GST-la sua purificazione: A Two-step Affinity Purification protocollo Cedendo Full-length proteine ​​purificate

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere una proteina di interesse altamente purificata e di lunghezza intera. Questo risultato si ottiene producendo un baculovirus ricombinante, utilizzato per infettare cellule di insetto SF9 al fine di ottenere una versione marcatata con due etichette della proteina di interesse, altamente espressa e solubile. Viene quindi effettuata una purificazione a due passaggi per affinità, caratterizzata dalla purificazione della proteina marcata con glutathione S-transferasi, seguita da cromatografia di affinità per metalli.

Il risultato della purificazione è una proteina marcatata con istidina altamente pura. Successivamente, i campioni di proteina purificata vengono dializzati per garantire basse concentrazioni di sale nel buffer di conservazione. I risultati ottenuti mostrano la solubilità dell'espressione, la quantità e la qualità della proteina in base alla colorazione totale delle proteine su un gel SDS-PAGE.

L'idea di questo metodo è nata quando abbiamo avuto difficoltà nella purificazione di proteine grandi e instabili come PAL B due e BOC due. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la purificazione per affinità in un unico passaggio, consiste nel fatto che, nel nostro protocollo di purificazione per affinità in due passaggi, la proteina ottenuta è altamente pura e generalmente priva di prodotti di degradazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia proteica, come ad esempio le funzioni biochimiche delle proteine ricombinanti purificate.

Questo protocollo inizia con la produzione del virus ricombinante bao, seguita dalla selezione del virus BA più efficiente come descritto nel protocollo testuale per l'infezione. Preparare un recipiente per coltura in agitazione contenente da 0,75 a 1,0 volte 10 alla sesta cellule SF nine in 500 millilitri di mezzo, con un rapporto di uno a 150 tra virus e mezzo. Posizionare lo spinner sotto una cappa a flusso laminare e infettare le cellule aggiungendo il volume necessario di sospensione del virus baula nella sospensione cellulare attraverso uno dei bracci dello spinner.

Lasciare crescere le cellule infette in sospensione a 27 gradi Celsius e raccogliere le cellule quando viene raggiunta la massima espressione proteica, che viene determinata al momento della scelta del virus maculare più efficiente. Dopo aver raccolto le cellule, lisare le cellule SF9 che esprimono la proteina di interesse in circa 20 millilitri di buffer di legame GST, integrato con inibitori delle proteasi, in un bagno di ghiaccio e acqua. Omogeneizzare la soluzione 20 volte con un omogeneizzatore a siringa, quindi sottoporla a sonica per tre cicli di 32 secondi, prima di omogeneizzare nuovamente 20 volte. Successivamente, centrifugare il lisato cellulare a 18.000 giri al minuto per 30 minuti a quattro gradi Celsius e conservare il soprannatante. Incubare il lisato cellulare solubile con un millilitro di perle GST prelavate per un'ora a quattro gradi Celsius sotto leggera rotazione.

Il tempo di incubazione deve essere ottimizzato in base alla stabilità della proteina e all'efficienza di legame dopo il binding. Eseguire una rapida centrifugazione a 700 giri/min e rimuovere il soprannatante contenente le proteine non legate. Lavare le proteine legate al GST con il buffer di lavaggio per GST.

Ripetere questo processo due volte dopo l'ultimo lavaggio. Rimuovere il maggior quantitativo possibile di sopranatante. Quindi incubare le perle con ATP cinque millimolare e cloruro di magnesio 15 millimolare in 10 millilitri di buffer di legame GST per un'ora a quattro gradi Celsius per evitare il legame non specifico delle proteine da shock termico dopo l'incubazione.

Lavare le perle tre volte con il buffer di lavaggio GST. Dopo aver centrifugato le perle GST e rimosso il sopranatante, lavare le perle GST con il buffer P cinque. Successivamente, dividere le perle GST in frazioni di 100 microlitri e aggiungere quattro a otto unità di enzima Precision diluite in 100 microlitri di buffer P cinque.

Incubare le perle di GST con l'enzima da tre ore a tutta la notte a quattro gradi Celsius sotto rotazione delicata. Il tempo di incubazione deve essere ottimizzato in base al peso molecolare e alla stabilità della proteina dopo il taglio. Eseguire una breve centrifugazione e raccogliere il soprannatante.

Aggiungere 100 microlitri di tampone P cinque alle perle. Quindi ripetere, centrifugare e raccogliere il sopranatante due volte. Raccogliere tutte le frazioni.

Dividere l'EIT in tre frazioni da un millilitro e incubare ciascuna con 100 microlitri di perle secche di resina affinità per metallo talon preriscaldate per un'ora in rotazione, dividendo l'eluizione in diverse frazioni, aumenta l'efficienza di legame e di lavaggio. Lavare quindi la resina per cinque minuti con tampone P 30 a quattro gradi Celsius con rotazione delicata. Dopo aver ripetuto il lavaggio due volte, raccogliere le perle in un singolo tubo per eluire la proteina purificata.

Aggiungere il buffer P 500 alla resina Talon legata alla proteina. Aggiungere un rapporto volume/volume di buffer rispetto alle perle pari a uno a uno. Incubare la sospensione per cinque minuti sotto rotazione.

Ripetere questo passaggio due volte, mantenendo ogni frazione eluita separata per la conservazione della proteina purificata. Dializzare la proteina contro un opportuno tampone di conservazione due volte per un'ora a quattro gradi Celsius sotto agitazione.

È importante verificare la presenza di precipitato della proteina purificata durante la dialisi. Preparare aliquote piccole della proteina purificata e congelarle su anidride carbonica solida per 30 minuti. Conservare le aliquote a meno 80 gradi Celsius ed evitare ripetuti cicli di scongelamento e congelamento.

Analizzare il processo di purificazione caricando circa da 20 a 40 microlitri di ciascuna frazione su un gel SDS-PAGE. Dopo aver eseguito il gel, colorarlo con blu di Kumasi o con un colorante per proteine per la visualizzazione; i lisati cellulari solubili e totali ottenuti da cellule SF9 infettate con il virus valo ricombinante REC14 o infettate fittiziamente come controllo sono stati analizzati mediante colorazione con blu di Kumasi, permettendo di confermare l'espressione della proteina GST-RE14-His durante il processo di purificazione. Sono stati analizzati numerosi campioni per seguire l'efficienza del metodo, mediante l'analisi di questi campioni con blu di Kumasi.

La colorazione mostra che durante il primo passaggio di purificazione, GST Rec 14 si è legato correttamente alle perle GST con un peso molecolare apparente di circa 50 chilodalton, dovuto alla fusione di rec 14 con GST dopo il taglio di precisione con G-S-T-G-S-T; Rec 14 hiss libero migra intorno ai 37 chilodalton. Mentre il GST scisso può essere visualizzato sulle perle GST, nonostante una parte di GST Rec 14 libero rimanga ancora legata alle perle GST, si è ottenuto un notevole arricchimento di Rec 14 hiss. Questo passaggio potrebbe essere migliorato aumentando il tempo di incubazione della proteina con la proteasi di precisione. L'analisi di Rec 14 hiss legato a perle Talon, rispetto alle proteine eluite dopo il passaggio di purificazione GST, mostra che una frazione consistente di Rec 14 hiss si lega alle perle Talon.

Dopo diversi lavaggi, il rec 14 hiss è stato eluso e raccolto; sono state eseguite tre illusioni. L'analisi ha rivelato un'elevata purezza del rec 14 hiss e la concentrazione maggiore di rec 14 hiss nella prima comparazione elluciana delle frazioni eluse rispetto ai talloni delle perle dopo che Ellucian ha illustrato l'efficienza dell'illusione. Poiché solo una piccola quantità di rec 14 hiss può essere rilevata come legata alle perle.

Questi campioni sono stati inoltre sottoposti ad analisi del sangue tramite Western blot con anticorpi anti-GST e anti-hiss al fine di tracciare REC 14. Durante l'intera procedura, il blot anti-GST mostra che alcune proteine GS TRE 14 e GST da solo erano presenti nelle proteine ottenute dal passaggio di purificazione GST e che i contaminanti sono stati rimossi mediante il passaggio di purificazione per affinità al tag hiss. Questo blot rivela che GST è stato efficacemente rimosso da re 14 grazie al trattamento con precisione e al passaggio di purificazione con il tag hiss.

Il blot anti hiss mira a rilevare Rec 14. Questo blot conferma che GST Rec 14 hiss e REC 14 hiss non sono stati completamente scissi ed eliminati dalle perle GST. Inoltre, a concentrazione elevata, REC 14 sembra aggregarsi.

In sintesi, i risultati presentati dimostrano l'efficienza della purificazione GST hiss per l'isolamento della S palm B rec 14. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come recuperare una proteina ricombinante altamente purificata. Una volta padroneggiata.

Questa tecnica può essere eseguita entro 12 ore dalla degenerazione dell'acido lisozimico solubile, se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavorare rapidamente e rigorosamente a quattro gradi Celsius per evitare la degradazione delle proteine. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come saggi di precipitazione congiunta o spettrometria di massa per rispondere ad ulteriori domande, come l'identificazione di partner proteici o le modifiche post-traduzionali della proteina di interesse.

Sebbene utilizziamo questo metodo per il DNA, la strategia relativa alle proteine di riparazione potrebbe essere modificata per studiare la funzione delle proteine in altri settori della ricerca.