Name: Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Impara la consegna diretta di farmaci nel sistema nervoso centrale di roditori mediante catetere con pompa osmotica o iniezione nel ventricolo laterale destro. Questo protocollo dimostra l'efficacia degli oligonucleotidi antisenso.

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Vorremmo ringraziare Curt Mazer da Isis Pharmaceuticals per fornire consulenza di pertinenza della chirurgia ICV bolo, così come Isis Pharmaceuticals nel suo complesso per fornire il nostro laboratorio su ASOS. Inoltre, vorremmo ringraziare Carey Shaner per la revisione di questo articolo. TMM e SLD sono sostenute da sovvenzioni NIH P50AG005681, K08NS074194 e R01NS078398.

Il protocollo seguito è stato approvato dalla cura degli animali Istituzionale e utilizzare i comitati alla Washington University di St. Louis ed è in conformità con il National Institutes of linee guida di salute per l&#39;uso di animali da laboratorio. Se questa è la prima volta che l&#39;esecuzione di interventi chirurgici, si consiglia guardando l&#39;articolo JoVE su interventi chirurgici di roditori come introduzione prima di iniziare 14. ASO possono essere consegnati al sistema nervoso centrale del mouse sia attraverso infusione pompa osmotica e una singola iniezione in bolo ICV. A causa di questo, la procedura descritta di seguito è suddiviso in due segmenti. Pro e contro di ciascun metodo verranno toccati nella sezione Discussione. Le coordinate utilizzato nei protocolli sono per adulti C57BL6 e B6C3 topi. Coordinate ratto corrispondenti si trovano nella tabella 1. Alzet pompa osmotica 1. Preparazione di Alzet Pompe osmotici <ol><li> Stabilire un drap sterileE e rilasciare attentamente le seguenti voci su di esso facendo attenzione a non toccare direttamente tutto pur di mantenere la sterilità: pompa osmotica (s), modulatore di flusso (s), 1 ml siringa sterile (s), bisturi, e le sezioni di tubo (1 pezzo di tubo = 5 pompe). Per i topi, ci sono tre opzioni per le pompe: 14 giorni, 28 giorni, e 42 giorni (Figura 2A). </li><li> Stappare e riempire sterili provette coniche da 50 ml con soluzione fisiologica ml 15-20. Fino a 6 pompe assemblate possono essere aggiunti per ogni tubo conico. </li><li> Riempire un piatto p60 Petri con il 100% di etanolo. Aggiungere il numero appropriato di cateteri a etanolo. Per i topi, la lunghezza del catetere è di 2,5 mm. </li><li> Filtrare ogni ASO in tante provette da 1,5 ml Eppendorf, se necessario. Include un tubo Eppendorf riempito con soluzione fisiologica 0,9% sterile per riempire il tubo con. </li><li> Una volta che tutto è pronto, indossare guanti sterili. Assicurarsi di non toccare nulla che non sia sterile. Cambiare i guanti se necessario. </li><li> Per ogni ASO da utilizzare, riempire una siringa da 1 mle loadpumps posizionando l&#39;ago nel foro superiore e lentamente riempiendo fino perdite in eccesso fuori. Continuare fino a quando tutte le pompe sono riempiti. </li><li> Stappare le flow-modulatori e inserire nelle pompe. Spingere il flusso-modulatore quasi tutto il modo in, lasciando un&#39;apertura di mm 3-5. </li><li> Utilizzando la lama del bisturi, tagliare ogni pezzo di tubo in 5 segmenti uguali. Prendere un pezzo di tubo, riempire con soluzione salina sterile utilizzando una siringa da 1 ml, ed inserire la parte superiore del modulatore di flusso in una estremità del tubo. Poi prendere una cannula da etanolo e collegarlo all&#39;altra estremità del tubo. La pompa è montata. </li><li> Collocare la pompa completamente assemblato nella sterile da 50 ml tubo conico con soluzione fisiologica per l&#39;innesco. L&#39;adescamento consente per le pompe ad assorbire fluido di avviare il rilascio di farmaci e venire alla temperatura corretta. Il tempo di aspirazione: 14 pompe giorno: 4-6 ore, 28 pompe di giorno: 40 ore, 42 pompe di giorno: 60 ore. Una volta terminato il montaggio delle pompe, tappare i tubi conici e posto in un ambiente pulito37 ° C bagnomaria fino chirurgico. </li></ol> 2. Procedura di pre-chirurgica <ol><li> Pulire tutto giù con il 70% di etanolo per sterilizzare la zona e fissare teli sterili sul piano del tavolo e stereotax per creare un campo sterile. È importante essere consapevoli del campo sterile tutta la chirurgia. Accendere il seguente: sterilizzatore Perlina, Pad Riscaldamento, luce, lettura digitale, e Ossigeno / Sistema Isoflurano (Figura 1). </li><li> I seguenti elementi saranno necessari se facendo un singolo intervento chirurgico o di un intero lotto di interventi chirurgici come noi abitualmente facciamo: 1 paio di pinze, 1 pinza emostatica curva, 1 paio di piccole forbici, 1 paio di piccole forbici spuntate curve, 1 ratto taglierina dell&#39;osso , 1 pinza emostatica retta, 5-0 punti di sutura in nylon, 1 tubi conici con il 70% di etanolo, 1 tubo conico con il 95% di etanolo, 1 tubo conico con iodio, 1 tubo conico con perossido di idrogeno, pacchetto di tamponi di cotone sterile, 1 bottiglia di super colla, 1 tubo di pomata antibiotica, 1 tubo di occhiolubrificante, e 1 rasoio elettrico. </li><li> Inserire le punte di entrambe le coppie di forbici, pinze, e emostatica curva nello sterilizzatore tallone per 15 sec. Rimuovere e mettere in etanolo al 70%. Quando si esegue più di un intervento chirurgico, sterilizzare nuovamente le punte degli strumenti in tra animali. </li><li> Ruotare la isoflurano al 4% e O 2-0,4 L / min e flusso di gas diretto alla camera. Abbiamo il nostro sistema / ossigeno isoflurano calibrato almeno una volta all&#39;anno per assicurare che stiamo fornendo la giusta quantità di anestesia. Posizionare il mouse nella camera e attendere che la respirazione è notevolmente rallentato. Rimuovere il mouse ed eseguire un pizzico punta a garantire il mouse è completamente incosciente. </li><li> Radere i peli dalla parte superiore della spalla fino a tra gli occhi. Se il mouse comincia a svegliarsi, posizionare il mouse nuovamente nella camera fino a quando il mouse è ancora del tutto inconsapevole, confermando con un pizzico punta. Posizionare il mouse anestetizzato sulla stereotax e spingere il cono sopra il naso.Sii gentile come i denti e le ossa sono fragili. </li><li> Dirigere il flusso del gas al stereotax per mantenere il mouse anestetizzato. E &#39;importante controllare di tanto in tanto per assicurarsi che il mouse è completamente incosciente con un pizzico punta tutta la chirurgia. Fissare la testa con le barre di orecchio. Preferiamo livellamento barre orecchio, sebbene di indirizzare il ventricolo laterale, un cranio perfettamente piano non è necessaria a causa delle grandi dimensioni del ventricolo. </li><li> Girare il livello isoflurano fino al 2,0% per la manutenzione. Dab occhio unguento su ogni occhio. Come si vede nel video, giaceva un telino sterile sopra il mouse in modo che solo la base del collo e della testa sono esposti. Poi disinfettare la zona chirurgica pulendo la sommità della testa e del collo con un movimento circolare partendo dal centro dell&#39;area rasata e spostando verso l&#39;esterno prima con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 95%, seguito da un batuffolo di cotone imbevuto di iodio. </li><li> Si consiglia di utilizzare un sistema di retroazione rettale sonda temperatura controllata di riscaldamento che assicurala temperatura del topo rimane ad una stabile 37 ° C. Se la temperatura del mouse diminuisce durante l&#39;intervento, il recupero post-chirurgico può richiedere più tempo e l&#39;ipotermia risultante può portare ad attività della proteina aberrante, compresa iperfosforilazione dei microtubuli proteina Tau associata 15. Dopo aver impostato il sistema di riscaldamento, si è ora pronti per iniziare l&#39;intervento chirurgico. </li></ol> 3. L&#39;impianto di Alzet pompa osmotica <ol><li> Prima di iniziare l&#39;intervento, messo su un nuovo paio di guanti sterili. Poi, con pinze e un piccolo paio di forbici, fare una incisione nella pelle dalla base del collo sopra cranio dell&#39;animale fino tra gli occhi </li><li> Prendere le forbici smussate con la curva rivolta verso l&#39;alto e far scorrere sotto la pelle alla base della parte posteriore del collo verso hindlimb sinistra. Non ci dovrebbe essere alcuna resistenza. Se non c&#39;è, togliere le forbici e riprovare. Questo forma la tasca sottocutanea per la pompa osmotica. </li><li> Wipe il cranio pulita con tamponi di cotone sterile, seguito da un batuffolo di cotone imbevuto di acqua ossigenata per migliorare bregma. </li><li> Pulire i ml provette coniche 50 che contengono le pompe per mantenere la sterilità delle pompe. Prendere accuratamente una pompa dal tubo conico utilizzando all&#39;emostato curvo, avendo cura supplementare che la pompa non tocca i lati del tubo conico. Tenere la base della pompa con una pinza e spingere il modulatore flusso nel resto del modo con la pinza emostatica ricurva. </li><li> Tenere la pompa dove il modulatore di flusso e tubi si incontrano con la pinza emostatica curva. Inserire la pompa sotto la pelle alla base del collo e spingerlo indietro verso la hindlimb sinistra fino a fine corsa senza resistenza. Fare attenzione a non lasciare che il tocco niente catetere. </li><li> Con la pinza emostatica curva, afferrare la cannula alla scanalatura in cui la parte superiore incontra il piedistallo. Spostare il driver cannula in posizione e fissarlo in posizione. </li><li> Posizionare una singola goccia di colla super sulla base della cannula. Push la parte superiore della cannula nel conducente e posizione in modo che il tubo sia puntato subito indietro. </li><li> Toccare la punta del catetere di bregma e azzerare le coordinate sul display digitale. Sollevare e spostare il catetere 1,1 millimetri lateralmente verso destra e 0,5 mm posteriormente (Figura 2B). Tenere la pelle fuori strada con la pinza emostatica curva. </li><li> Guidare il catetere metallico sottile attraverso il cranio fino alla pressione saldamente la base cannula di plastica contro la parte superiore del cranio. Il catetere di metallo può essere guidato direttamente attraverso il cranio nei topi a causa della relativa cranio sottile. Se si utilizza ratti, praticare un foro nel cranio prima di abbassare il catetere. </li><li> Tirare qualsiasi pelle che ha colla su lontano dal cranio. Con il driver cannula tenendo la cannula / catetere in posizione, attendere 1-2 min per la colla per asciugare completamente. </li><li> Quando si pratica, per valutare il posizionamento del catetere, iniettare 20-40 ml di 2,5% FastGreen Dye attraverso il tubo (Figura 2C). Attendere 2-3 minuti, perfuse il mouse con PBS 1X 0,03% eparina, e rimuovere il cervello. Tagliare coronale al sito del catetere. Se il catetere è stato posizionato nel ventricolo, il colorante viene perfuso in tutto il sistema ventricolare del mouse (Figura 2D). </li><li> Tenere il catetere in posizione con la pinza emostatica curva, aumentando nel contempo il conducente. Rilasciate lentamente all&#39;emostato per assicurare che la cannula sia correttamente fissato al cranio. </li><li> Con un tampone di cotone, premere sulla parte superiore della cannula. Montare i Clippers ossei ratto nel boschetto tra la parte superiore e la base della cannula. Agganciare la parte superiore della cannula mentre ancora premendo con il bastoncino di cotone. Cercare di mantenere il livello tagliaunghie in modo da non staccare la cannula dal cranio. Se la cannula fa venire scollata, in modo rapido re-incollare e applicare una pressione con un tampone di cotone per altri 2 min. </li><li> Usando il filo di sutura 5-0, emostatico regolare, e pinze, sutura lungo la piena apertura, prestando particolare attenzione a destra sopra la cannula. Usiamo un running orizzontale materasso sutura (vedi Figura 5) in virtù della grande incisione sul cranio. </li><li> Applicare una piccola quantità di pomata antibiotica sulla testa e sul collo. Svitare l&#39;orecchio bar e allentare il cono di naso. Rimuovere il mouse dalla stereotax e posto su un rilievo di riscaldamento per il recupero. Monitorare i topi strettamente per la durata del recupero, in genere comprese tra 10-30 minuti. Verificare ogni 2-3 minuti fino a quando il mouse comincia a camminare in giro e che si governa. </li></ol> 4. Assistenza post-operatoria <ol><li> Monitorare i topi al giorno dopo l&#39;intervento chirurgico per la prima settimana. </li><li> Se il mouse sembra essere nel dolore o disagio, si consiglia di fornire il mouse con un mg / kg iniezione sottocutanea di 5 Carprofen una volta ogni 24 ore per 5 giorni, al fine di alleviare il dolore. </li><li> Se vi sembra essere un&#39;infezione, applicare generosamente pomata antibiotica all&#39;area quotidiana e consultare un veterinario che si occupa di assicurare che la ferita guarisce correttamente. </li><li> RTogliete il 5-0 sutura in nylon 7-10 giorni dopo l&#39;intervento per evitare irritazioni dal filo di sutura. </li></ol> 5. Modifica o rimozione Alzet pompa osmotica Dopo che la pompa è fatto infondendo attivamente ASO, può essere modificato o completamente rimosso. <ol><li> Seguire la stessa procedura di pre-chirurgia come sopra, con le seguenti modifiche: 1) non sarà necessario le forbici curve, emostatica curva, frese ossee ratto, né il display digitale, e 2) invece di preparando la testa del topo, barba e disinfettare la parte posteriore del mouse all&#39;incrocio tra la pompa e il tubo. </li><li> Fare una incisione 1,5 cm sul retro del mouse, perpendicolare alla giunzione pompa / tubi, con pinze e forbici. Estrarre con cautela la pompa fuori l&#39;incisione senza significativamente trazione / spinta sul tubo come può urtare il catetere. </li><li> Per rimuovere la pompa, tagliare il tubo di circa 0,5 cm al di sopra del modulatore di flusso e di toccare la supercolla per il tubo to sigillo chiuderlo. Attendere 1-2 min per asciugare la colla. Riposizionare il tubo nella incisione e sutura chiusa. Dab pomata antibiotica sulla pelle suturata e posizionare il mouse su un blocco di recupero riscaldato. </li><li> Per cambiare la pompa, hanno appena fatto pompe pronto insieme a un piatto di 10 cm riempito con il 95% di etanolo. Cateteri non sono necessari con le nuove pompe. </li><li> Afferra una nuova pompa con le pinze. Immergere le dita in etanolo, prendere in mano la pompa, e scartare il flow-modulatore. Poi, con cautela e lentamente tirare fuori la vecchia pompa dal modulatore di flusso attaccato al tubo e cannula. Non appena è spento, far scorrere lentamente la nuova pompa, assicurando che il modulatore di flusso non tocca mai l&#39;esterno del mouse. </li><li> Reinserire la nuova pompa attraverso l&#39;incisione di nuovo nel pacchetto sottocutaneo e sutura la cute. Dab pomata antibiotica sulla ferita del mouse e posto sul pad di recupero. </li><li> Proprio come con l&#39;impianto pompa, monitorare i topi al giorno dopo l&#39;intervento chirurgico per verificare pain / disagio e infezioni. Trattare con Carprofen e antibiotici come ritenuto necessario. </li></ol> ICV BOLO 6. Procedura di pre-chirurgica <ol><li> Seguire la stessa procedura di pre-chirurgia come nella Sezione 2 di cui sopra con le seguenti modifiche: 1) non sarà necessario forbici curve, emostatica curva, o utensili da taglio osseo di ratto; 2) Pulire a 10 microlitri Hamilton siringa e l&#39;ago con acqua sterilizzata e carico con ASO e 3) fissare la siringa e l&#39;ago per l&#39;apparato stereotassico in cui si trovava il conducente cannula. </li></ol> 7. Bolo di ASO <ol><li> Con pinze e un piccolo paio di forbici, fare un&#39;incisione dalla base del collo fino a tra gli occhi. </li><li> Pulire il cranio puliti con tamponi di cotone sterile, seguita da un batuffolo di cotone imbevuto di acqua ossigenata per migliorare bregma. </li><li> Portare la siringa / ago in posizione e fissare. Assicurarsi che la parte smussata dell&#39;ago affronta posteriore. Abbassarel&#39;ago finché non tocca bregma. Azzerare tutte le coordinate. Spostare l&#39;ago lateralmente verso destra 1,0 millimetri e 0,3 millimetri anteriore (Figura 3A). </li><li> Guidare lentamente l&#39;ago attraverso il cranio solo fino a quando il foro dell&#39;ago è a filo con la parte superiore del cranio. Ancora una volta, questo può essere fatto a causa dello spessore ridotto del cranio mouse. Azzerare la coordinata z ed abbassare l&#39;ago -3.0 mm ad una velocità di 1 mm / sec (Figura 3B). Attendere 2-3 minuti per il cervello per sigillare intorno all&#39;ago. </li><li> Consegnare il pieno 10 ml di ASO a una velocità di 1 ml per sec. Attendere 2-3 minuti. Usiamo una velocità di infusione 1 ml per ASOS nel ventricolo, anche se questo tasso può variare tra diversi farmaci. Quando si pratica, verificare il corretto posizionamento dell&#39;ago, fornendo 10-20 ml di 2,5% FastGreen Dye. Perfondere il mouse con 1X PBS 0,03% eparina presto dopo infusione colorante e rendere sezioni coronali del cervello per verificare che il colorante è nel sistema ventricolare (Figura 3C). </li> &lt;li&gt; Tenere premuto un tampone di cotone contro il cranio alla base dell&#39;ago. Sollevare l&#39;ago a una velocità di 1 mm al sec. Appena l&#39;ago è fuori del cranio, rotolare il tampone di cotone sopra il foro dell&#39;ago e tenere per 1 min per impedire qualsiasi fuoriuscita ASO. </li><li> Suturare la pelle chiuso, applicare pomata antibiotica, e il luogo del mouse sul tappetino di recupero riscaldato. A seconda della concentrazione ASO, potrebbero essere necessari 20 minuti per un paio d&#39;ore per riprendersi completamente. </li><li> Proprio come con l&#39;impianto della pompa, controllare i topi al giorno dopo l&#39;intervento chirurgico per controllare il dolore / disagio e infezioni. Trattare con Carprofen e antibiotici come ritenuto necessario. </li></ol>

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Gli autori ricevono le loro oligonucleotidi antisenso di Isis Pharmaceuticals.

La capacità di fornire farmaci globalmente nel SNC come mostrato nel video è una tecnica estremamente potente che è facile da imparare ed usare. Con la pratica, un singolo impianto di pompa o un ICV bolo può essere completato in 10 min, consentendo ampie coorti di topi da trattare contemporaneamente. Ciò è particolarmente utile per gli studi con una lettura del comportamento, come un numero maggiore per il comportamento del mouse sono fondamentali per aiutare a vedere differenze significative. Sulla base delle nostre esperienze offrendo ASO tramite pompe e iniezioni in bolo, abbiamo osservato alcuni pro e contro di ciascun metodo. Va notato che queste sono le opinioni in nostro laboratorio e potrebbero non essere vero per tutti i modelli di topo e di ratto. Troviamo un vantaggio di utilizzare delle pompe è la loro capacità di fornire una elevata quantità di ASO poiché l&#39;ASO è distribuito su un periodo molto più lungo di tempo. Questo di solito equivale a knockdown più sostenuta o splicing dopo attivoASO infusione, anche se questo potrebbe non essere sempre così. Le pompe consentono anche un calendario preciso di consegna ASO (14 giorni, 28 giorni o 42 giorni) e le pompe possono essere cambiati una volta per consentire ancora più a lungo attivo ASO infusione. Tuttavia, abbiamo notato che cambiando le pompe più di una volta aumenta la variabilità dovuta alla formazione di tasche fibroso intorno alla pompa che evitare che la pompa liquido appositamente assorbente. Uno svantaggio delle pompe è che alcuni topi non tollerano la pompa così come gli altri. Se la linea transgenica si sta lavorando è più fragile, una pompa può essere troppo ingombrante. Le pompe hanno anche bisogno di essere rimosso dopo l&#39;infusione finale, sottoponendo i topi ad un altro intervento chirurgico e l&#39;anestesia aggiunto. Se facendo opera comportamento, è particolarmente importante rimuovere la pompa e lasciarla per almeno 1-2 settimane di recupero in quanto la presenza della pompa interesserà alcuni comportamenti nei topi. Con ICV bolo iniezioni, un vantaggio è il costo. Vi è uninvestimento iniziale per l&#39;acquisto di siringhe e aghi, ma nel corso del tempo, iniezioni in bolo sono più convenienti in quanto non ci sono pompe / tubi / cateteri per l&#39;acquisto. In generale, c&#39;è meno up-tenere con le ICV iniezioni in bolo a causa della mancanza di cannule e pompe. Troviamo anche che ICV bolo possono essere usati per fornire ASO ai topi più giovani fragili e / o più. Uno svantaggio del ICV bolo è che è una singola iniezione. Non tanto generale ASO può essere fornito attraverso questo percorso, e se la durata di azione della ASO in uso è breve, gli effetti knockdown / splicing sarà anche di breve durata. Entrambe le pompe osmotiche nonché il bolo ICV hanno la capacità di fornire ASOs knockdown proteine ​​che possono alterare o splicing di geni in tutta SNC roditore, una tecnica che ha ampie applicazioni in più campi neuroscienze legate. Ti suggeriamo di pilotaggio entrambi i metodi di consegna se non siete sicuri che la via di somministrazione è più adatto per il vostro sstudio pecific.

Alcuni farmaci sono in grado di attraversare la barriera ematoencefalica (BBB), richiedendo diretto Sistema Nervoso Centrale (SNC) consegna. Per aggirare la BBB, i farmaci possono essere consegnati direttamente nel cervello con i metodi descritti. Mentre il nostro laboratorio e la carta dettagliata attenzione qui su oligonucleotidi antisenso (ASO), altri farmaci, come le piccole molecole, gli anticorpi, vettori di terapia genica, ecc., Possono anche essere consegnati attraverso l&#39;esatto stesso approccio. Alcune proteine ​​svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi di malattie neurodegenerative. Tali proteine ​​formano spesso specie tossiche e si accumulano in aggregati, che porta alla eventuale morte neuronale e la successiva malattia neurologica 3-4. Nel tentativo di rallentare o addirittura arrestare la progressione di queste malattie, una opzione terapeutica può essere di indirizzare direttamente e diminuire la proteina causativo. Tuttavia, queste proteine ​​sono spesso presenti ubiquitariamente attraverso il SNC, rendendo difficile e<html> ffectively loro bersaglio su scala globale. Al fine di indirizzare i geni durante l&#39;intero sistema nervoso centrale, amministriamo ASO in un mouse liquido cerebrospinale (CSF) attraverso il ventricolo laterale di bypassare il BBB. Questo metodo specifico sfrutta il sistema ventricolare topo che bagna l&#39;intero cervello e il midollo spinale, consentendo un&#39;ampia distribuzione dei ASOs. Usiamo ASOs che sono 18-20 mer molecole RNA-simili che si legano direttamente la sequenza di mRNA bersaglio e, a seconda delle modificazioni chimiche ASO, sia a) recluta RNasi H per degradare l&#39;mRNA che porta a knockdown o B) spostare splicing alternativo 1 , 2,16,17. Va notato che esistono molecole multiple per abbattere una specifica proteina in vivo, compresi shRNA. Dal momento che queste molecole non sono al centro di questo articolo, ci indirizziamo il lettore a rivedere gli articoli che meglio approfondito i meccanismi atterramento di azione ed i vantaggi / svantaggi di ciascun 5-6. jove_content &quot;&gt; Nel lavoro precedente, abbiamo utilizzato ASO per indirizzare la proteina superossido dismutasi 1 (SOD1) in un modello di topo transgenico di sclerosi laterale amiotrofica (SLA), 7 (Figura 4). Mutazioni SOD1 verificarsi in circa il 2% di tutti gli SLA 8 casi, anche se è stato recentemente ipotizzato che SOD1 possono svolgere un ruolo importante nella SLA sporadica e 9-10. Diminuendo totale SOD1 livelli nella SLA transgenici topo, la sopravvivenza dopo l&#39;esordio è stato aumentato significativamente 7. Questi dati importanti sono stati i primi per dimostrare che un trattamento ASO nel sistema nervoso centrale potrebbe avere un profondo impatto positivo su un modello di malattia neurologica. Da allora, ASO mirate per SOD1 umane sono entrati e completato con successo la fase I di sperimentazione clinica umana con effetti collaterali minimi (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , come presentato al 2012 64 th Annual Academy of Neurology. piani per spostare le ASO ora di studi di fase II sono attualmente in corso. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Mentre rivolge SOD1 è stata la prima dimostrazione di utilizzo di ASO per il trattamento di una malattia neurologica, molti altri studi da allora sono stati eseguiti guardando diverse malattie e le rispettive proteine ​​target. Nel 2010 e nel 2011, Asos che spostano splicing della proteina di sopravvivenza dei motoneuroni 2 (SMN2) sono stati utilizzati in modelli di topi transgenici di atrofia muscolare spinale (SMA) e ha determinato un significativo miglioramento dei fenotipi di malattia 11,12. Questi ASOs splicing sono ora in fase I di sperimentazione clinica in bambini affetti da SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la somministrazione transitoria di ASOs mirati contro il gene huntingtina riuscirono a salvare drammaticamente modello murino di Huntington, anche dopo che i livelli di proteina huntingtina ritornando al basale 13. In tutti questi studi, sono state consegnate ASOs ventricolo laterale di diminuire i livelli totali del gene o alterare gene splicing mediantel&#39;intero SNC. Entrambe le pompe osmotiche e una singola iniezione in bolo può essere utilizzato per fornire ASO al QCS. Le pompe consentono una lenta, erogazione continua, mentre la intracerebroventricolare (ICV) bolo è un veloce, l&#39;iniezione di una volta. Abbiamo usato entrambi questi metodi con successo, se non abbiamo riportato il confronto diretto tra pompa e bolo in una singola linea transgenica. Utilizzando ASO nel SNC è un potente mezzo per diminuire i livelli di proteine ​​totali e / o cambiamento splicing di diverse proteine. Mentre usiamo ASO esclusivamente come trattamento per i disturbi neurologici, ci rendiamo conto che gli altri campi possono anche beneficiare di questa tecnica. Fino a quando la proteina di interesse è espresso nel sistema nervoso centrale e l&#39;obiettivo finale è quello di raggiungere CNS modifiche a livello di espressione genica, utilizzando ASO nelle tecniche dimostrate può essere molto utile.

<table><tbody><tr><td colspan="4">PREPARAZIONE DELLE POMPE OSMOTICHE ALZET </td></tr><tr><td>Pompa Osmotica Alzet 14 giorni</td><td>DURECT</td><td>Modello 1002</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Osmotica Alzet 28 giorni</td><td>DURECT</td><td>Modello 2004</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Osmotica DURECT 42 giorni</td><td>DURECT</td><td>Modello 2006</td><td></td></tr><tr><td>Cateteri da 2,5 mm</td><td>PlasticsOne</td><td>3280PM/SPC</td><td>Personalizzato ordinato per 2,5 mm di lunghezza del catetere</td></tr><tr><td>Tubo per catetere in vinile</td><td>DURECT</td><td>7760</td><td>ID: 0,027", OD: 0,045"</td></tr><tr><td>0,9% di cloruro di sodio, irrigazione, USP</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td>NON da utilizzare in pompe o tubi</td></tr><tr><td>0,9% di cloruro di sodio, iniezione, USP</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>p60 Piastra di Petri (sterilizzata)</td><td>Lame</td> chirurgiche TRP <td>93060</td><td></td></tr> (<tr><td>sterili)</td><td>Butler Schein</td><td>#007319</td><td></td></tr><tr><td>Guanti chirurgici in lattice (sterili)</td><td>Micro-Touch</td><td></td><td>CatNo dipenderà dalle dimensioni dei guanti necessari</td></tr><tr><td>Telo asciugamano sterile</td><td>Dynarex</td><td>4410.2um</td><td></td></tr> <tr><td>Filtri per siringhe</td><td>PALL</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml (sterile)</td><td>BD</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>Provette</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>coniche da 50 ml<td>100% Etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">PUMP & PROTOCOLLI DI CHIRURGIA DEL BOO </td></tr><tr><td>Pinze curve</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11001-12</td><td></td></tr><tr><td>Emostatico curvo</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>Forbici affilate fini Strumenti per</td><td>la scienza fine</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Forbici smussate curve</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Tagliaossa</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>16104-14</td><td></td></tr><tr><td>Siringa diritta</td> degli <td>strumenti di Fine Science dell'emostatico</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td>10 &mu; l a tenuta di gas con aghi rimovibili</td></tr><tr><td>Aghi</td><td>Hamilton</td><td>7758-04</td><td>calibro 26, Stile punta: 2</td></tr><tr><td>5-0 Filo di sutura in nylon</td><td>Covidient</td><td>SN-871</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi imbevuti di alcol</td><td>Seleziona</td><td>#521</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi di cotone (sterili)</td><td>Puritan</td><td>REF 806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td></td><td>Bottiglie a collo lungo</td></tr><tr><td>ATTENZIONE: FastGreen Dye</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td>Indossare visiere e guanti quando si maneggia questo prodotto</td></tr><tr><td>Crema</td><td></td><td></td><td></td>antibiotica</tr><tr><td>Unguento</td><td></td><td></td><td></td>per gli occhi</tr><tr><td>Rasoio</td><td></td><td></td><td></td>elettrico</tr><tr><td>70% Etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% Iodio Provadone 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>% Perossido</td><td></td><td></td> di idrogeno<td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore di</td> perline per cuscinetti <td></td><td></td><td></td>riscaldanti</tr><tr><td></td><td>SouthPointe Surgical</td><td>GRM5-1450</td><td></td></tr><tr><td>Kopf</td><td>stereotassico per piccoli animali</td><td>Modello 940</td><td></td></tr><tr><td>Cono nasale</td><td>Kopf</td><td>Modello 923-B</td><td></td></tr><tr><td>Barre auricolari</td><td>Kopf</td><td>Modello 921</td><td>Questo modello è opzionale</td></tr><tr><td>Cannula Driver</td><td>Kopf</td><td>Modello 1966</td><td></td></tr><tr><td>Porta siringa Kopf</td><td></td><td>modello 1972</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di controllo della temperatura</td><td>Kopf</td><td>modello TCAT-2LV</td><td>Sistema</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td>opzionale ossigeno<td>/isoflurano</td></tr></tbody></table>

consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, roditore

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

A causa dell&#39;impossibilità di attraversare la barriera ematoencefalica, alcuni farmaci devono essere consegnati direttamente nel sistema nervoso centrale (SNC). Il nostro laboratorio si concentra in particolare su oligonucleotidi antisenso (ASO), anche se le tecniche mostrate nel video qui possono anche essere usati per fornire una pletora di altri farmaci per il sistema nervoso centrale. Oligonucleotidi antisenso (ASO) hanno la capacità di atterramento obiettivi specifici della sequenza 1, nonché del cambio rapporti isoforma di geni specifici 2. Per assicurare la massima diffusione knockdown gene o splicing nel sistema nervoso centrale di topi, le ASO possono essere consegnati nel cervello utilizzando due percorsi separati di somministrazione, entrambi i quali dimostriamo nel video. I primi utilizzi Alzet pompe osmotiche, collegato ad un catetere che viene impiantato chirurgicamente nel ventricolo laterale. Questo permette ai ASOs di essere continuamente infuso nel SNC per un determinato periodo di tempo. La seconda prevede una singola iniezione in bolo di un hiconcentrazione gh di ASO nel ventricolo destro laterale. Entrambi i metodi utilizzano il sistema ventricolare cerebrale mouse per consegnare la ASO per tutto il cervello e il midollo spinale, sebbene a seconda delle esigenze dello studio, un metodo può essere preferita all&#39;altra.

Dopo infusione pompa o un tempo designato dopo l&#39;iniezione ICV bolo (noi abitualmente uso quattro settimane), è importante per testare l&#39;efficacia dei ASOs. Si consiglia di riprendere varie regioni del cervello e del midollo spinale per misurare i livelli / isoforme del gene bersaglio, sia a livello di mRNA utilizzando quantitativa PCR in tempo reale, nonché il livello proteico utilizzando Western Blot o ELISA (Figura 4 per un esempio pubblicato ). Ciò contribuirà a determinare ASO efficacia nelle diverse regioni del SNC. Se l&#39;emivita della proteina mirata è lungo, si consiglia di attesa più lungo dopo ASO infusione al fine di valutare la massima knockdown proteine ​​o di splicing. È anche importante per testare distribuzione oligo. Infusi Pompa sfociano in distribuzione attraverso gli emisferi sia ipsilaterale che controlaterale, anche se una maggiore concentrazione di ASO è spesso visto in zone più vicine al sistema ventricolare 16. ICV bolo iniezioni di produrre un più Unifodistribuzione rm di oligo attraverso il SNC 16, anche se gli effetti non possono durare più a lungo. Noi indirizziamo il lettore a Southwell et al. Vedere un confronto diretto di pompa rispetto a bolo oligo distribuzione 16. Raccomandiamo inoltre testare dosi multiple così come la durata d&#39;azione degli ASO poiché ogni ASO si comporterà in modo leggermente diverso in vivo. ASO in genere hanno una relativamente lunga durata d&#39;azione, con atterramento di destinazione o di splicing della durata di diversi mesi dopo la consegna ASO. Inoltre, alcuni ASO funzionano meglio di altri e alcuni obiettivi del gene sarà più facile da atterramento di altri. A causa di questo, quando lo screening Asos per determinare il candidato di piombo, si consiglia di testare almeno 3-5 Asos in vivo con un n = 4-6 adulti topi per ASO come primo passaggio. Se si utilizza un farmaco diverso ASOs, sarà anche importante per il pilota concentrazione ideale farmaco, durata di azione dei farmaci, e del SNC farmacodistribuzione per tale composto specifico. <img alt="Tabella 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326table1.jpg" /> Tabella 1. Chirurgia Coordinate. Le coordinate utilizzate per colpire il diritto ventricolo laterale in entrambi i topi e ratti momento dell&#39;impianto pompe osmotiche, nonché l&#39;esecuzione di un intracerebroventricolare (ICV) bolo. Entrambe le coordinate, per pompe e ICV bolo, indirizzare il diritto ventricolo laterale. Usiamo due diverse serie, perché questi sono ciò che abbiamo più esperienza con e sappiamo forniscono un&#39;eccellente distribuzione di ASO. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig1.jpg" /> Figura 1. Setup stereotassica. (A) L&#39;apparecchiatura stereotassica necessaria per la pompa Alzet e ambulatori iniezione in bolo. I), perle di vetro Sterilizzarer. ii) Lettura digitale. iii) Base Stereotassica con le braccia in movimento. iv) Temperatura controllata Riscaldamento Pad. v) Isoflurano / Sistema di ossigeno. vi) Camera isoflurano. (B) Primo piano del cono di naso e orecchie bar. (C) Due allegati richiesti. A sinistra: Siringa / porta-aghi per ICV iniezioni in bolo. Destra: Driver cannula per l&#39;impianto della pompa osmotica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig2.jpg" /> Figura 2. Alzet osmotica pompa impianto. (A) Alzet opzioni pompa osmotica per i topi. 14 pompe. Giorno (0,25 ml / ora), 28 pompe di giorno (0,25 ml / ora), 42 pompe di giorno (0,15 ml / h) (B) Coordinate per l&#39;impianto pompa dal bregma: -0.5 mm posteriormente, -1.1 mm Laterale ( a destra), e -2,5 mm ventrale (lunghezza del catetere). (C) Dopo aver guidato il catetere attraverso l&#39;cranio e incollaggio della cannula, colorante viene lavata attraverso il catetere per valutare il corretto posizionamento del catetere nel ventricolo laterale. (D) cervello perfuso immediatamente dopo tintura somministrato come in (C). Se catetere viene inserito correttamente nella ventricolo, il colorante sarà distribuito in tutto il sistema ventricolare del mouse. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig3.jpg" /> Figura 3. Intracerebroventricolare iniezione in bolo. (A) Coordinate per iniezione in bolo da bregma: 0,3 millimetri anteriore, -1.0 mm laterale (destro), e -3,0 mm ventrale (B) Dopo aver guidato l&#39;ago attraverso il cranio -3.0 mm ventrale, colorante viene spinto attraverso la siringa. per valutare il corretto posizionamento dell&#39;ago nel successivamente ventricolo. (C) cervello perfuso poco dopo tintura somministrata come in (B). Se l&#39;ago viene inserito correttamente nella ventricolo, lacolorante sarà distribuito in tutto il sistema ventricolare del mouse. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig4.jpg" /> Figura 4. Gli oligonucleotidi antisenso riducono SOD1 ratto in vivo (figura prelevata direttamente da Smith et al. 7). (AD) antisenso SOD1 oligonucleotidi SOD r146192 o SOD strapazzate erano infuso per 28 giorni nel ventricolo destro laterale di ratti normali a 100 mg / giorno. (A) endogeni SOD1 livelli di mRNA di cervello e midollo spinale, come misurato da RT-PCR quantitativa. ( B) a-tubulina livelli di proteina SOD1 e seguendo ASO infusione. (C e D), i livelli di proteina per la tubulina e SOD1 quantificati per le diverse regioni del seguente infusione cervello. (E) ASO contro presenilina 1 o GSK-3 e beta, Sono stati infusi per 2 settimane nel ventricolo destro laterale di topi transgenici e dei livelli di mRNA valutate nel giusto corteccia frontale / temporale. Riprodotto con il permesso della American Society for Clinical Investigation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50326/50326fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5.jpg" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50326/50326fig5highres.jpg"/> Figura 5. Esecuzione orizzontale sutura materasso. 5-0 nylon filo di sutura è tessuto dentro e fuori della pelle, partendo anteriore e posteriore di lavoro, concentrandosi più sulla cannula. Una volta giunto al punto più posteriore, il filo di sutura viene poi riportato su e filettata sulla cannula una volta di più. Questo assicura corretta chiusura della ferita e impedisce la cannula / tubo da lavorare attraverso la pelle.

Si descrive un metodo per indirizzare farmaci per il sistema nervoso centrale o impianto di un catetere o eseguendo una iniezione in bolo nel ventricolo destro laterale nei topi. Ci concentriamo in particolare sulla fornitura di oligonucleotidi antisenso. Questa tecnica è facilmente adattabile ad altri farmaci e ai ratti.

Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è somministrare direttamente farmaci come oligonucleotidi antisenso, come illustrato in questo protocollo, nel sistema nervoso centrale del roditore attraverso il ventricolo laterale. Ciò viene ottenuto mediante due metodi diversi. Il primo prevede l'impianto chirurgico di un catetere metallico collegato a una pompa osmotica zet nel ventricolo laterale destro del mouse.Una volta che la pompa ha terminato la somministrazione del farmaco, essa può essere completamente rimossa, consentendo l'interruzione del trattamento, oppure sostituita, permettendo la prosecuzione del trattamento attivo. Il secondo metodo di somministrazione prevede un'iniezione singola in bolo nel ventricolo laterale destro. Una quantità definita di farmaco può essere rapidamente distribuita in tutto il sistema nervoso centrale mediante questo metodo, dimostrando con successo la somministrazione di oligonucleotidi antisenso all'intero sistema nervoso centrale del roditore.Come dimostrato in questo protocollo, è necessario misurare i livelli di mRNA e di proteina in diverse aree cerebrali dopo l'infusione dell'oligonucleotide. Sebbene questo metodo possa fornire indicazioni su come somministrare direttamente oligonucleotidi antisenso al sistema nervoso centrale, può essere applicato anche ad altri farmaci, inclusi anticorpi, terapie geniche, vettori e molecole di piccole dimensioni.Tutte le procedure chirurgiche devono essere eseguite in condizioni sterili utilizzando strumenti e soluzioni sterili, e in conformità con le linee guida dell'istituto e del governo. Ulteriori dettagli sono disponibili nel protocollo scritto e nelle linee guida iacuc dell'istituto. Dopo aver anestetizzato il topo in una camera di induzione con isoflurano, rimuovere il topo ed eseguire una compressione del dito del piede per verificare che il topo sia completamente incosciente prima di iniziare il lavoro.Rasare rapidamente i peli dalla sommità della spalla fino alla regione tra gli occhi. Quindi posizionare con cura e delicatezza il topo anestetizzato sullo stereotassimetro. Inserire il cono nasale sul naso e indirizzare il flusso di gas verso lo stereotassimetro.Per mantenere il topo anestetizzato, fissare la testa con le barre auricolari. In questo caso si utilizzano barre auricolari livellate, anche se, poiché il bersaglio è il ventricolo laterale, un cranio perfettamente livellato non è necessario a causa delle grandi dimensioni del ventricolo. Ridurre la concentrazione di isoflurano al 2% per il mantenimento dell'anestesia e applicare un unguento oftalmico.Su ciascun occhio, passare la parte superiore della testa e del collo con un bastoncino di cotone imbevuto di etanolo al 95%, seguito da un bastoncino di cotone imbevuto di iodio per sterilizzare l'area chirurgica. Inoltre, posizionare un telo sterile sul topo. Assicurarsi che la temperatura corporea del topo rimanga a 37 gradi Celsius.Viene utilizzato qui un sistema di riscaldamento controllato per temperatura con retroazione tramite sonda rettale. Procedere quindi all'impianto della pompa zat. Selezionare la pompa appropriata in base al numero richiesto di giorni di infusione e preparare la pompa secondo le istruzioni riportate nella sezione testuale del protocollo.Dopo aver praticato un'incisione dalla base del collo fino alla zona tra gli occhi, inserire le forbici smussate con la curvatura rivolta verso l'alto sotto la pelle alla base del collo in modo fluido. Far scorrere le forbici all'indietro verso l'arto posteriore sinistro e aprirle leggermente per formare una tasca sottocutanea. Pulire accuratamente il cranio con tamponi di cotone sterili, seguiti da un batuffolo di cotone imbevuto di perossido di idrogeno.Per migliorare il bgma, utilizzare l'emostatico curvo per prendere con attenzione una pompa dal tubo conico, assicurandosi che la pompa non tocchi le pareti del tubo conico. Tenere la base della pompa con le pinze e spingere il modulatore di flusso fino in fondo. Con l'emostatico curvo stat, utilizzare l'emostatico curvo per tenere la pompa nel punto in cui il modulatore di flusso incontra il tubicino.Inserire la pompa sotto la pelle alla base del collo e spingerla con attenzione verso l’arto posteriore sinistro, fino a quando non incontra resistenza. Prestare attenzione a non far toccare il catetere a nulla, utilizzando l'emostatico curvo. Afferrare la cannula nella scanalatura in cui la parte superiore incontra la base.Spostare il driver del cannula in posizione e fissarlo saldamente. Quindi applicare una singola goccia di colla istantanea sulla base del cannula e inserire la parte superiore del cannula nel driver, posizionandolo in modo che il tubicino sia orientato direttamente all'indietro. Agendo rapidamente, toccare la punta del catetere con bgma e azzerare le coordinate sul display digitale, tenendo la pelle lontana dalla zona.Con l'emostatico curvo, sollevare il catetere e spostarlo lateralmente di 1,1 millimetri verso destra e di 0,5 millimetri in direzione posteriore. Come indicato in questo diagramma, inserire rapidamente il catetere attraverso il cranio fino a quando la base della cannula non sia saldamente premuta contro il cranio. Il catetere può essere introdotto direttamente attraverso il cranio e nei topi a causa dello spessore relativamente ridotto del cranio.Allontanare qualsiasi pezzo di pelle con colla dal cranio. Successivamente, mantenendo la cannula in posizione con il supporto del driver, attendere uno o due minuti affinché la colla si asciughi completamente. Poi, mantenere la cannula in posizione con l'emostato curvo mentre si solleva il driver.Rilasciare lentamente l'emostato per assicurarsi che la cannula sia correttamente fissata al cranio. Utilizzare un bastoncino di cotone per premere sulla parte superiore della cannula. Inserire le forbici sterili per osso di ratto nella scanalatura tra la parte superiore e la base della cannula, mantenendo le forbici in posizione orizzontale.Per evitare il distacco della cannula dal cranio, tagliare la parte superiore della cannula continuando a premere con il bastoncino di cotone. Utilizzando il filo di sutura in nylon numero 5, un emostatico comune e le pinze, eseguire la sutura lungo tutta l'apertura, prestando particolare attenzione alla zona sopra la cannula. Applicare una piccola quantità di pomata antibiotica sulla testa e sul collo.Svitare le barre auricolari e allentare il cono nasale. Rimuovere il topo dal supporto stereotassico e posizionarlo su un tappetino riscaldante per il recupero. Monitorare i topi giornalmente dopo l'intervento chirurgico per verificare la presenza di dolore, disagio o infezioni, e trattarli secondo necessità con analgesici come il carprofene, in conformità a un protocollo approvato.Per rimuovere una pompa esaurita, estrarre con attenzione la pompa da un'incisione di 1,5 centimetri praticata perpendicolarmente al giunto della pompa sul dorso del topo, senza tirare né spingere in modo significativo sui tubi. Successivamente, tagliare il tubo a circa 0,5 centimetri sopra il modulatore di flusso e applicare una goccia di colla istantanea sul tubo per sigillarlo. Attendere uno o due minuti affinché la colla si asciughi.Rimettere il tubo nell'incisione e suturare l'incisione. Applicare un unguento antibiotico sulla pelle suturata e posizionare il topo su un tappetino riscaldato per il recupero. Se si sostituisce la pompa, preparare una nuova pompa insieme a una capsula Petri da 10 centimetri riempita con etanolo al 95%. Utilizzare pinze per afferrare la nuova pompa.Quindi immergere le dita dell'altra mano nell'etanolo al 95% e afferrare la pompa. Scartare il nuovo modulatore di flusso della pompa ed estrarre con attenzione la vecchia pompa dal suo modulatore di flusso. Collegare la pompa al tubicino e alla cannula. Non appena la vecchia pompa viene rimossa, far scorrere lentamente la nuova pompa, assicurandosi che il modulatore di flusso non tocchi mai l'esterno del topo.Riinserire la nuova pompa attraverso l'incisione nella tasca sottocutanea e suturare la pelle; dopo aver suturato la pelle come in precedenza, applicare un unguento antibiotico sulla ferita e posizionare il topo su un tappetino di recupero. Monitorare nuovamente i topi quotidianamente dopo l'intervento per verificare la presenza di dolore, disagio o infezioni, e somministrare analgesici secondo necessità per somministrare un bolo intraventricolare cerebrale. Viene effettuata un'incisione nel cuoio capelluto come in precedenza, e il cranio dell'animale viene pulito accuratamente e trattato con perossido di idrogeno.Quindi posizionare la siringa con il farmaco. Orientare la parte bisellata dell'ago verso la parte posteriore e fissarla in posizione. Abbassare l'ago fino a quando non tocca il bgma.Portare a zero tutte le coordinate, quindi spostare lateralmente l'ago di 1,0 millimetro verso destra e di 0,3 millimetri in avanti. Inserire lentamente l'ago attraverso il cranio fino a quando il bordo superiore della beccuccia sia allineato con la superficie superiore del cranio. Ancora una volta, ciò è possibile grazie alla ridotta spessore del cranio del topo zero.Regolare la coordinata Z e abbassare l'ago fino a meno 3,0 millimetri a una velocità di un millimetro al secondo. Attendere due o tre minuti affinché il cervello si sigilli attorno all'ago. Iniettare i completi 10 microlitri di oligonucleotide antisenso a una velocità di un microlitro al secondo.Attendere due o tre minuti. Per l'infusione di oligonucleotidi nel ventricolo si utilizza una velocità di infusione di un microlitro al secondo. Sebbene questa velocità possa variare a seconda del farmaco, premere un batuffolo di cotone contro il cranio alla base dell'ago.Sollevare l'ago a una velocità di un millimetro al secondo. Non appena l'ago esce dal cranio, passare un batuffolo di cotone sulla foratura dell'ago e tenere premato per un minuto per evitare che il farmaco fuoriesca. Dopo aver suturato la pelle e applicato un unguento antibiotico, posizionare il topo su un tappetino riscaldato per il recupero.A seconda della concentrazione dell'oligo, potrebbero essere necessari da 20 minuti a diverse ore per un completo recupero. Monitorare nuovamente i topi quotidianamente dopo l'intervento per verificare la presenza di dolore, disagio o infezioni, e somministrare analgesici se necessario. Questa immagine mostra un cervello perfuso immediatamente dopo l'amministrazione del colorante verde brillante per verificare le coordinate di inserimento della pompa osmotica zet per la somministrazione al ventricolo.Come dimostrato in questo video, se il catetere viene posizionato correttamente nel ventricolo, il colorante si distribuirà in tutto il sistema ventricolare del topo, come mostrato qui. Questa immagine mostra un cervello perfuso poco dopo l'amministrazione del colorante verde brillante per verificare le coordinate e la procedura dell'iniezione bolus intra ventricolare cerebrale. Se l'ago viene posizionato correttamente nel ventricolo, il colorante si distribuirà nuovamente in tutto il sistema ventricolare del topo.Le seguenti immagini mostrano i risultati di un esperimento con oligonucleotidi antisenso per ridurre la D-uno nel ratto, quindi D-uno antisenso in vivo. Gli oligonucleotidi antisenso contro D-uno sono stati infusi per 28 giorni nel ventricolo laterale destro di ratti normali a una dose di 100 microgrammi al giorno. Questa immagine mostra che i livelli endogeni di mRNA di D-uno nel cervello e nel midollo spinale sono ridotti.Dopo l'infusione di un oligo OD1 misurata mediante Q-R-T-P-C-R, questa immagine mostra che anche i livelli proteici di SOD1 sono ridotti. Successivamente all'infusione di un oligonucleotide antisenso OD1, i livelli proteici di tubulina e di OD1 sono stati quantificati in diverse regioni del cervello, dimostrando che l'oligo SOD1 è specifico per l'abbattimento di SOD1. Inoltre, oligo contro presenilina1 o GSK3β sono stati infusi per due settimane nel ventricolo laterale destro di topi non transgenici e i livelli di mRNA sono stati valutati.Questo risultato illustra la vasta gamma di bersagli che possono essere modulati mediante oligonucleotidi antisenso. Una volta acquisite queste tecniche, sia la somministrazione tramite pompa e piantamento sia l'iniezione in bolo possono essere eseguite in 10 minuti, se effettuate correttamente.

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Approfondita sperimentazione preclinica di farmaci che agiscono nel sistema nervoso centrale spesso comporta la valutazione e il confronto biodistribuzione farmaco in associazione con percorsi specifici di somministrazione. Qui, tre metodi comunemente usati di consegna sistemica (per via endovenosa, intraperitoneale e orale), nonché un metodo per la consegna locale (convezione-enhanced consegna) sono dimostrati nei topi.

Drug Delivery sistemica e locale per la cura delle malattie del Sistema Nervoso Centrale in modelli di roditori

Questo articolo viene illustrato due metodi molto diversi di iniezione: 1) nel cervello (intracerebroventricolare) e 2) sistemica (endovenosa) per introdurre gli agenti terapeutici nel sistema nervoso centrale di topi neonati.

Consegna di agenti terapeutici attraverso intracerebroventricolare (ICV) e per via endovenosa (ev) nei topi

Fonte: Poland, R. et al. Microiniezione di cervello di roditore per studiare i substrati molecolari del comportamento motivato. J. Vis. Exp. (2015)In questo video, per una somministrazione precisa del farmaco viene utilizzata una configurazione di microiniezione riempita d'acqua composta da una siringa e un tubo per microiniettore. Un ratto con una cannula guida preimpiantata viene sottoposto a microiniezione cerebrale mirata, consentendo una somministrazione accurata di agenti terapeutici in...

Somministrazione basata su microiniezione di un agente terapeutico nel cervello di un roditore sveglio

Questo video mostra l'iniezione intracerebroventricolare mediata da ommaya in un modello murino. Il metodo consente la somministrazione localizzata di potenziali farmaci candidati ed elude la barriera emato-encefalica.

Iniezione intracerebroventricolare nel topo: un metodo di somministrazione diretta di farmaci mediato da Ommaya per somministrare farmaci ai ventricoli cerebrali del cervello del topo

Fonte: Chen, Y., et al. Somministrazione intratecale di oligonucleotidi antisenso nel sistema nervoso centrale del ratto. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra l'erogazione di un composto di prova nel liquido cerebrospinale (CSF) attraverso un catetere impiantato nella colonna vertebrale lombare di un modello di ratto. Il composto circola lungo il liquido cerebrospinale fino al cervello e al midollo spinale, entra nei neuroni e offre un potenziale terapeutico.

Somministrazione intratecale di un composto di prova al sistema nervoso centrale del ratto

Modelli animali di malattia pediatrica possono sperimentare insorgenza precoce e la progressione della malattia aggressiva. Erogazione di una terapia clinicamente rilevanti per modelli giovani del mouse può essere tecnicamente difficile. Questo protocollo descrive un metodo di iniezione endovenosa non invasivo per topi neonati entro i primi due giorni di vita postnatale.

Le iniezioni per via endovenosa nel topo neonatale

Qui, descriviamo un metodo per fornire farmaci al sistema nervoso centrale del ratto impiantando un catetere nello spazio lombare intrateco della colonna vertebrale. Ci concentriamo sulla consegna di oligonucleotidi antisenso, anche se questo metodo è adatto per la consegna di altre modalità terapeutiche pure.

Consegna intratecala di Oligonucleotidi Antisense nel Rat Central Nervous System

Un metodo per la fornitura di cellule staminali neurali, adattabile per l'iniezione di soluzioni o sospensioni, attraverso l'arteria carotide comune (mouse) o l'arteria carotide esterna (ratto) dopo ictus ischemico è segnalato. Le cellule iniettate sono distribuite ampiamente in tutto il parenchyma cerebrale e possono essere rilevate fino a 30 d dopo la consegna.

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Qui viene descritto un approccio semplice e rapido per l'esecuzione di iniezioni intracerebroventricolari nei topi utilizzando un approccio a mano libera (cioè senza un dispositivo stereotassico).

Iniezioni intracerebroventricolari a mano libera nei topi

Presentiamo un protocollo per l'iniezione diretta del nervo vago nei ratti, che consente la somministrazione del farmaco direttamente nel nervo senza complicazioni post-iniezione. Questo metodo si applica agli studi neurologici preclinici che coinvolgono la manipolazione del sistema nervoso autonomo. Può essere utilizzato per l'iniezione diretta di nervi per altri nervi nei ratti e in altre specie, con le modifiche necessarie.

Protocollo di iniezione diretta del nervo vago per i ratti

Impara la consegna diretta di farmaci nel sistema nervoso centrale di roditori mediante catetere con pompa osmotica o iniezione nel ventricolo laterale destro. Questo protocollo dimostra l'efficacia degli oligonucleotidi antisenso.

Consegna diretta intraventricolare di farmaci per il sistema nervoso centrale, Roditore

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