La registrazione dell'attività elettrica dai neuroni identificati nel cervello intatto di pesci transgenici

L'obiettivo generale di questa procedura è registrare l'attività elettrica dei neuroni in un preparato cerebrale di pesce integro. Ciò si ottiene anestetizzando prima un pesce transgenico meca di quattro-sei mesi in MS 2 22, quindi dissezionando il suo cervello. Successivamente, uno dei neuroni d'interesse marcato con GFP viene contattato mediante un elettrodo di registrazione e la sua attività elettrica viene registrata mediante elettrofisiologia patch-clamp in configurazione loose patch o whole cell patch.

In definitiva, i risultati possono mostrare variazioni nella frequenza di scarica dei potenziali d'azione o modifiche nel potenziale di membrana in risposta a diversi trattamenti nel cervello integro. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'elettrofisiologia di cellule in coltura o di preparati di fette di cervello, è che possiamo caratterizzare le proprietà elettriche dei neuroni in una preparazione di cervello intero con circuiti neurali intatti. Sebbene questa tecnica fornisca informazioni sulla neuroendocrinologia riproduttiva, può essere applicata anche ad altri sistemi neurologici utilizzando pesci modello come il resene, in cui i neuroni controllano la motivazione e i comportamenti affettivi.

Questa dimostrazione utilizza pesci meca transgenici in cui i neuroni di GnRH tre sono geneticamente marcati con GFP. Per iniziare, anestetizzare un adulto maka immergendolo in cinque millilitri di MS 222. Alcuni minuti dopo che i movimenti delle branchie sono cessati, trasferirlo in una piastra di Petri da 60 millimetri contenente soluzione salina per pesci. Utilizzare ora le forbici per decapitare il pesce all'estremità coddle dell'alum.

Trasferire la testa in una piastra di Petri di diametro 35 millimetri, riempita per metà con soluzione salina per pesci e foderata con yl guard. La piastra deve presentare una depressione centrale in cui posizionare e fissare la testa con perni da insetto, con il lato dorsale rivolto verso l'alto, utilizzando forbici fini. Tagliare con attenzione la parte dorsale del cranio lungo il suo perimetro.

Quindi rimuovere delicatamente il cranio con pinzette, esponendo la parte dorsale del cervello, compresa la parte anteriore del midollo spinale. Ora sollevare delicatamente il midollo spinale con pinzette a punta fine, quindi recidere i nervi connettivi bilaterali utilizzando forbici a punta fine. Questo include la sezione dei nervi cranici, dei nervi spinali, dei nervi ottici del lato ventrale e dei nervi olfattivi anteriori.

Posizionare il cervello completamente dissezionato in una nuova piastra di Petri riempita con soluzione salina per pesci fresca sotto un microscopio. Verificare attentamente che l'intero cervello e la ghiandola pituitaria siano integri e non presentino tagli o perforazioni. Scartare eventuali cervelli danneggiati e ricominciare utilizzando un ago.

Posizionare una piccola goccia di colla rapida, come la cianoacrilato, al centro della camera di registrazione. Distribuire la goccia di colla su un centimetro quadrato. Quindi trasferire rapidamente il cervello sulla colla.

Fissarla con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Ora riempire la camera di registrazione con circa un millilitro di soluzione salina per pesci, in modo da ricoprire il cervello. Utilizzando le pinzette a punta fine, rimuovere con attenzione le meningi dalla superficie dell'area cerebrale da registrare, procedendo in avanti.

Perfondere continuamente il cervello con soluzione salina aerata per pesci a una velocità di almeno 200 microlitri al minuto. Preparare da sei a dieci microelettrodi di vetro da sei a dieci megaohm e riempirli retroattivamente per circa metà con soluzione per registrazioni in patch libera. Utilizzando un microscopio fluorescente eretto dotato di una telecamera CCD refrigerata, individuare i neuroni del nervo terminale gn RH tre che esprimono GFP, partendo dall'obiettivo 10x.

Quindi passare all'obiettivo 40x e individuare i neuroni sulla superficie ventrale dei bulbi olfattivi o nelle immediate vicinanze, appena anteriori rispetto al cefalo. Passare ora a un monitor video che fornisce immagini in tempo reale provenienti dal microscopio. L'aggregato neuronale contiene da otto a dieci neuroni GnRH.

Posizionare il microelettrodo nel bagno della camera di registrazione con la punta dell'elettrodo sopra il neurone bersaglio. Applicare una leggera pressione positiva costante in modo che il microelettrodo non si otturi. Avvicinarsi delicatamente al neurone bersaglio con la punta dell'elettrodo, verificando e monitorando la resistenza dell'elettrodo mediante il software Axo graft.

Utilizzando il test di sigillatura in modalità voltage clamp, quando la punta dell'elettrodo si trova sulla superficie del neurone, la resistenza dell'elettrodo cambia leggermente in questo punto. Rilasciare la pressione positiva per formare un sigillo a bassa resistenza; se necessario, applicare una leggera pressione negativa. Il passaggio più critico per una buona registrazione consiste nella selezione di un neuro arto pulito, il che può aiutare a creare un sigillo ideale tra l'elettrodo e la stessa membrana.

Ora passare alla modalità di clampaggio della corrente. Aprire il programma Chart di PowerLab e iniziare a registrare continuamente la tensione della membrana senza alcun apporto di corrente; se necessario, regolare la scala della tensione e la velocità di registrazione. Registrare l'attività elettrica di base nella soluzione salina normale per pesci per circa cinque minuti prima di applicare qualsiasi trattamento. I farmaci, gli ormoni, i peptidi, ecc., devono essere aggiunti al preparato cerebrale mediante perfusione nel bagno, con un flusso di 200 microlitri al minuto.

Quindi utilizzare una soluzione salina per pesci normale per un periodo di lavaggio dopo aver individuato una cellula; verificare e monitorare la resistenza dell'elettrodo in modalità clamp di tensione. Quando la punta dell'elettrodo è sulla superficie del neurone e la resistenza dell'elettrodo cambia leggermente, rilasciare la pressione positiva ed applicare una leggera pressione negativa per formare un sigillo ad alta resistenza sul neurone.

Applicare un'aspirazione leggera con la bocca. Rompere la membrana cellulare della cellula sigillata. La resistenza scenderà immediatamente a circa 120-250 megaohm quando la membrana si rompe.

Ora passare alla modalità clamp di corrente e registrare continuamente la tensione della membrana utilizzando un grafico, senza alcun apporto di corrente. Regolare nuovamente la scala della tensione e la velocità di registrazione secondo necessità. Dopo aver effettuato una registrazione di base dell'attività elettrica nel fisiologico per pesci normale per circa cinque minuti, applicare i trattamenti seguiti da un periodo di lavaggio. Le attività elettriche spontanee dei neuroni GNRH tre del terminale nervoso moca sono state registrate in modalità clamp di corrente.

La frequenza tipica di scarica è da 0,5 a sei hertz. I potenziali si generano tipicamente in un modello tonico o ritmico con un intervallo interspiga abbastanza regolare, e il potenziale di membrana interspiga medio è di circa meno 48 millivolt. Questo approccio sperimentale si è dimostrato efficace anche nella registrazione da neuroni GNRH marcati con GFP localizzati nel proencefalo di adulti transgenici.

Attività elettrica dei neuroni del pesce zebra nel cervello intatto escisso di soggetti transgenici. L'attività del pesce zebra è stata registrata in modo analogo a quanto descritto per un DACA mediante patch in modalità loose. Le stesse tecniche hanno permesso anche la registrazione in modalità whole cell.

A differenza dei neuroni di GnRH del nervo terminale meca, il pattern di attività elettrica spontanea dei neuroni di GnRH del pesce zebra nell'area preottica, nel cefalo ventrale e nell'ipotalamo è spesso irregolare. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora per una registrazione di 15 minuti, se effettuata correttamente. Buona fortuna.