Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse
18 marzo 2013
Vettori virali per consentire la manipolazione genica mirata. Abbiamo dimostrato un metodo per l'espressione genica condizionale o ablazione nel midollo spinale topo, utilizzando iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale, un luogo di rilievo di contatto sinaptico tra afferenze somatosensoriali primarie e neuroni del sistema nervoso centrale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere un'espressione genica spazialmente ristretta nel midollo spinale del topo iniettando stereotassicamente un vettore virale nel corno dorsale lombare. Il primo passo della procedura consiste nell'individuare ed esporre la vertebra lombare. Il secondo passo consiste nel rimuovere la porzione dorsale della vertebra per rivelare il midollo spinale.
Una procedura chiamata laminectomia. Successivamente, una pipetta di vetro collegata a una micropompa a siringa viene posizionata sopra il corno dorsale e abbassata nel midollo spinale. Il passaggio finale consiste nell'iniettare lentamente la sospensione vettoriale.
Due settimane dopo, la trasfezione dei neuroni delle corna dorsali è dimostrata dall'espressione della proteina fluorescente verde, che consente di tracciare la distribuzione del virus. Questo metodo aiuta a chiarire la funzione dei neuroni in parte del percorso sensoriale. Lo usiamo in studi che si concentrano specificamente sullo sviluppo del dolore infiammatorio o neuropatico.
La dimostrazione visiva è fondamentale per imparare a posizionare il mouse nel frame stereotassico. È essenziale per il successo della procedura che la colonna vertebrale sia fissata correttamente perché la laminectomia è una tecnica così delicata. Martin Mole, uno studente laureato del mio laboratorio, dimostrerà la procedura.
John Wang, un assistente di ricerca, lo aiuterà uno o due giorni prima della procedura. Pul pipette in vetro per ottenere un diametro della punta di 40 micrometri e smussare la punta con un angolo di 20 gradi il giorno dell'intervento. Iniziare la procedura disinfettando l'attrezzatura chirurgica e preparando gli strumenti chirurgici sterili per impostare il telaio stereotassico.
Montare l'iniettore della micro siringa sul manipolatore e collegare il dispositivo. Collegare una delle pipette di vetro alla micro siringa utilizzando il raccordo a compressione. Ora rimuovi lo stantuffo dalla micro siringa.
Riempire la siringa con l'olio minerale, quindi reinserire lo stantuffo e spingerlo fino in fondo. Evitare accuratamente di creare bolle d'aria. Quindi inserire la micro siringa nel supporto sull'iniettore.
Quindi, rimuovere il virus dal congelatore e preparare la sospensione di particelle virali appena prima dell'uso diluendola con soluzione salina tamponata con fosfato sterile alla concentrazione di particelle desiderata. Pipettare cinque microlitri della sospensione virale su un piccolo pezzo di param. Quindi abbassare la punta della pipetta di vetro nella goccia e tirare lo stantuffo per riempire la micro siringa.
Alla fine. Creare una piccola bolla d'aria sulla punta della pipetta per evitare che si ostruisca. In questa fase, preparare l'area chirurgica strofinando la panca nel termoforo con disinfettante.
Quindi anestetizzare il topo mediante inalazione di fluoro. Successivamente, applicare il lubrificante su ciascun occhio per proteggerlo dall'essiccazione durante l'operazione Successivamente, radere la pelliccia dalla parte bassa della schiena al collo del topo. Disinfettare la pelle con salviette alternate di un antisettico topico, come clorexidina o iodio povidone, ed etanolo al 70%.
Quindi infiltrare il sito di incisione con bupivacaina allo 0,25% diluita da uno a 10 con soluzione fisiologica. Successivamente incisi la pelle all'estremità della gabbia toracica, da due a tre centimetri lungo la linea mediana e separare la fascia che copre la colonna vertebrale. Identificare la vertebra L uno, che si trova coccolata alla vertebra, tenendo l'ultimo paio di costole ed esporla rimuovendo i piccoli muscoli spinali e i legamenti attaccati alla sua superficie dorsale.
Quindi sollevare leggermente e tenere premuta la vertebra L uno con un paio di add e pinze. Successivamente, utilizzare una pinza per laminectomia dedicata per rimuovere la parte dorsale della vertebra, compreso il processo spinoso e la lamina per esporre il midollo spinale. Evitare di danneggiare la dura madre o il midollo spinale durante questa procedura.
Quindi trasferire il mouse su una piastra riscaldante nel telaio stereotassico e monitorare la temperatura del mouse durante l'operazione successiva. Ora usa le punte con tacca a V per stabilizzare la colonna vertebrale in modo che la vertebra non si muova durante la respirazione. Quindi, avvicinare la micro siringa in modo che la punta della pipetta si trovi sopra il sito della laminectomia.
Abbassare lo stantuffo fino a quando la sospensione virale non esce dalla pipetta. Rimuovere la gocciolina con una garza sterile. Quindi posizionare la punta della pipetta nella parte rostrale più ampia del midollo spinale esposto.
Centrare la pipetta sopra il solco mediano posteriore e spostare lateralmente il puntale di 500 micrometri. Dopodiché, abbassare la punta sulla superficie del cavo e forare la dura madre. Successivamente, abbassare la punta del bicchiere, pipettare 300 micrometri nel midollo spinale.
Iniettare un microlitro di sospensione virale alla velocità di 200 nanolitri al minuto. Al termine dell'iniezione, attendere almeno due minuti prima di ritrarre lentamente la pipetta. Ripetere la procedura di iniezione nella parte più grande del midollo spinale esposta per ottenere la distribuzione completa del vettore virale nel segmento spinale L quattro.
I due siti di iniezione sono situati rostralmente e coccolano il segmento L quattro. Per evitare danni ai tessuti nella regione bersaglio dopo il rilascio dell'iniezione, la vertebra L uno dalla tacca a V si blocca e rimuove il topo dal telaio stereotassico. Quindi, sutura la fascia con cinque oh Vicryl.
La fascia chiusa fornisce copertura per il sito della laminectomia. Quindi chiudere la pelle con punti di sutura in nylon o graffette chirurgiche. Fornire analgesia post-chirurgica per 72 ore con iniezioni sottocutanee giornaliere di carprofene a cinque milligrammi per chilogrammo.
Trasferisci il topo in una gabbia di recupero con lettiera morbida e non particolare. Posiziona il mouse su un lato per una respirazione confortevole. Quindi monitorare l'animale fino a quando non è completamente vigile.
Ambulanza e inizia a bere. Monitorare il recupero post-chirurgico mediante ispezione giornaliera per i primi tre giorni. Quindi a giorni alterni o tre giorni alla settimana fino al completamento dell'esperimento.
Da sette a 10 giorni dopo l'operazione, quando la guarigione della ferita è completa. Rimuovere le suture cutanee o le graffette. Questa figura mostra l'espressione della proteina reporter fluorescente verde potenziata o EGFP nel corno dorsale sinistro del midollo spinale L quattro.
Due settimane dopo l'iniezione stereotassica dei neuroni R-A-A-V-E-G-F-P sono stati immunocolorati per i nuclei neuronali Proteina mostrata in rosso Arrowhead. Indica le cellule gliali trasfettate sparse nella colonna dorsale. Circa l'80% dei neuroni nel corno dorsale mediale è stato infettato con la pratica.
La procedura può essere completata in 30-40 minuti e ricordarsi di mantenere le condizioni di sterilità durante la procedura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire iniezioni chimale intra pino nella dose ho del midollo spinale del topo. Stiamo utilizzando la tecnica per la manipolazione genetica, ma è possibile adattarla per altri scopi, come l'applicazione di farmaci intraspinali.
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Panoramica
Questo studio descrive un metodo per ottenere un'espressione genica spazialmente limitata nel midollo spinale del mouse mediante iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale lombare. Questa tecnica consente una manipolazione genica mirata, in particolare nelle aree di contatto sinaptico tra afferenze somatosensoriali primarie e neuroni del sistema nervoso centrale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Terapia Genica
- Ricerca sul Midollo Spinale
Sfondo
- I vettori virali sono utilizzati per la manipolazione genica.
- Il corno dorsale lombare è un sito significativo per le interazioni sinaptiche.
- L'espressione genica condizionale può contribuire alla comprensione dei meccanismi neurali.
- L'iniezione stereotassica è un metodo preciso per indirizzare regioni cerebrali specifiche.
Scopo dello studio
- Per ottenere un'espressione genica mirata nel midollo spinale.
- Per esplorare gli effetti della manipolazione genica sulla funzione del midollo spinale.
- Per fornire un quadro metodologico per la ricerca futura.
Metodi Utilizzati
- Individuazione ed esposizione della vertebra lombare.
- Esecuzione della laminectomia per accedere al midollo spinale.
- Utilizzo di una pipetta di vetro collegata a una pompa microsiringa.
- Iniezione della sospensione del vettore virale nell'elica dorsale.
Risultati principali
- Iniezione riuscita del vettore virale nel corno dorsale lombare.
- Espressione genica condizionale osservata nei neuroni bersaglio.
- Il metodo ha dimostrato efficacia per la manipolazione spazialmente ristretta.
- Potenziali applicazioni nello studio dei disturbi correlati al midollo spinale.
Conclusioni
- Il metodo consente una manipolazione genica precisa nel midollo spinale.
- È possibile utilizzarlo per indagare il ruolo di geni specifici nella funzione neuronale.
- Questo approccio potrebbe migliorare la nostra comprensione della fisiologia del midollo spinale.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La somministrazione stereotassica di vettori virali consente una manipolazione genica precisa e limitata a livello spaziale nel corno dorsale del midollo spinale del topo, una regione chiave per l'elaborazione sensoriale e la ricerca sui percorsi del dolore. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta nel campo delle neuroscienze, permettendo l'espressione genica condizionale o il silenziamento in popolazioni neuronali definite. Il metodo fornisce una piattaforma riproducibile per associare bersagli genetici a fenotipi funzionali nei modelli preclinici del dolore, fornendo indicazioni per decisioni di avanzamento o interruzione nella selezione dei bersagli.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche consentendo l'espressione genica condizionale in specifiche popolazioni di neuroni del midollo spinale.
- Valore operativo: Fornisce un approccio chirurgico standardizzato per un indirizzamento consistente al corno dorsale lombare in diversi studi.
- Valore predittivo: Supporta lo screening fenotipico della funzione genica nei percorsi del dolore, contribuendo alla valutazione della fiducia sul bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera metriche quantificabili di trasfezione (ad esempio, espressione di EGFP) per valutare l'efficienza del rilascio del vettore e la specificità cellulare.
- Valore operativo: Consente la preparazione di sistemi biologici validati per lo screening di composti o modulatori successivi in modelli del dolore.
- Scalabilità: La breve durata del procedimento (30–40 minuti) e il rapido recupero degli animali favoriscono un'elevata produttività nei flussi di lavoro di scoperta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella direttamente i meccanismi del dolore infiammatorio e neuropatico, in linea con le priorità dell'area terapeutica.
- Continuità traslazionale: Collega la modulazione del bersaglio nel midollo spinale a fenotipi comportamentali del dolore, supportando la validazione preclinica.
- Avanzamento proporzionato al rischio: Permette una riduzione del rischio meccanicistica isolando gli effetti specifici del gene in un circuito rilevante per la malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla validazione preclinica, in particolare per bersagli del sistema nervoso centrale coinvolti nell'elaborazione delle informazioni sensoriali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo la manipolazione genica localizzata in regioni definite del midollo spinale.
- Screening: Fornisce letture quantitative (ad esempio, intensità di fluorescenza, tassi di trasfezione specifici per cellula) per valutare le prestazioni del vettore e l'effetto biologico.
- Analisi: Permette di correlare l'efficienza di trasfezione con esiti funzionali, fornendo informazioni per valutazioni dose-risposta e di interazione con il bersaglio.
- Ricerca traslazionale: Collega la manipolazione genica del midollo spinale a fenotipi legati al dolore, sostenendo studi preclinici allineati ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma chirurgica riutilizzabile, adattabile a diversi vettori virali, promotori o transgeni in progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora l'affidabilità predittiva riducendo gli effetti fuori bersaglio e aumentando la precisione anatomica negli studi di manipolazione genica.
- Valore operativo: Favorisce la riproducibilità attraverso coordinate stereotassiche standardizzate, parametri di iniezione e cure postoperatorie.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento/cessazione fornendo chiarezza meccanicistica sulla funzione del bersaglio nei percorsi del dolore.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione basata sul rischio dei bersagli in base a fenotipi del midollo spinale validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia stereotassica su roditori, tecniche microchirurgiche ed esecuzione di procedure asettiche.
- Richiede strumentazione specializzata, tra cui un apparato stereotassico, una pompa per microsiringa e pipette di vetro smussate.
- Necessita di una preparazione standardizzata del vettore virale e della verifica del titolo per garantire un dosaggio costante tra esperimenti.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi segmenti del midollo spinale, sierotipi virali o carichi del transgene.
- I limiti pratici includono la variabilità chirurgica e la risposta del tessuto, che devono essere controllati mediante formazione dell'operatore e standardizzazione del protocollo.
