La registrazione dell'attività elettrica dai neuroni identificati nel cervello intatto di pesci transgenici

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di registrare le attività elettriche dei neuroni in una preparazione del cervello di pesce intatto. Ciò si ottiene anestetizzando prima un pesce meca transgenico di quattro o sei mesi in MS 2 22, e poi sezionando il suo cervello. Successivamente, uno dei neuroni di interesse marcati dalla GFP viene contattato con un elettrodo di registrazione e le sue attività elettriche vengono registrate mediante elettrofisiologia del patch clamp a cellula libera o a cellula intera.

In definitiva, i risultati possono mostrare cambiamenti nella frequenza di attivazione dei potenziali d'azione o cambiamenti nel potenziale di membrana in risposta a diversi trattamenti nel cervello intatto. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'elettrofisiologia delle cellule e le colture o le preparazioni di fette di cervello, è che possiamo caratterizzare le proprietà elettriche dei neuroni in una preparazione dell'intero cervello con circuiti neurali intatti. Sebbene questo Measured fornisca informazioni sulla neuroendocrinologia riproduttiva, può anche essere applicato ad altri sistemi neuronali utilizzando pesci resene come i neuroni che controllano la motivazione e i comportamenti affettivi.

Questa dimostrazione utilizza pesci meca transgenici in cui tre neuroni GnRH sono geneticamente marcati con GFP Per iniziare anestetizzare un maka adulto immergendolo in cinque millilitri di MS 2 22. Un paio di minuti dopo che i movimenti branchiali sono cessati, trasferiscilo in una capsula di Petri da 60 millimetri con soluzione salina di pesce. Ora usa le forbici per decapitare il pesce all'estremità della coccola dell'allume.

Trasferire la testa in una capsula di Petri di 35 millimetri di diametro, riempita per metà con soluzione salina di pesce e foderata con una protezione in yl. Il piatto richiede una depressione centrale in cui posizionare e fissare la testa con il lato dorsale rivolto verso l'alto con spilli per insetti con forbici sottili. Taglia con cura la parte dorsale del cranio attorno al suo perimetro.

Quindi rimuovere delicatamente il cranio con una pinza esponendo la parte dorsale del cervello, compresa la parte anteriore del midollo spinale. Ora, solleva delicatamente il midollo spinale con una pinza a punta sottile, quindi recidi i nervi connettivi bilaterali usando le forbici a punta fine. Ciò include la recisione dei nervi cranici, dei nervi spinali, dei nervi ottici laterali ventrali e dei nervi olfattivi anteriori.

Posizionare il cervello completamente sezionato in una nuova capsula di Petri riempita con soluzione salina di pesce fresco al microscopio. Controllare attentamente che l'intero cervello e la ghiandola pituitaria siano integri e non siano tagliati o perforati. Scartare il cervello danneggiato e ricominciare usando un ago.

Metti una piccola goccia di colla ad azione rapida come il cianoacrilato al centro della camera di registrazione. Stendere la goccia di colla su un centimetro quadrato. Quindi trasferisci rapidamente il cervello nella colla.

Fissalo con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Ora riempi la camera di registrazione con circa un millilitro di soluzione salina di pesce per coprire il cervello. Usando la pinza a punta sottile, rimuovere con cura le meningi sulla superficie dell'area di registrazione del cervello andando avanti.

Perfondere continuamente il cervello con soluzione salina di pesce aerata ad una velocità di almeno 200 microlitri al minuto. Realizzare dei micro elettrodi di vetro da 6 a 10 mega ohm e riempirli a metà con una soluzione di registrazione di patch sciolta. Utilizzando un microscopio a fluorescenza verticale con una telecamera CCD raffreddata, trova il GFP che esprime il nervo terminale gn RH tre neuroni a partire dall'obiettivo 10 x.

Quindi passa all'obiettivo 40 x e posiziona i neuroni in corrispondenza o vicino alla superficie ventrale dei bulbi olfattivi appena anteriormente al cefalone. Ora passa a un monitor video che fornisce immagini in tempo reale dal microscopio. Il cluster di neuroni contiene da 8 a 10 neuroni GnRH.

Posizionare il microelettrodo nel bagno della camera di registrazione con la punta dell'elettrodo sopra il neurone bersaglio. Applicare una leggera pressione positiva costante in modo che il microelettrodo non si ostruisca. Avvicinati delicatamente al neurone bersaglio con la punta dell'elettrodo, controlla e monitora la resistenza dell'elettrodo con il software di innesto Axo.

Utilizzando il test di tenuta in modalità voltage clamp, quando la punta dell'elettrodo si trova sulla superficie del neurone, la resistenza dell'elettrodo cambia leggermente a questo punto. Rilasciare la pressione positiva per realizzare una tenuta a bassa resistenza, se necessario, applica una leggera pressione negativa. Il passaggio più critico per una buona registrazione è quello di selezionare un braccio neuro pulito, in modo da poter aiutare a creare una tenuta ideale tra gli elettrodi e la stessa membrana.

Ora passa alla modalità pinza amperometrica. Apri il grafico, un programma di laboratorio di potenza, e inizia a registrare la tensione della membrana continuamente senza alcun input di corrente, regola la scala della tensione e la velocità di registrazione se necessario, registra l'attività elettrica di base in soluzione salina di pesce normale per circa cinque minuti prima di applicare qualsiasi trattamento. La perfusione in bagno di farmaci, ormoni, peptidi, eccetera, dovrebbe essere aggiunta alla preparazione cerebrale, scorrendo a 200 microlitri al minuto.

Quindi utilizzare una normale soluzione salina di pesce per un periodo di washout dopo aver individuato una cella, controllare e monitorare la resistenza dell'elettrodo in modalità voltage clamp. Quando la punta dell'elettrodo si trova sulla superficie del neurone e la resistenza dell'elettrodo cambia leggermente. Rilascia la pressione positiva e applica una piccola pressione negativa per creare una tenuta ad alta resistenza sul neurone.

Applicare una delicata aspirazione a bocca. Rompere la membrana cellulare rattoppata. La resistenza scenderà istantaneamente a circa 120-250 mega ohm quando la membrana si rompe.

Ora passa alla modalità pinza amperometrica e registra la tensione della membrana in modo continuo utilizzando il grafico senza alcun ingresso di corrente. Anche in questo caso, regolare la scala della tensione e la velocità di registrazione secondo necessità Dopo aver effettuato una registrazione di base dell'attività elettrica in soluzione salina di pesce normale per circa cinque minuti, applicare trattamenti seguiti da un periodo di washout. Le attività elettriche spontanee dei tre neuroni GNRH del nervo terminale moca sono state registrate in modalità current clamp.

La velocità di sparo tipica è compresa tra 0,5 e sei hertz. I potenziali tipicamente si attivano in un modello tonico o di battimento con un intervallo interspike abbastanza regolare, il potenziale di membrana interspike è in media di circa meno 48 millivolt. Questo approccio sperimentale è anche efficace nella registrazione di neuroni GNRH marcati con GFP situati nel proencefalo di adulti transgenici.

Attività elettrica del neurone del pesce zebra nel cervello intatto asportato di transgenico. Il pesce zebra è stato registrato in modo simile a quello descritto per un DACA da loose patch. Le stesse tecniche hanno fornito anche la registrazione di intere cellule.

A differenza dei neuroni GnRH del nervo meca terminale, il modello di azione spontanea, la potenziale attivazione dei neuroni GnRH del pesce zebra nell'area pre-operatoria, il cephalon ventrale e l'ipotalamo sono spesso irregolari una volta padroneggiati. Questa tecnica può essere eseguita in un'ora per una registrazione di 15 minuti se si esegue correttamente. Buona Fortuna.