Name: Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Scopri l'iniezione stereotassica di vettori virali per la manipolazione genica condizionale nel midollo spinale del topo. Questa tecnica consente l'espressione genica mirata nel corno dorsale lombare per studi neuroscientifici.

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Ringraziamo Bakhos A. Tannous, Ph.D., Direttore dello Sviluppo e Produzione vettore nel Centro Neuroscienze del Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, per averci fornito il rAAV-EGFP vettore, e John Whang per l&#39;assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione R01 NS050408 (JS), presso l&#39;Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo.

La procedura chirurgica descritta è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC) della Columbia University. 1. Preparazione delle apparecchiature e delle particelle sospensione di virus <ol><li> Pulire e disinfettare le attrezzature, sterilizzare gli strumenti chirurgici e le punte notch V che verranno utilizzati per fissare vertebra L1. </li><li> Tirare e pipette di vetro conici. Usiamo pipette che hanno un diametro di punta di 40 micron e sono smussati con un angolo di 20 °. Sterilizzare le pipette di vetro. </li><li> Impostare il telaio stereotassico, montare l&#39;iniettore microsiringa sulla manipolatore e collegare l&#39;iniettore al controllore. </li><li> Collegare una delle pipette di vetro per la microsiringa utilizzando il kit di raccordo a compressione. </li><li> Rimuovere lo stantuffo dalla microsiringa e riempire la siringa con olio minerale. Oil Red O (1 - (2,5-dimetil-4-(2,5-dimethylphenylazo) fenilazo)-2-naftolo) può essere aggiunto al olio minerale per aumentare la sua visibility. Reinserire lo stantuffo e spingerla per tutta la strada fino alla punta. Accuratamente evitare di creare una bolla d&#39;aria. </li><li> Preparare la sospensione di particelle di virus in un armadio biosicurezza. Scongelare il virus congelato su ghiaccio e, immediatamente prima dell&#39;uso, diluire con sterile PBS alla concentrazione di particelle desiderato. </li><li> Inserire la microsiringa nel supporto dell&#39;iniettore. </li><li> Pipettare 5 microlitri della sospensione di virus su un foglio di plastica, ad esempio Parafilm. Abbassare la punta della pipetta di vetro nella goccia e tirare lo stantuffo per riempire la microsiringa. Creare una piccola bolla d&#39;aria sulla punta della pipetta per evitare che si intasi. </li></ol> 2. Laminectomia <ol><li> Preparare l&#39;area di intervento pulendo panchina e piastra elettrica con disinfettante. </li><li> Anestetizzare il mouse. Usiamo l&#39;anestesia per inalazione con isoflurano (3% durante l&#39;induzione, 2% -3% durante la manutenzione). </li><li> Posizionare lubrificante su ciascun occhio per proteggere gli occhi dalla disidratazione durante l&#39;funzionamento. </li><li> Accorciare il pelo della schiena al collo del mouse e disinfettare la pelle con salviette alternata di un antisettico topico come clorexidina o polivinilpirrolidone-iodio e il 70% di etanolo. Isolare il sito in modo asettico preparato con telo chirurgico e infiltrarsi nel sito di incisione con bupivacaina (0,25%, diluito 1:10 con soluzione fisiologica). </li><li> Incidere la pelle all&#39;estremità caudale della gabbia toracica lungo la linea mediana (2-3 cm) e separare la fascia che copre la colonna vertebrale. </li><li> Poiché il midollo spinale smette di crescere in precedenza durante lo sviluppo postnatale rispetto alla colonna vertebrale, segmento spinale L4 si trova sotto la prima vertebra lombare (L1). Vertebra L1 si trova caudalmente alla vertebra che contiene l&#39;ultimo paio di costole. Ed esporre vertebra L1, eliminando i piccoli muscoli della colonna vertebrale e dei legamenti attaccati alla superficie dorsale. </li><li> Sollevare leggermente e tenere premuto L1 vertebra con una pinza Adson. Utilizzare una pinza laminectomia dedicato per rimuovere la dorsale portion della vertebra (colonna vertebrale e lamina) ed esporre il midollo spinale. Evitare di danneggiare il midollo spinale. </li><li> Trasferire il mouse sulla piastra riscaldante nel telaio stereotassico. Monitorare la temperatura del mouse durante la successiva operazione. </li></ol> 3. Iniezione <ol><li> Fissare vertebra L1 con punte tacca V. Le punte devono stabilizzare la colonna in modo che la vertebra non si sposta durante la respirazione. </li><li> Portare il microsiringa più vicino in modo che la punta della pipetta è al di sopra del sito di laminectomia. Abbassare lo stantuffo fino a visualizzare la sospensione di virus in uscita la pipetta. Rimuovere la goccia con la punta di cotone sterile. </li><li> Posizionare la punta della pipetta in più a parte rostrale del midollo spinale esposto. Centro la pipetta sopra il solco posteriore mediana, quindi spostare la punta 500 pm lateralmente. Abbassare la punta sulla superficie del cavo e la puntura della dura madre o, se si lavora con una pipetta di vetro unbeveled, utilizzare una cannula smussata in acciaio per forare il dura. Abbassare la punta della pipetta di vetro 300 micron nel midollo spinale. </li><li> Iniettare 1 ml di sospensione di virus a una velocità di 200 nl / min. </li><li> Al termine dell&#39;iniezione, attendere almeno 2 minuti prima lentamente ritraendo la pipetta. </li><li> Ripetere i passaggi 3,3-3,5 al-caudale più porzione del midollo spinale esposta per ottenere una distribuzione completa del vettore virale in L4 segmento spinale. I due siti di iniezione si trovano rostrale e caudale del segmento L4, per evitare danni ai tessuti nella regione di destinazione. </li></ol> 4. Chiusura della ferita <ol><li> Rilasciare vertebra L1 dalle fascette tacca le V e togliere il mouse dal telaio stereotassico. </li><li> Suturare la fascia con 5,0 Vicryl. La fascia chiuso prevede la copertura per il sito laminectomia. </li><li> Chiudere la pelle con punti di sutura in nylon o graffette chirurgiche. </li></ol> 5. Cura postoperatoria <ol><li> Trasferire il mouse a una gabbia di recupero con morbido, biancheria da letto nonparticular. Mettere sul tegli laterali per la respirazione confortevole. Monitorare l&#39;animale fino a quando non è completamente vigile, ambulatoriale e inizia a bere. </li><li> Forniamo analgesia post-chirurgica per 72 ore al giorno con iniezioni sottocutanee di carprofen (5,0 mg / kg). </li><li> Monitorare il recupero post-chirurgico mediante ispezione giornaliera per i primi 3 giorni, poi a giorni alterni o 3 giorni a settimana fino a quando l&#39;esperimento è completo. </li><li> Rimuovere le suture cutanee o graffe 7 a 10 giorni dopo l&#39;operazione, quando la guarigione della ferita è completa. </li><li> Euthanize l&#39;animale al termine dell&#39;esperimento. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Iniezione stereotassica vettore permette il targeting neuroni del midollo spinale per applicazioni come la mappatura della rete neuronale basata sul virus transsynaptic diffondere 6,7 o dissezione optogenetic 8, la guida durante la rigenerazione assonale da lesioni 9,10, o la terapia genica per la prevenzione o il trattamento di neurodegenerazione 11, 12. Vettori virali sono stati utilizzati per la manipolazione del gene nel midollo spinale di studiare somatosensoriali, motori...

Le tecnologie avanzate di manipolazione genica condizionale nel topo consentono molteplici approcci per l&#39;esplorazione di sinapsi e collegamenti funzionali del sistema nervoso centrale. Transgeni può essere regolata da piccole molecole come effettori doxiciclina agenti su un transattivatore della tetraciclina controllato, che può essere progettato per funzionare come un repressore o un attivatore della trascrizione genica, o tamoxifene riconoscere un mutato ligando dominio di legame del recettore di estrogeno 1 . Modifica irreversibile transgene è comunemente ottenuto da acido desossiribonucleico (DNA) ricombinasi. Cre (ricombinazione cause) e Flp (enzima ricombinazione flippase) catalizzare l&#39;, inversione escissione o la traslocazione di frammenti di DNA che vengono affiancati da loxP (luogo di x crossing over, P1) o Frt (target riconoscimento flippase) siti, rispettivamente, 1. Le applicazioni includono l&#39;attivazione del gene o silenziamento inducibile e acido ribonucleico (RNA) ingerenza <sup&gt; 2. Espressione condizionale reporter fluorescente o enzimatica come β-galattosidasi o fosfatasi alcalina può essere usato per etichettare neuroni ed esaminare la loro organizzazione topica e connettività 3. Grandi progetti di mutagenesi in Nord America ( <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) e in Europa ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) producono librerie di cloni di cellule staminali embrionali di topo con obiettivi gene condizionali e le trappole che alla fine coprono l&#39;intero genoma del mouse. Topi generati da questi cloni possono essere attraversata con un numero crescente di topi che esprimono ricombinasi DNA sotto promotori o loci specifici per una particolare popolazione di neuroni di manipolazione genica selettiva ( <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php</a> ). <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Tuttavia, limitando la manipolazione genetica di popolazioni distinte di neuroni o regioni particolari di interesse non può essere ottenuto genetica mira solo se un promotore specifico per la popolazione neurone di interesse non è noto o non espresso da tutti i neuroni della regione di interesse. Nel midollo spinale, disegni sperimentali possono richiedere restrizione spaziale della manipolazione genetica di uno o due segmenti cranio-caudale. Iniezione stereotassica di un vettore virale che esprime Cre o Flp consente di limitare ricombinazione genica per regioni nel midollo spinale di topi in cui si affiancano frammenti di DNA da loxP o siti FRT, cosiddetti alleli floxed o flrted. A differenza di riarrangiamenti del DNA costitutivo, con la conseguenza di incroci animali con topi che esprimono ricombinasi, questa strategia consente anche il controllo temporale su attivazione genica o silenziamento. Vettori virali codificanti floxed o flirtato transgeni offre un&#39;opzione di inversione di manipolazione del gene nei topi esprimere la corresponding valle ricombinasi di un neurone-specifica promotore. Diversi vettori ricombinanti con affinità per i neuroni sono disponibili 4. Alta capacità (gutless) adenovirus, virus adeno-associati, virus dell&#39;herpes simplex e lentivirus sono comunemente utilizzati vettori neurotropici. Selezione del virus appropriato per una domanda di ricerca è una parte cruciale del disegno sperimentale. Dimensione del transgene, percorso di consegna, specificità dell&#39;infezione di neuroni a differenza di cellule gliali, efficacia infezione, effetti collaterali tossici infiammatori e devono essere considerati 4. Qui descriviamo l&#39;iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale del midollo spinale, una tecnica che usiamo per la regolazione genica condizionale nella nostra ricerca sulla neurobiologia del dolore. Il corno dorsale riceve l&#39;input afferente da primari neuroni somatosensoriali inclusi i neuroni nocicettivi. Interneuroni locali elaborare le informazioni prima di neuroni di proiezione che trasmettono dail corno dorsale al cervello 5. Dimostriamo l&#39;infezione di neuroni del corno dorsale a livello segmentale spinale L4 con neurotropico ricombinante virus adeno-associato (rAAV) che esprime migliorato proteina fluorescente verde (EGFP) sotto un promotore di citomegalovirus costitutivamente attivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td></td></tr><tr><td> Piastra di base della colonna vertebrale </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> Piccolo animale strumento stereotassico </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse gas anestesia testa porta </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> Supporti di base regolabili </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> V notch picchi </td><td> David Kopf Instruments </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> Piccolo animale temperatura del sistema di controllo </td><td> David Kopf Instruments </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> Adson forcipe </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> Laminectomia pinza </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (uno) con SYS-Micro4 controller </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> Microsiringa, 65RN </td><td> Hamilton </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> RN raccordo a compressione, 1 mm </td><td> Hamilton </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro borosilicato capillari </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Iniezione intraparenchimale di un vettore virale consente la manipolazione condizionale gene in distinte popolazioni di neuroni o regioni specifiche del sistema nervoso centrale. Dimostriamo una tecnica stereotassica iniezione che permette l&#39;espressione del gene bersaglio o silenziamento nel corno dorsale del midollo spinale del mouse. La procedura chirurgica è breve. Richiede laminectomia di una singola vertebra, che prevede il recupero rapido dell&#39;animale e motilità perfetta della colonna vertebrale. Iniezione controllata di un piccolo volume di sospensione vettore a bassa velocità e l&#39;uso di una cannula microsiringa con vetro smussato minimizzare la lesione tissutale. La risposta immunitaria locale al vettore dipende dalle proprietà intrinseche del virus impiegati, nella nostra esperienza, è minore e di breve durata, quando un ricombinante adeno-associated virus viene utilizzato. Un gene reporter come migliore proteina fluorescente verde facilita distribuzione spaziale monitoraggio del vettore, e l&#39;efficacia e cellulare specificity della trasfezione.

Rendimenti di trasfezione di successo l&#39;espressione genica robusta nei neuroni del corno dorsale iniettato (Figura 1), risparmiando il corno dorsale del lato controlaterale, il corno ventrale e gangli delle radici dorsali. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La trasfezione di neuroni del corno dorsale. (A) Espressione della EGFP reporter fluorescente (verde) nel corno sinistro dorsale del midollo spinale L4, ...

Vettori virali per consentire la manipolazione genica mirata. Abbiamo dimostrato un metodo per l&#39;espressione genica condizionale o ablazione nel midollo spinale topo, utilizzando iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale, un luogo di rilievo di contatto sinaptico tra afferenze somatosensoriali primarie e neuroni del sistema nervoso centrale.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere un'espressione genica localizzata nel midollo spinale del mouse mediante iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale lombare. Il primo passaggio della procedura consiste nel localizzare ed esporre la vertebra lombare. Il secondo passaggio consiste nel rimuovere la porzione dorsale della vertebra al fine di esporre il midollo spinale.Una procedura denominata laminectomia. Successivamente, una pipetta di vetro collegata a una micropompa siringa viene posizionata sopra il corno dorsale e abbassata nel midollo spinale. L'ultimo passaggio consiste nell'iniettare lentamente la sospensione del vettore.Dopo due settimane, la trasfezione dei neuroni del corno dorsale viene dimostrata dall'espressione della proteina fluorescente verde, che consente di tracciare la distribuzione del virus. Questo metodo aiuta a chiarire la funzione dei neuroni in alcune parti del percorso sensoriale. Lo utilizziamo in studi che si concentrano specificamente sullo sviluppo del dolore infiammatorio o neuropatico.La dimostrazione visiva è fondamentale per imparare come posizionare il mouse nel telaio stereotassico. È essenziale per il success

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Neuroscience

Neuroscienze

Fonte: Porlan, E., et al. Modificazione genetica stabile ed efficiente delle cellule nel topo adulto V-SVZ per l'analisi degli effetti autonomi e non autonomi delle cellule staminali neurali. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra la modificazione genetica stabile delle cellule staminali neurali (NSC) nella zona ventricolare-subventricolare (V-SVZ) attraverso l'iniezione stereotassica di un gene terapeutico portatore di virus in un modello murino. Il virus entra nelle NSC, subisce la...

Iniezione stereotassica di virus per la modificazione genetica stabile in un modello murino

Fonte: Chen, S., et al., Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica nelle cellule striatali del cervello di topo neonatale. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra l'iniezione stereotassica di un vettore virale che codifica per la Cre ricombinasi e la proteina a fluorescenza verde o GFP nello striato di un cucciolo di topo geneticamente modificato per ottenere la manipolazione genica asportando una cassetta STOP fiancheggiata da loxP, attivando la proteina a fluorescenza rossa o RFP...

Microiniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione genica in uno striato di cucciolo di topo

Fonte: Tadokoro, T., et al. Consegna del vettore del virus adeno-associato subpial 9 (AAV9) in topi adulti. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra una tecnica di iniezione subpial per la consegna di geni al midollo spinale nei topi. La procedura prevede l'esposizione della dura madre, la perforazione della pia madre e l'iniezione di un virus adeno-associato ricombinante (rAAV) che trasporta un gene che esprime una proteina fluorescente nello spazio subpiale. Dopo l'iniezione e il recupero, il...

Consegna del gene subpiale nel midollo spinale del topo per valutare l'espressione genica

Fonte: Pereira, M. et. al., Riprogrammazione diretta in vivo delle cellule gliali residenti in interneuroni mediante iniezione intracerebrale di vettori virali. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra l'iniezione stereotassica di un virus adeno-associato nella corteccia cerebrale di un topo transgenico per fornire la riprogrammazione neuronale Cre-dipendente e i geni reporter fluorescenti nelle cellule gliali.

Iniezione stereotassica di vettori virali per la riprogrammazione delle cellule gliali in un modello murino

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Progettazione, confezionamento e consegna di CRISPR retrò e lentivirus ad alto titolo tramite iniezione stereotassica. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra l'iniezione virale stereotassica per un preciso editing genico neuronale nel cervello del topo. Il protocollo garantisce un'accurata consegna del virus al giro dentato, consentendo la marcatura fluorescente e il knockout genico mediato da CRISPR per studiare i circuiti neurali, la funzione genica e i...

Iniezione virale stereotassica per l'editing genico neuronale mirato nel cervello del topo

Fonte: Li, D., et al. Iniezione intratecale diretta di virus adeno-associati ricombinanti in topi adulti. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra la procedura per l'iniezione intratecale di virus adeno-associati (AAV) nel liquido cerebrospinale (CSF) di un topo sveglio, coprendo la preparazione della siringa, l'allineamento spinale e l'inserimento preciso dell'ago. Questo metodo convalida la somministrazione genica mirata, supportando il suo potenziale per le terapie del SNC.

Somministrazione intratecale di virus in un modello murino per il trattamento delle malattie del sistema nervoso centrale

Il sistema / Cas9 CRISPR offre il potenziale per fare l'editing genoma mirato accessibile e conveniente per la comunità scientifica. Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come creare virus che sarà ad eliminazione diretta di un gene di interesse utilizzando il sistema / Cas9 CRISPR, e poi iniettare stereotassica nel cervello di topo adulto.

Progettazione, Packaging, e consegna di alto titolo CRISPR Retro e lentivirus via Stereotassica iniezione

L'iniezione intraspinal di recombinase dipendente ricombinanti virus adeno-associato (rAAV) può essere utilizzato per manipolare qualsiasi tipo di cellula geneticamente etichettati nel midollo spinale. Qui descriviamo come trasduce neuroni nel corno dorsale del midollo spinale lombare. Questa tecnica consente funzionale interrogatorio del sottotipo del neurone manipolati.

Espressione del Transgene di mediata da Virus adeno-associato in neuroni geneticamente definiti del midollo spinale

Questo protocollo dimostra iniezione di un vettore virale retrogradely trasportabile nel tessuto del midollo spinale del ratto. Il vettore è preso alla sinapsi e trasportato al corpo cellulare dei neuroni bersaglio. Questo modello è adatto per l'analisi retrograda di importanti vie spinali o cellule targeting per applicazioni di terapia genica.

Iniezione diretta di un vettore lentivirale evidenzia più vie motorie del midollo spinale del ratto

Questo protocollo dimostra un nuovo metodo per applicare terapie geniche a sottopopolazioni di cellule in ratti neonatali in età postnatale 5-10 giorni iniettando un modificatore chemiogenetico anterogrado nella corteccia somatomotoria e una Cre ricombinasi retrogradamente trasportabile nel midollo spinale cervicale.

Targeting del tratto corticospinale nei ratti neonatali con un vettore doppio virale utilizzando la chirurgia combinata del cervello e della colonna vertebrale

Un'iniezione intratecale lombare rappresenta una via di somministrazione traslazionalmente rilevante per la somministrazione della terapia genica al sistema nervoso centrale. Questo protocollo standardizzato completo per le iniezioni intratecali lombari in topi e ratti neonatali, giovani e adulti mira a guidare i ricercatori nell'adozione di questa tecnica per gli studi preclinici di terapia genica.

Iniezione intratecale lombare di vettori di terapia genica per il targeting del sistema nervoso centrale in topi e ratti

Scopri l'iniezione stereotassica di vettori virali per la manipolazione genica condizionale nel midollo spinale del topo. Questa tecnica consente l'espressione genica mirata nel corno dorsale lombare per studi neuroscientifici.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

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