo nella stazione e ruotare il braccio di posizionamento del tappo nella posizione precedente. Far scorrere il tappo con lo strumento di inserimento lungo la piattaforma e sul tappo. Sollevare l'utensile con il cappuccio attaccato dalla piattaforma.

Toccare leggermente il tappo sulla parte adesiva di un post-it per pulire il tessuto indesiderato. Posizionare il tappo in una provetta da 0,5 millilitri priva di RNA riempita con 100 microlitri di tampone di lisi ottenuto dal kit di microisolamento acquoso RN. Immediatamente agitare il tappo per 30 secondi per mentire.

Le cellule incubano i campioni a 42 gradi Celsius per 30 minuti e si congelano a meno 80 gradi Celsius fino all'isolamento dell'RNA. La procedura di colorazione per LCM di singoli neuroni danneggiati dopo la fissazione è simile alla procedura per strisce di neuroni. Tuttavia, alcuni tempi di incubazione differiscono e le sezioni sono state sostenute con fluoro per quattro minuti prima del risciacquo e della disidratazione, vedere la parte di testo del protocollo per i dettagli dopo la colorazione.

Anche in questo caso, asciugare all'aria tutte le sezioni in una cappa aspirante per 15 minuti. Prima di procedere con LCM per l'acquisizione di singole cellule, l'acquisizione del carico HS LCM si inserisce nel tappo o nel modulo a cassetta utilizzando la stessa procedura utilizzata per il macro condensatore LCM. Anche in questo caso, impostare la dimensione dello spot laser su un valore piccolo per mettere a fuoco il laser, ma questa volta regolare la potenza e la durata del laser da 65 a 75 milliwatt per 0,45-0,5 millisecondi per una cattura ottimale delle singole cellule.

Ruotare il braccio di posizionamento del cappuccio sulla slitta e abbassare il braccio verso il basso verso la slitta. Per posizionare il tappo sopra il vetrino, la superficie del tappo HS di cattura si trova sollevata dal campione. Durante LCM, utilizzare il joystick per spostare il laser su singole celle positive di coadiuvante al fluoro.

Tutte le cellule catturate devono essere all'interno del piccolo anello nero sul cappuccio e sparare il laser utilizzando l'interruttore a pollice. Quando tutte le cellule all'interno dell'area del cerchio nero sono state attivate con il sollevamento laser, il braccio di posizionamento del cappuccio, le cellule catturate si separeranno dalla sezione del tessuto e aderiranno al tappo hs di cattura. Ora posiziona un altro vetrino sul tavolino del microscopio e raccogli le cellule positive al fluroaiuto fino a riempire il tappo HS.

Quindi posizionare il tappo in una provetta priva di RNA da 0,5 millilitri riempita con 40-50 microlitri di lisi, tampone e vortice e incubatori prima di congelare nuovamente a meno 80 gradi Celsius. In caso contrario, eseguire immediatamente l'isolamento dell'RNA secondo le istruzioni nella parte di testo del protocollo. Le immagini seguenti mostrano la microdissezione a cattura laser di strisce di specifiche popolazioni cellulari dal cervello di ratto congelate in sezioni coronali da 10 micron del cervello di ratto.

Sono stati preparati secondo questo protocollo e colorati con viola crestale e colorazione a missile. Questa immagine mostra i neuroni parametallici dal circa uno al circa tre sottocampi dell'ippocampo di ratto. Qui, sono state catturate le cellule dei granuli nel giro dentato dell'ippocampo.

Infine, mostriamo strisce di neuroni catturati dai nuclei bilaterali del soprachiasma situati su entrambi i lati del terzo ventricolo e sopra il chiasma ottico. L'SCN contiene l'orologio circadiano principale che controlla i ritmi circadiani in tutto il corpo. Le immagini seguenti mostrano la microdissezione a cattura laser di singoli neuroni da ippocampo di ratto.

Qui sono mostrati i ca/c. ippocampali positivi al fluururo degenerativo, tre neuroni qui, sopravvissuti all'aiuto fluro-negativo, ca, tre neuroni prima e dopo la LCM, vengono mostrati, le cellule catturate vengono visualizzate sul cappuccio LCM. Le immagini seguenti hanno mostrato l'analisi dell'espressione genica dell'RNA totale, isolato da neuroni catturati al laser. Questa immagine mostra i dati quantitativi di PCR in tempo reale dell'espressione genica dell'orologio circadiano nel SCN.

Questa mappa termica dell'espressione genica nei neuroni ippocampali morenti e sopravvissuti mostra il profilo di espressione dei geni correlati all'apoptosi utilizzando array PCR focalizzati. Infine, mostriamo un esempio di una mappa di calore generata da un'analisi microarray ORL dell'intero genoma dell'espressione genica in circa uno a circa tre neuroni da ratti che hanno ricevuto un trauma cranico fittizio o un trauma cranico più un virus siRNA adeno-associato sdraiato progettato per abbattere l'espressione dell'ossido nitrico neuronale, della sintasi o della glutatione perossidasi, entrambi sono geni indotti da lesioni cerebrali Dopo il suo sviluppo. Queste tecniche hanno aperto la strada agli scienziati in molti campi di ricerca, tra cui le lesioni cerebrali e il cancro, che utilizzano modelli animali di questi disturbi per eseguire profili genomici, proteomici e metabolici di specifiche popolazioni cellulari.

Ad esempio, stiamo attualmente utilizzando queste tecniche per catturare al laser specifiche popolazioni cellulari dalla corteccia prefrontale e dalle aree cerebrali del nucleo accumbens che sono note per essere coinvolte nella dipendenza.