Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

Generare macrofagi derivati dal midollo osseo per l'analisi della polarizzazione. Le ossa del femore e della tibia vengono isolate dai topi e le cellule del midollo osseo vengono raccolte. Le cellule vengono quindi coltivate in un terreno contenente fattori di crescita per indurre la formazione di macrofagi.

Dopo sette giorni di coltura, i macrofagi derivati dal midollo osseo vengono trattati con vari stimoli e macrofagi polarizzati. Le risposte di attivazione sono analizzate mediante citometria a flusso, PCR in tempo reale e risultati dell'analisi western blos che mostrano un'elevata purezza dei macrofagi derivati dal midollo osseo con risposte di attivazione polarizzate a M1 o M due. Gli stimoli mentono.

L'implicazione di questa tecnica è la posizione verso la terapia o la diagnosi della malattia associata alla diversità, tra cui l'insulino-resistente e le CRO perché i macrofagi infiltranti T sono i principali attori in questo contesto, la dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché l'accelerazione della cellula del midollo osseo è alquanto difficile e la resa è fondamentale per ottenere una preparazione cellulare di studio sufficiente per indurre la formazione di macrofagi Lavorare in una cappa sterile. Inizia questo protocollo con ossa del femore e della tibia isolate da topi di sei-otto settimane in un piatto di coltura tissutale. Sciacquare le ossa in PBS, quindi utilizzare le forbici per tagliare entrambe le estremità delle ossa, facendo attenzione a non rimuoverne troppo mentre si tiene l'osso con una pinza.

Inserire un ago calibro 21 su 23 con una siringa da 10 millilitri contenente PBS freddo con FBS attivato dal riscaldamento al 2% in un'estremità dell'osso. Premere lo stantuffo per far scorrere il midollo in una nuova piastra di coltura tissutale. Quindi, passa il midollo attraverso lo stesso ago da quattro a sei volte per dissociare le cellule.

Quindi versare le cellule in un colino da 70 micron per rimuovere grumi cellulari, ossa, capelli e altre cellule o tessuti. Raccogliere il flusso in un tubo conico da 50 millilitri. Una volta che la soluzione è passata attraverso il filtro, aggiungere tre volumi di cloruro di ammonio allo 0,8% al flusso e incubare su ghiaccio per 10 minuti.

Per rimuovere i globuli rossi dopo l'incubazione, centrifugare le cellule a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, risospendere il pellet della cella in 20-50 millilitri di PBS freddo con il 2% di FBS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Far girare le celle a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver versato il supinato. Procedere con l'induzione della formazione di BMDM come descritto nella sezione successiva del protocollo Per indurre la formazione di BMDM Resus, sospendere le cellule isolate del midollo osseo nel terreno di crescita del BMDM a una concentrazione di due volte.

Centrare le sei cellule per millilitro di seme una o due volte 10 alle sei cellule in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a sei o 12 pozzetti e incubare le cellule a 37 gradi Celsius. La semina a questa concentrazione faciliterà il distacco per la citometria a flusso dopo tre giorni. Passare al terreno di crescita BMDM fresco il settimo giorno.

La formazione di BMDM maturo viene valutata utilizzando l'analisi della citometria a flusso e gli anticorpi coniugati al fluorolo per rilevare le cellule che esprimono CD 11 B e F 4 80. Dopo aver verificato la formazione di BMDM maturo, il passaggio al mezzo di eco modificato di Cove is A C con il 10% di FBS e LPS o LPS e interferone gamma per l'attivazione di M1 o IL quattro o IL 13 per l'attivazione di M due. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius dopo 24 ore.

Raccogli gli MDM b stimolati staccandoli dal piatto. Per fare ciò, rimuovere il terreno dalle cellule e lavare con PBS senza calcio o magnesio. Quindi aggiungere caldo 0,05% di tripsina contenente 0,48 millimolari, incubare EDTA a 37 gradi Celsius per non più di 10 minuti per evitare la perdita di proteine superficiali a causa di una digestione eccessiva.

Quindi lavare le cellule due volte con PBS contenente il 10% di FBS e trasferirle in provette da 1,2 millilitri. Utilizzare gli anticorpi per rilevare l'espressione degli antigeni della superficie cellulare, tra cui CD 11, BF four, 80, CD 11 C, CD 2, 0, 6, CD 69, CD 80 o CD 86 in vari punti temporali. Utilizzando procedure standard di colorazione con citometria a flusso mediante PCR quantitativa.

Determinare i livelli di espressione di IL uno, beta, TNF alfa e IL sei per valutare l'attivazione di M1 o IL 10, IL 13, arginasi uno e PPAR gamma per valutare l'attivazione di M due. Infine, eseguire il western blotting per valutare l'attivazione delle vie di segnalazione cellulare coinvolte nell'attivazione di M1 o M, due macrofagi per valutare la purezza del BMDM maturo. Dopo l'induzione, è stata eseguita un'analisi citofluorimetrica utilizzando anticorpi contro CD 11, BF, quattro, 80, CD 11, C e CD 2, 0, 6 B.I MDM sono stati prima controllati su FSC e SSC per rimuovere DRI e coniugati.

Gli MDM maturi b sono stati definiti come CD 11 B positivi F quattro sottopopolazioni 80 positive, che si vedono in alto a destra di questo grafico e hanno compromesso dal 95 al 99% della popolazione recintata per valutare la polarizzazione dei macrofagi. Sono state eseguite ulteriori analisi. Il primo gating è stato eseguito per identificare i macrofagi infiltrati nel tessuto, che sono cellule CD 11 B positive F quattro 80 positive.

Tra questi macrofagi M1, che sono CD 11 C positivi e CD 2 0 6 negativi appaiono nel quadrante due, mentre M due macrofagi, che sono CD 11 C negativi e CD 2 0 6 positivi appaiono nel quarto quadrante. Per valutare l'attivazione dei macrofagi, le cellule sono state incubate con LPS per indurre l'attivazione di M1 o IL quattro per l'attivazione di M due. Dopo l'attivazione, la dimensione dei macrofagi è aumentata, come evidenziato dallo spostamento di FSCA di M1 o M due macrofagi a 24 ore dopo la stimolazione rispetto a M zero non trattato.

Dopo la stimolazione sono stati analizzati anche i marcatori di superficie correlati all'attivazione dei macrofagi. I marcatori di risposta precoce CD 69 sono stati valutati cinque o 24 ore dopo la stimolazione, i marcatori CD 80 e CD 86 sono stati analizzati a 48 ore dopo la stimolazione. Come mostrato qui, è stato osservato un aumento dell'abbondanza di superficie di CD 69, CD 80 e CD 86 nei macrofagi stimolati per valutare l'attivazione classica e alternativa dei macrofagi.

Quelli stimolati con LPS o IL 4 per 24 ore sono stati raccolti e l'RNA totale è stato estratto per l'analisi mediante PCR quantitativa in tempo reale, come mostrato qui. Un'elevata espressione di arginasi uno e PPAR gamma sono state rilevate nei macrofagi M 2 rispetto all'espressione di citochine pro-infiammatorie nei macrofagi non trattati. L'interleuchina uno beta TNF alfa è aumentato nei macrofagi M1 per valutare l'attivazione della via NF kappa B da parte degli anticorpi LPS contro P 65 e P 65 correlato al fosfo sono stati utilizzati nell'analisi western blot, come mostrato qui.

Una banda più forte contro la P 65 fosforilata si osserva con il trattamento con LPS. Insieme, questi dati indicano macrofagi derivati dal midollo osseo con risposte di attivazione polarizzate agli stimoli M1 o M due. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare macrofagi derivati dal midollo osseo, seguiti dall'analisi dell'attivazione polarizzata.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di valutare la purezza dei macrofagi differenziati prima di testarne la risposta. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire un metodo come la trasfezione transitoria dei geni o SHRA per rispondere a ulteriori domande come: in che modo i geni sono coinvolti nella regolazione dell'attivazione dei macrofagi?