La specifica di telencefalici neuroni glutamatergici di cellule staminali umane pluripotenti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare neuroni cefalici da cellule staminali embrionali umane o cellule staminali staminali H passando attraverso checkpoint simili a quelli osservati durante lo sviluppo umano. Ciò si ottiene consentendo prima alle HSC di differenziarsi spontaneamente in sospensione nel terreno HESC, e poi trasferendole nel mezzo di induzione neurale per differenziarsi in modo più selettivo. Successivamente, i corpi embrionali o gli aggregati di PSC possono attaccarsi su piastre trattate con coltura tissutale dove le cellule si espandono e si differenziano in un monostrato.

Con i centri che formano cellule neuroepiteliali morfologicamente simili alle cellule chilometriche. Successivamente, le cellule neuroepiteliali vengono isolate e poste in colture in sospensione dove formano neurosfere. Infine, le neurosfere vengono placcate su vetrini coprioggetti dove possono differenziarsi ulteriormente.

In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano i tipi specifici di neuroni formati attraverso l'immunocolorazione o l'elettrofisiologia. Le implicazioni di questa tecnica si estendono a un'ampia varietà di malattie geneticamente ereditate perché i neuroni specifici del paziente possono anche essere generati da cellule staminali pluripotenti indotte, dove il meccanismo d'azione e le potenziali terapie possono essere chiarite. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sullo sviluppo di sottotipi di neuro cefalici talon da cellule staminali pluripotenti.

Può anche essere applicato ad altri sistemi come le malattie umane legate ai neuroni cefalici dell'artiglio Per generare aggregati di cellule staminali pluripotenti umane iniziare coltivando cellule staminali pluripotenti umane su alimentatori di fibroblasti embrionali di topo in mezzo HESC integrato con FGF di base per cinque o sette giorni, le colonie saranno grandi, ma ancora indifferenziate. Quando le colonie hanno raggiunto lo stadio corretto in una provetta da 50 millilitri. Preparare una soluzione di un milligrammo per millilitro di recipienti in terreno D-M-E-M-F 12 secondo il protocollo di testo.

Aspirare il terreno dalle celle e poi sciacquarle una volta con D-M-E-M-F 12. Dopo aver rimosso il lavaggio, aggiungere un millilitro di svuotamento a ciascun pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Al segno dei tre minuti, controlla al microscopio se i bordi arricciati sembrano un po' più scuri.

Se necessario, incubare le cellule più a lungo. Quando le cellule sono pronte, rimuovere la soluzione di dasi e lavare le cellule una volta con D-M-E-M-F 12 prima di sostituire il lavaggio con 1,5 millilitri di terreno HESC per staccare e rompere le cellule. Posizionare la punta di una pipetta di vetro da 10 millilitri sulle cellule verso la parete inferiore destra di un pozzetto e, con un piccolo movimento su e giù, spostarsi attraverso il pozzetto verso l'altro lato prima di tornare nella direzione opposta.

Una volta che tutte le celle sono in sospensione, metterle in provette da 15 millilitri e centrifugarle a 200 G per due minuti prima di rimuovere il terreno dal pellet. Utilizzando il terreno HESC, trasferire le cellule in un pallone per la coltura. Ad esempio, per le cellule provenienti da sei pozzetti di HSC, utilizzare un pallone T 75 con 50 millilitri di HESC. Medio.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 12 ore. Successivamente, per rimuovere eventuali detriti cellulari, trasferire le cellule e il terreno in una provetta da 50 millilitri e lavare le cellule una volta prima di trasferirle con 50 millilitri di terreno fresco in un nuovo pallone. Continua a nutrire le cellule in questo modo fino al quinto giorno.

Il quinto giorno, centrifugare le cellule e trasferirle in un nuovo pallone T 75. Con 50 millilitri di terreno di induzione neurale o NIM, incubarli per due o tre giorni sostituendo metà del NIM ogni giorno dopo la piastra di incubazione, le cellule utilizzando laminina o FBS per aiutarle ad attaccarsi alle piastre per la piastra. Usando FBS, aggiungi 1,5 millilitri di terreno con celle a ciascuno.

Agitare delicatamente la piastra per distribuire gli aggregati e lasciare che le cellule si attacchino durante la notte. A 37 gradi Celsius del giorno successivo, sostituire tutto il terreno con due millilitri di NIM per pozzetto. Dopo un giorno o due di incubazione, ogni aggregato si diffonderà per formare un monostrato e nel giro di un paio di giorni, i centri della maggior parte di queste cellule appariranno morfologicamente simili alle cellule di Columer.

Intorno ai giorni 14-17 le cellule del colon appariranno più compatte. A volte le cellule formano creste o anelli con un lume visibile all'interno. Prima di isolare le cellule, esaminarle per verificare la presenza di eventuali cellule epiteliali non UE e utilizzare la punta di una pipetta per raschiarle.

Per isolare le cellule neuroepiteliali che si trovano al centro delle colonie. Utilizzare una micropipetta e una pipetta filtrata sterile da un millilitro per applicare pressione al centro della colonia in modo che si sollevi. Fare attenzione a non lasciare che anche la parte esterna della colonia si stacchi.

Trasferire due piastre di cellule isolate in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 200 g per due minuti. Dopo aver rimosso il terreno, trasferire le cellule in un pallone T 25 non trattato con colture tissutali contenente 10 millilitri di NIM. Con l'aggiunta di B 27 incubare durante la notte del giorno successivo, le cellule dovrebbero avere un aspetto sferico.

A volte anche le cellule periferiche vengono isolate e di solito si attaccano al fondo del pallone. In tal caso, trasferire le cellule sferiche in un nuovo pallone, lasciando le cellule attaccate dietro la coltura. Le neurosfere e la sospensione per una settimana in NIMB 27 per promuovere la resistenza e la proliferazione cellulare.

Aggiungi l'A MP ciclico e il fattore di crescita insulino-simile uno. Alla fine della settimana, le neurosfere conterranno progenitori cefalici e saranno pronte per essere placcate su vetrini coprioggetti per la differenziazione terminale. Per preparare i vetrini di copertura rivestiti di lamina poliuretanica in 24, le piastre dei pozzetti iniziano rivestendo i vetrini di copertura puliti con una soluzione di poliuretano da 0,1 milligrammi per millilitro a 37 gradi Celsius durante la notte per rivestire i vetrini di copertura con laminina a 50 microlitri di 20 microgrammi per millilitro di laminina nella differenziazione neurale.

Da inviare medio ad ogni vetrino di copertura trattato in poliuretano. Facendo attenzione a che il liquido tocchi solo il vetrino stesso. Incubarli a 37 gradi Celsius per una o due ore.

Dopo l'incubazione della laminina, raccogliere e lavare le neurosfere in D-M-E-M-F 12. Se le cellule sono troppo grandi per attaccarsi correttamente, aggiungere circa due millilitri di Accutane e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, aggiungere un volume uguale di inibitore della tripsina e dopo la centrifusione le cellule a 200 G per tre minuti, sostituire la soluzione con NDM e utilizzare un P 200 per rompere le cellule in piccoli cluster.

Posizionarli su vetrini coprioggetti pre-rivestiti, aspirare la maggior parte del terreno e trasferire le cellule in una capsula di Petri da sei centimetri in poche gocce di terreno in modo che la selezione diventi più facile senza rimuovere la laminina dai vetrini coprioggetti pre-rivestiti. Trasferisci circa quattro o cinque neurosfere in ciascuna. Lasciare che le neurosfere si attacchino per almeno due-quattro ore prima di aggiungere 0,5 millilitri di terreno di neurodifferenziazione integrato con B 27 ciclico.

Un MP e fattori neurotrofici sostituiscono metà del mezzo a giorni alterni. Le celle possono essere mantenute per diversi mesi come mostrato qui. Questo protocollo descrive come differenziare le PSC umane in neuroni glutammatergici cefalici astragali attraverso diversi passaggi critici.

La formazione di PSC aggrega l'induzione di cellule neuroepiteliali, la generazione di progenitori cefalici talon e la differenziazione terminale di questi progenitori in neuroni cefalici talon. Questo sistema è robusto ed efficiente nella generazione di neuroni cefalici, progenitori e glutammatergici, ad esempio. Senza l'aggiunta di fattori di identificazione, le HSC si sono differenziate in base al lignaggio neurale e 24 giorni dopo la differenziazione.

La maggior parte dei precursori neurali erano positivi per Fox G one, fattore di trascrizione A espresso dal cephalon, ma negativi per HOKs B four, marcatore A per le cellule del cervello posteriore e del midollo spinale, suggerendo che i progenitori cefalici teloni sono stati generati con successo. Questi progenitori teloni cefalici possiedono un fenotipo dorsale come indicato dall'espressione di PAC sei. Un marcatore espresso dai progenitori dorsali, ma non NK X 2.1 Un marcatore per i progenitori ventrali.

A seguito di un'ulteriore differenziazione, questi progenitori dorsali cefalici si sono differenziati in neuroni glutammatergici, che erano positivi per il marcatore glutammatergico. I neuroni TBR 1 che sono risultati positivi per TBR 1 erano positivi anche per i marcatori neuronali beta tre, tubulina o mappa due. Queste cellule esprimevano anche il trasportatore vescicolare del glutammato uno o V glut one, un marcatore per i neuroni glutammatergici maturi che suggerisce l'efficiente generazione di neuroni glutammatergici cefalici talon nella coltura.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'elettrofisiologia per rispondere a ulteriori domande, come se questi neuroni possano stabilire connessioni sinaptiche con altre cellule. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione. Ha dovuto differenziare le cellule staminali pluripotenti umane e in neuroni glutammatergici cefalici attraverso diversi passaggi critici.

La formazione di cellule staminali pluripotenti aggrega l'induzione di cellule neuroepiteliali, la generazione di progenitori cefalici e la differenziazione terminale di questi progenitori in neuroni cefalici.