Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

L'obiettivo generale di questa procedura è mostrare ad altri ricercatori come determinare la funzione renale nei topi svegli. Ciò si ottiene dializzando prima l'isotiocianato di fluoresceina o l'inulina FSE per 24 ore e determinando la sua concentrazione per l'iniezione. Il secondo passo consiste nel pesare il topo, preparare volumi accurati di inulina fitzy per l'iniezione retrobulbare e anestetizzare il topo.

Successivamente, viene eseguita l'iniezione di inulina Fitzy retrobulbare e vengono prelevati otto campioni di sangue in un periodo di 75 minuti. Il passaggio finale consiste nel misurare il Fitz Nulin utilizzando uno spettrometro al fluoro a microvolume e nel calcolare la funzione renale utilizzando un modello di decadimento esponenziale a due fasi. In definitiva, la combinazione della sensibilità del metodo di iniezione in bolo singolo Fiti Nulin con la capacità di microvolume dello spettrometro al fluoro consente di rilevare le differenze nella funzione renale causate da modifiche genetiche nei topi, cambiamenti nella dieta o applicazioni di farmaci.

I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'infusione continua e le condizioni anestetizzate, l'impianto di mini pompe osmotiche utilizzano inulina radioattiva sono che non è necessario alcun intervento chirurgico. Non è un esperimento terminale. Non è necessario raccogliere l'urina ed è possibile misurare fino a 24 M al giorno.

Dimostrerò questa procedura insieme a Maria Azimo, una ricercatrice associata del mio laboratorio per preparare la soluzione iniettabile di Fitzy Nulin. Pesare abbastanza inulina ZI per due millilitri di una soluzione al 5%, sciogliere l'inulina etichettata in una soluzione di cloruro di sodio allo 0,85% riscaldandola a 90 gradi Celsius fino a completa dissoluzione. Mettere un pezzo di membrana per dialisi da 20 centimetri in acqua distillata doppia per 30 minuti per rimuovere l'acido di sodio residuo dalla membrana, lavare la membrana un paio di volte in seguito, riempire correttamente la membrana per dialisi con il sigillo di inulina fitzy disciolto con le chiusure, quindi pesare l'intera membrana.

Lasciare dializzare l'inulina fitzy disciolta in un litro di soluzione di cloruro di sodio allo 0,85% e agitare lentamente al riparo dalla luce per 24 ore a temperatura ambiente dopo la dialisi, pesare nuovamente l'intera membrana di dialisi e calcolare la nuova concentrazione. L'acqua si sposterà osmoticamente nella membrana e l'FSI non legato uscirà dalla membrana. Pertanto, la concentrazione di inulina FSI diminuirà sostanzialmente.

Calcola la nuova concentrazione di inulina e fit usando questa formula dove C è la nuova concentrazione. N è la quantità iniziale di inulina E e V è il nuovo volume, che è la differenza di peso del tubo di dialisi prima e dopo la dialisi, più il volume della soluzione iniziale di inulina fitzy. Successivamente, sterilizzare la soluzione dialitizzata mediante filtrazione attraverso un filtro per siringa da 0,22 micron.

Ricorda di mantenere sempre l'inulina fitzy protetta dalla luce per evitare il fotosbiancamento prima dell'esperimento. Prendi il peso corporeo dei topi dopo aver anestetizzato brevemente i topi con fluoro ISO dal 4 al 5%. Controllare la profondità dell'anestesia con il riflesso di toin, aspirare due microlitri per grammo di peso corporeo di fitzy nulin dializzato utilizzando una siringa Hamilton da 100 microlitri con un ago da 26 gauge lungo mezzo pollice per rimuovere le bolle d'aria, quindi passare a un ago da 30 gauge lungo mezzo pollice per iniezione.

Procedere con l'iniezione dell'inulina fitzy dializzata nel plesso retroorbitale. Consenti ai topi di riprendersi spontaneamente nella loro gabbia domestica. Coppette una volta un millimetro di coda di topo con le forbici e raccogliete il sangue in più punti temporali dopo l'iniezione nei mini capillari dell'eparina sodica.

Sigillare i mini capillari dopo la raccolta del sangue con cha seal e mantenere i campioni al riparo dalla luce. Mettere i mini capillari sigillati all'interno dei capillari dell'ematocrito e centrifugare per cinque minuti dopo la centrifugazione. Rompi i mini capillari utilizzando una taglierina diamantata e trasferisci l'intero plasma mediante pipettaggio in una provetta da 0,2 millilitri.

Effettuare una diluizione da uno a 10 utilizzando due microlitri di plasma e 18 microlitri di 0,5 moli per litro in un nuovo tubo da 0,2 millilitri. Quindi, misurare due microlitri del campione diluito con NanoDrop 3, 300 in duplicati per un'elevata produttività di sei topi. Si prega di seguire il protocollo del diagramma di flusso fornito nel protocollo di testo per misurare la GFR del rene intero con il metodo di iniezione in bolo singolo, otto campioni di sangue devono essere raccolti a 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 e 75 minuti dopo l'iniezione di nulina FSE.

In questo diagramma di flusso, i numeri indicano i punti temporali di raccolta, mentre i numeri tra parentesi indicano i punti temporali del numero di campioni a sinistra della linea rossa verticale indicano i punti temporali dell'iniezione. Ogni mouse è contrassegnato con un colore diverso. Per ottenere raccolte di sangue sequenziali, segui le frecce.

Le caselle grigie indicano quando il topo successivo deve essere preparato per l'anestesia con fluoro prima dell'iniezione utilizzando questo protocollo. Il tempo minimo tra due raccolte di sangue da topi diversi è di un minuto per diluire la soluzione iniettabile di fitzy nulin con plasma di topo diluito per ottenere le diluizioni standard elencate nel protocollo di testo. La concentrazione degli standard dipenderà dalla dialisi e sarà sempre diversa per ogni preparazione di nulina FSI.

Pertanto, è necessario inserire ogni volta la concentrazione per la curva standard. Analizzare i dati per calcolare la velocità di filtrazione glomerulare o GFR con un software appropriato utilizzando una funzione di decadimento esponenziale a due fasi come descritto in dettaglio nel protocollo di testo per misurare la GFR nei topi coscienti. La cinetica plasmatica dell'inulina ZI dopo un'iniezione endovenosa a dose singola viene utilizzata per il calcolo del modello a due compartimenti GFRA nel modello a due compartimenti.

La fase iniziale di rapido decadimento rappresenta la ridistribuzione dell'inulina fitzy dal compartimento intravascolare al liquido extracellulare. La fase successiva, con decadimento più lento della concentrazione di inulina fitzy, riflette prevalentemente la clearance sistemica dal plasma. Il diabete mellito di tipo uno è stato indotto dall'applicazione intraperitoneale di streptozotocina.

La GFR è stata determinata prima e cinque settimane dopo l'induzione del diabete di tipo uno, gli animali diabetici mostrano chiaramente iperfiltrazione glomerulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la GFR in un topo di grandi dimensioni utilizzando una tecnica di iniezione in bolo singolo e impiegando un modello DK esponenziale a due fasi.