Silencing a lungo termine di Intersectin-1s in Polmoni mouse consegna ripetuta di un siRNA specifico tramite liposomi cationici. Valutazione degli effetti Knockdown al microscopio elettronico

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare gli effetti dell'inibizione a lungo termine dell'espressione di intersecting one s sulla struttura e la funzione dei polmoni del topo. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando complessi specifici di liposomi duplex INA per indirizzarli alla vascolarizzazione polmonare del topo come secondo passaggio. I complessi di liposomi INA vengono somministrati mediante iniezione retroorbitale, ripetuta ogni 72 ore per 24 giorni consecutivi al fine di ottenere un'inibizione efficiente dell'espressione di intersecting one S'S.

In seguito, il tessuto polmonare dei topi iniettati viene prelevato per analisi biochimiche e indagini al microscopio elettronico al fine di valutare i livelli della proteina e dell'mRNA di intersectina 1 e per eseguire analisi morfologiche approfondite dei polmoni. I risultati ottenuti mediante western blot dei lisati polmonari con anticorpi specifici per intersectina 1 e analisi Q-R-T-P-C-R mostrano un silenziamento specifico ed efficiente di intersectina 1 per 24 giorni consecutivi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle metodologie esistenti, come i rymers o i lentivirus, è che il rilascio nei polmoni di liposomi onici è riproducibile, sicuro, non tossico ed altamente efficace nell'endotelio polmonare.

L'idea iniziale di questo metodo è nata quando abbiamo deciso di valutare gli effetti dell'intersezione di N in vivo e quando altri metodi di somministrazione di SRNA si sono rivelati inefficaci. Per preparare i liposomi onic, aggiungere 315 microlitri di una soluzione madre di bromuro di dimetil dioctadecilammonio, o DOAB, in un pallone a fondo rotondo, seguiti da 200 microlitri di soluzione madre di colesterolo e da 9,5 millilitri di cloroformio, mescolando con movimenti rotatori. Collegare il pallone al rotavapor impostato a 37 gradi Celsius e a 100 o più rotazioni al minuto.

Aprire completamente la prima valvola per l'argon girandola in senso orario. Aprire e chiudere sempre prima questa valvola. La seconda valvola regola la pressione dell'argon che entra nel pallone.

Aprirlo parzialmente per garantire una pressione delicata. Una volta che la neve carbonica inizia a gocciolare sul tubo che collega la bombola di gas di Argonne al rotovaporatore, abbassare il rotovaporatore nel bagno d'acqua fino a quando il pallone tocca l'acqua senza essere completamente immerso. Regolare la manopola della velocità fino a 100-120 giri al minuto. Quando tutto il cloroformio presente nel pallone è evaporato, spegnere l'apparecchio.

Regolare la velocità del rotavapor a zero e chiudere le valvole della bombola di argon. Rimuovere il pallone. Aggiungere due millilitri di una soluzione di glucosio al 5% nel pallone per risospendere i lipidi.

Utilizzando una punta da un millilitro, raschiare accuratamente il fondo del matraccio per sciogliere tutti i lipidi. Incubare la soluzione ottenuta in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per un'ora, agitando lentamente il matraccio con un vortice. Sonicare la soluzione per almeno 20-30 minuti, tenendo il matraccio in verticale e con il fondo appena a contatto con l'acqua fredda nel bagno a ultrasuoni.

Successivamente, riscaldare il pallone nel bagno d'acqua del rotoevaporatore per 20 minuti a 42 gradi Celsius a velocità zero, con il fondo rotondo immerso nell'acqua. Filtrare i liposomi attraverso un filtro per siringa da 0,47 micron, seguito da un filtro per siringa da 0,22 micron. Utilizzando un piccolo estrusore, filtrare i liposomi attraverso una membrana da 50 nanometri per generare una popolazione omogenea di vescicole liposomiali unilamellari.

Trasferire i liposomi in una provetta eunor e porre sul ghiaccio. Preparare i complessi liposomi irna ITSN in un rapporto di otto moli di liposomi per due microgrammi di RNA. In questo esempio, 50 microlitri di I-A-I-T-S-N.

Da una soluzione madre di 50 micromolare viene aggiunto a 100 microlitri di liposomi appena preparati utilizzando un tubo EOR privo di A-R-N-A-D-N-A. Mantenere la miscela sul ghiaccio fino all'iniezione nei topi. I topi utilizzati in questo studio hanno un'età compresa tra quattro e sei settimane e pesano circa 25 grammi.

Verificare con la pressione sul dito del piede che l'animale sia completamente anestetizzato prima dell'iniezione. Le siringhe utilizzate sono siringhe tubercoliniche da un millilitro con l'ago applicato con una mano. Afferrare le orecchie del topo e girarlo su un fianco per esporre l'angolo interno dell'occhio.

Puntare medialmente rispetto ai semilunari di PIKA ed evitare di toccare il bulbo oculare. Avvicinarsi al caruncolo lacrimale dell'occhio con la siringa caricata a un angolo di 45 gradi su tutti e tre gli assi. Iniettare lentamente la miscela, quindi riportare il topo nella sua gabbia e lasciarlo riprendere con il lato iniettato verso l'alto.

Su. Il topo viene trattato con SIR NA mirato al gene ITSN uno ogni 72 ore per 24 giorni. Per iniziare questa procedura, verificare che il topo sia completamente anestetizzato attraverso l'assenza del riflesso di ritrazione. Iniziare con una laparotomia ed escindere il diaframma.

Quindi eseguire una toracotomia per esporre i polmoni e il cuore. Rimuovere il timo utilizzando un microscopio StereoZoom per una maggiore precisione. Cateterizzare l'arteria polmonare.

Successivamente, eseguire una tracheotomia e intubare il mouse utilizzando lo stomaco tracheale. Impostare il ventilatore su una frequenza di 150 movimenti al minuto e un volume corrente di 150 microlitri. Come via di uscita, aprire l'atrio sinistro utilizzando una pompa peristaltica regolata a 1,5 millilitri al minuto e soluzione di Hank riscaldata a 37 gradi Celsius.

Perfondere il circolo polmonare del topo privo di sangue per cinque minuti, seguito da una perfusione con il tracciante per 10 minuti. Dopo aver rimosso il tracciante non legato, eseguire la fissazione *in situ* dei polmoni mediante perfusione per 10 minuti con formaldeide al 4%, glutaraldeide al 2,5% e acido tannico all'1%. Raccogliere i polmoni ed eliminare i tessuti in eccesso.

Tagliare i polmoni in piccoli blocchi e trasferirli in un vial di scintillazione etichettato contenente due millilitri di una miscela fissativa. Per iniziare l'elaborazione del tessuto polmonare per la microscopia elettronica, lavare prima brevemente i blocchi polmonari tre volte in tampone sodio Cate 0,1 M.

Successivamente, fissare i campioni in aldeide 4% e glutaraldeide 2,5% in tampone 0,1 M di piperazina per un'ora a temperatura ambiente, quindi effettuare la postfissazione con osmio 1% per un'ora in cappa sotto ghiaccio e al buio, dopo aver sciacquato una volta con tampone cacodilato. Incubare i campioni in tampone cacodilato per due ore fino a tutta la notte a temperatura ambiente. Sciacquare una volta in etanolo 50% e quindi disidratare con una serie crescente di etanolo.

Eseguire un'incubazione in etanolo al 70% per cinque minuti, quindi in etanolo al 95% per cinque minuti e infine due volte in etanolo al 100% per 15 minuti ciascuna. Successivamente passare all'ossido di propilene al 100%, con due incubazioni di 15 minuti ciascuna.

Rimuovere l'ossido di propilene e aggiungere una miscela di 50% ossido di propilene e 50% epon. Incubare tutta la notte in rotazione su un ruotatore a temperatura ambiente. Al mattino seguente, rimuovere la miscela e aggiungere epon fresco. Incubare per almeno quattro-cinque ore sul ruotatore.

Aggiungere i campioni selezionati in stampi a doppia punta riempiti per metà con Epon fresco al 100% otto 12. Posizionarli ai bordi, trasferire gli stampi in un incubatore a 60 gradi Celsius e lasciarli polimerizzare per 48-72 ore. L'inibizione cronica dell'espressione di ITSN uno s per 21 giorni consecutivi, ottenuta mediante somministrazioni ripetute di complessi siRNA liposomiali contro ITSN uno s, determina livelli significativamente più bassi della proteina ITSN uno nei polmoni di topo, come mostrato in questi risultati rappresentativi: lisati polmonari ottenuti da un controllo non trattato e da topi trattati sono stati sottoposti a immunoblotting con anticorpi diretti contro ITSN uno e actina in diversi punti temporali dopo la somministrazione dell'RNAi, come indicato.

L'analisi densitometrica di film rappresentativi di blot ad alta intensità per CL e l'analisi quantitativa RT-PCR di mRNA di I TSN one s confermano ulteriormente che il trattamento con complessi liposomiali di siRNA per I TSN one s riduce in modo efficiente la proteina I TSN one s nei polmoni del topo. La riduzione dei livelli di intersectina 1 porta a un'endocitosi difettosa e alla compromissione del trasporto transendoteliale, alterando la barriera interendoteliale e causando edema polmonare. Questi micrografici elettronici rappresentativi di tessuto polmonare mostrano giunzioni interendoteliali aperte, o IJs, marcate lungo tutta la loro estensione da particelle d'oro-albumina di otto nanometri.

Il pannello A1 è un ingrandimento del pannello A; le frecce indicano tre o quattro particelle d'oro di albumina localizzate vicine l'una all'altra nello stesso piano, a indicare l'ampia apertura dell'IEJ. Particelle d'oro sono inoltre associate all'uscita abluminale degli IJ, indicata dalle frecce nei pannelli A1 e B. Si noti anche il numero limitato di CVE A e la dilatazione dello spazio pericapillare indicata dall'asterisco nel pannello, un downregolazione acuta dell'espressione di intersectina 1, con attivazione di vie di trasporto alternative per compensare la carenza di endocitosi.

Queste immagini di microscopia elettronica mostrano anelli membranosi nei pannelli A e A', tubuli pleomorfi nel pannello B ed endosomi ingranditi fusi con tipiche cve LA nel pannello C, attivamente coinvolti nell'assorbimento e nel trasporto di albumina-oro. Si osservano inoltre una marcata dilatazione dello spazio perivascolare e un edema proteaceo. L'inibizione prolungata dell'espressione di intersectina-1 per 24 giorni riduce l'edema polmonare nei topi, ripristinando parzialmente l'integrità della barriera interendoteliale.

Gli studi morfologici al microscopio elettronico hanno mostrato che il tracciante di albumina dorata di otto nanometri non poteva penetrare nell'IEJ in questo punto temporale, formando invece residui di filtrazione nell'introito luminale della giunzione, indicati dalla freccia. Tuttavia, gli spazi perivascolari o PVS mostravano un certo grado di dilatazione e un edema lieve, suggerendo che le giunzioni sono impermeabili a particelle di questa dimensione, ma che corpuscoli multivescicolari leggermente permeabili, localizzati in prossimità della membrana plasmatica, presentano alcune delle loro piccole vescicole interne marcate da particelle di albumina dorata di otto nanometri. Questa tabella mostra il numero di strutture endocitiche trans-citoplasmatiche nei controlli e nei topi con carenza di endotelio polmonare.

Un risultato significativo è la diminuzione delle caveole nell'endotelio polmonare di topi carenti di ITSN1. L'inibizione cronica dell'espressione di intersectina 1 ha causato l'attivazione di vie citoplasmatiche endocitiche alternative e una parziale riduzione del numero di caveole, nonché del numero di anelli membranosi o di tubuli marcati da particelle d'oro con albumina. Nell'endotelio polmonare di topi carenti cronici di ITSN1, il numero di queste strutture è aumentato di 14 volte rispetto ai controlli.

Seguendo questa procedura, altri metodi come Eliza possono essere applicati su lisati di polmone di topo al fine di stimare quantitativamente il trasporto transendoteliale di diversi traccianti hnic. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come somministrare in modo specifico complessi di liposomi onici e SRNA all'endotelio polmonare di topo per silenziare la proteina di interesse e valutarne la funzione.