Imaging tridimensionale di fibre nervose nocicettive intraepidermiche in biopsie cutanee umane
29 aprile 2013
Per studiare i cambiamenti di fibre nervose nocicettive intraepidermiche (IENFs) nelle neuropatie dolorose (PN), abbiamo sviluppato protocolli che potrebbe esaminare direttamente le variazioni morfologiche tridimensionali osservati in IENFs nocicettivi. Analisi tridimensionale IENFs ha il potenziale di valutare le variazioni morfologiche del IENF in PN.
L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'immunoeistochemia su sezioni di biopsia cutanea umana per studiare i cambiamenti morfologici delle fibre nervose intraepidermiche associati alla neuropatia dolorosa mediante imaging tridimensionale. Questo viene ottenuto innanzitutto eseguendo un protocollo di immunoeistochemia su sezioni galleggianti della durata di tre giorni su singole sezioni di biopsia cutanea umana. Il secondo passaggio consiste nell'acquisire immagini di sezioni cutanee spesse 50 micron utilizzando un microscopio confocale.
Successivamente, i file di immagini della vista di flusso vengono elaborati con il software MRS per creare un file video tridimensionale delle immagini immunofluorescenti originali. L'ultimo passaggio consiste nell'utilizzare il software vdw o uno simile per comprimere il file video. In definitiva, i risultati dell'imaging tridimensionale permettono di studiare le modifiche morfologiche associate alla neuropatia dolorosa.
Attualmente, la densità delle fibre nervose epidermiche intraoperatoria viene utilizzata come metodo quantitativo per diagnosticare la neuropatia. La marcatura congiunta di queste fibre nervose intradermiche con il biomarcatore delle nocicettive potrebbe fornire informazioni sul dolore associato a questa complicanza. L'attuale protocollo di imaging bidimensionale presenta diversi limiti, tra cui il sovrapporsi delle fibre nervose.
Al contrario, l'imaging tridimensionale offre la possibilità di effettuare ulteriori analisi dei cambiamenti morfologici associati alla neuropatia, come il rigonfiamento e lo schiarimento assonale, nonché la misurazione del volume assonale. È importante sottolineare che è necessario adottare misure adeguate per ottenere immagini di qualità, in grado di generare animazioni tridimensionali significative, che possono fornire informazioni sulle neuropatie dolorose. Questo metodo può inoltre essere applicato ad altri campioni, come colture organotipiche spesse o colture cellulari tridimensionali, per esaminare e misurare complessi cambiamenti nella morfologia tridimensionale.
Dopo aver fissato e sezionato biopsie di pelle umana come descritto nella parte scritta di questo protocollo, etichettare una piastra a 96 pozzetti da utilizzare per la colorazione come mostrato in questa immagine. Quindi aggiungere 150 microlitri di segnale ITFX in ciascun pozzetto della riga uno della piastra a 96 pozzetti etichettata e pipettare 150 microlitri di uno XPBS in tutti i pozzetti delle righe due e tre. Utilizzare un’ansa di inoculazione per trasferire una sezione di 50 millimetri prelevata dalla biopsia della gamba distale di un paziente in uno dei pozzetti contenenti l’immagine.
Successivamente, trasferisca una sezione di 50 millimetri prelevata dalla porzione prossimale di cinque del medesimo paziente al pozzetto successivo contenente il reagente image. Ripeta questa procedura con le sezioni della gamba distale e della coscia prossimale di altri tre pazienti. Incubare le sezioni in image su un agitatore orizzontale per 30 minuti; mentre le sezioni di biopsia sono in incubazione in image, prepari una soluzione bloccante al 5% e vortichi la soluzione fino a quando l'BSA si sarà completamente disciolto. Trascorsi i 30 minuti, proceda con i passaggi successivi.
Trasferire i campioni nel PBS della riga due e agitare per 10 minuti, seguito da un risciacquo nel PBS della riga tre per 10 minuti. Successivamente, con agitazione, prelevare con la pipetta 150 microlitri di soluzione bloccante 5%BS in ciascun pozzetto della riga quattro e trasferire i campioni in questi pozzetti. Incubare i campioni in soluzione bloccante 5%BSA per uno-due ore a temperatura ambiente su un agitatore piano. Durante questa incubazione, preparare la soluzione di risciacquo all'1% vorticosando fino a quando l'BSA si sarà completamente disciolta, quindi diluire gli anticorpi primari alla concentrazione richiesta in questa soluzione.
Quindi aggiungere 150 microlitri di anticorpi primari diluiti nei pozzetti della riga cinque della piastra a 96 pozzetti. Al termine del periodo di incubazione, trasferire i campioni dalla soluzione di blocco nei pozzetti corrispondenti agli anticorpi primari. Successivamente, sigillare la piastra con parafilm e carta d’alluminio per evitare l’essiccamento e l’esposizione alla luce, quindi incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius su un agitatore piano. Il giorno seguente, aggiungere 150 microlitri di soluzione di lavaggio contenente 1% BSA in ciascun pozzetto delle righe sei, sette e otto, e far passare i campioni attraverso questi lavaggi per un’ora con agitazione a temperatura ambiente, assicurandosi che la piastra sia protetta dalla luce durante ciascun lavaggio. Mentre i campioni sono in incubazione nell’ultimo lavaggio con soluzione di lavaggio contenente 1% BSA, diluire gli anticorpi secondari nella stessa soluzione in base alle istruzioni riportate nella parte scritta dei protocolli.
Trascorso il tempo di incubazione, aggiungere 150 microlitri di anticorpi secondari diluiti nelle pozzette designate della riga nove della piastra a 96 pozzette, trasferire le sezioni in queste pozzette e coprire la piastra con paraform e carta d'alluminio, quindi incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius su un agitatore piano. Il giorno successivo, aggiungere 150 microlitri di soluzione di risciacquo al 1% BSA in ciascuna pozzetta delle righe 10, 11 e 12, e risciacquare le sezioni in questa soluzione per un'ora ciascuna, come in precedenza.
Mentre i campioni bioptici sono in incubazione nell'ultimo risciacquo con soluzione di BSA al 1%, preparare i vetrini pipettando 50 microlitri di soluzione di risciacquo di BSA al 1% su un vetrino alla volta. Rimuovere il campione dall'ultimo risciacquo e posizionarlo nella goccia di 50 microlitri di soluzione di risciacquo di BSA al 1% sul vetrino designato. Dopo aver ottimizzato la posizione del campione, rimuovere l'eccesso di soluzione di risciacquo di BSA al 1% con una pipetta di vetro a bulbo, avendo cura di non toccare il campione.
Posizionare una goccia di reagente prolungato per montaggio con protezione antiossidante contenente DPI vicino alla biopsia su un vetrino da microscopio. Prendere quindi un coprioggetto di vetro da 22 per 22 millimetri e posizionarlo delicatamente sulla biopsia e sulla goccia di reagente per montaggio. Rimuovere eventuali bolle d'aria utilizzando la punta di una pipetta e asciugare l'eccesso di reagente prolungato.
Reagente Antifa. Ripetere per ogni sezione e lasciare asciugare le vetture al microscopio durante la notte a temperatura ambiente al buio il giorno successivo. Acquisire i segnali fluorescenti utilizzando un microscopio confocale, in questo caso un microscopio confocale a scansione laser Olympus Flow View 500 equipaggiato con un obiettivo ad immersione in olio 40x e ingrandimento due volte, mediante il software Flow View versione 5.0.
Utilizzare Alexa floor 4 88 e Alexa floor 6 47 per eccitare rispettivamente il laser verde all'elio-neon a 543 nanometri e il laser rosso all'elio-neon a 633 nanometri. Impostare le aperture confocali per ciascun rivelatore a 400 micron per potenziare i segnali. Le scansioni sequenziali devono essere eseguite con una risoluzione di 10 24 per 10 24.
Per massimizzare la separazione del segnale, acquisire serie Z tridimensionali utilizzando intervalli di passo Z di 1,2 micron basati sull'unità di scansione ottimale, calcolata dal software flow view con media di due frame kalman; aprire prima i file flow view nel software MRSX 64 o equivalente. Per visualizzare i set di immagini 3D, regolare la visualizzazione secondo necessità per migliorare il contrasto del segnale specifico del nervo. Creare una superficie per visualizzare il confine dermo-epidermico.
Utilizzare lo strumento di contorno in modalità disegno per tracciare il bordo. Assegnare una superficie semi-trasparente al bordo al fine di visualizzare i segnali fluorescenti sottostanti e acquisire immagini fisse dei segnali fluorescenti tridimensionali. Per creare immagini fisse del filmato 3D, utilizzare la funzione di animazione per creare un'animazione del filmato 3D impostata su 200 fotogrammi, animata a 15 fotogrammi al secondo.
Salvare ogni filmato come file A VI grezzo e comprimere il filmato A VI finale con software VirtualDub o simili. Questo video mostra immagini tridimensionali di fibre nervose intraepidermiche nocicettive. Questa prima immagine mostra fibre nervose intraepidermiche positive per PGP, marcate in verde, che rappresentano tutte le fibre nervose intraepidermiche, e fibre nervose intraepidermiche positive per track, marcate in rosso, che rappresentano le fibre nervose intraepidermiche nocicettive.
E infine, l'immagine ottenuta mostra fibre nervose nocicettive intraepidermiche positive al PGP in un campione di pelle del caso uno; la barra della scala rappresenta 20 micron. Il seguente video mostra immagini tridimensionali di rigonfiamenti assonali nelle fibre nervose intraepidermiche delle neuropatie dolorose. I rigonfiamenti assonali, indicati dalle frecce, possono essere osservati lungo le fibre nervose intraepidermiche marcate con PGP mediante un segnale verde all'interno del plesso sottodermaico.
In un campione di pelle del caso due, la scala rappresenta 10 micron. Questa immagine 3D mostra il ramificarsi assonale nelle fibre nervose intraepidermiche della neuropatia dolorosa. Il ramificarsi assonale, indicato dalle frecce, può essere osservato lungo le fibre nervose intraepidermiche marcate con PGP mediante un segnale verde in un campione di pelle del caso tre.
La barra della scala rappresenta 20 micrometri. Una volta acquisita, questa tecnica può essere completata in quattro giorni, per tre ore e mezza al giorno per l'immunohistochimica e 35 minuti per campione per l'immagine confocale e l'animazione 3D. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di trasferire e montare correttamente i tessuti, adottando precauzioni per evitare strappi o lacerazioni nei campioni. Seguendo questo protocollo, possono essere eseguiti altri metodi, come l'analisi tridimensionale tric per la valutazione dell'innovazione cutanea, al fine di rispondere a ulteriori domande.
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Panoramica
Questo studio si concentra sui cambiamenti morfologici delle fibre nervose intraepidermiche nocicettive (IENFs) nelle neuropatie dolorose (PN) utilizzando tecniche di imaging avanzate. Attraverso l'analisi tridimensionale, la ricerca mira a fornire informazioni sulle alterazioni strutturali delle IENFs associate alle PN.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunoeistochimica
- Patologia
Sfondo
- Le IENF nocicettive svolgono un ruolo fondamentale nella percezione del dolore.
- Le alterazioni delle IENF sono associate a diverse condizioni di dolore neuropatico.
- L'imaging tridimensionale può migliorare la comprensione della morfologia delle fibre nervose.
- I metodi attuali potrebbero non cogliere appieno la complessità dei cambiamenti nelle IENF.
Scopo dello studio
- Studiare i cambiamenti morfologici delle IENF nella neuropatia periferica.
- Sviluppare protocolli per l'immagine tridimensionale delle IENF.
- Valutare il potenziale di questi metodi nella ricerca clinica.
Metodi Utilizzati
- Immunoeistochimica su sezioni di biopsia cutanea umana.
- Protocollo di sezione galleggiante di tre giorni per campioni di pelle.
- Acquisizione di immagini di sezioni spesse 50 micron mediante microscopia confocale.
- Creazione di file video tridimensionali utilizzando il software MRS.
Risultati principali
- Visualizzazione con successo delle IENF in tre dimensioni.
- Identificazione dei cambiamenti morfologici associati alla NP.
- Migliore comprensione delle alterazioni delle fibre nervose in condizioni dolorose.
- Potenziali applicazioni nella diagnosi e nel trattamento del dolore neuropatico.
Conclusioni
- L'imaging tridimensionale è uno strumento prezioso per lo studio delle IENF.
- I risultati potrebbero portare a una migliore comprensione delle neuropatie dolorose.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare le implicazioni cliniche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'imaging tridimensionale delle fibre nervose nocicettive intraepidermiche consente una riduzione meccanicistica dei rischi nella validazione di bersagli del dolore, risolvendo strutture sovrapposte che ostacolano l'analisi in 2D. Questo approccio supporta lo screening fenotipico dei meccanismi del dolore neuropatico attraverso parametri morfologici quantitativi, come il rigonfiamento assonale e il ramificarsi delle fibre. Una maggiore affidabilità predittiva nell'interazione con il bersaglio si ottiene collegando i cambiamenti strutturali ai fenotipi di neuropatia dolorosa in sistemi pertinenti all'uomo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione di cambiamenti specifici delle fibre nocicettive nei campioni di pelle umana.
- Valore operativo: Fornisce una riduzione del rischio biologico attraverso la visualizzazione diretta dell'interazione con il bersaglio nelle vie del dolore.
- Valore scientifico: Sostiene la capacità predittiva correlando biomarcatori strutturali con fenotipi di neuropatia dolorosa.
Screening e sviluppo di saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive mediante co-immunomarcatura di PGP e Trk A per distinguere l'innervazione totale da quella nocicettiva.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione del saggio attraverso protocolli di imaging confocale e ricostruzione 3D che minimizzano gli artefatti di sovrapposizione.
- Valore operativo: Evidenzia la prontezza per lo screening consentendo la misurazione quantitativa del volume assonale, del rigonfiamento e della ramificazione come endpoint fenotipici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Analizza la rilevanza clinica collegando i cambiamenti morfologici nelle fibre nervose epidermiche umane ai meccanismi della neuropatia dolorosa.
- Valore operativo: Descrive la continuità dallo stadio di scoperta alla validazione preclinica, stabilendo un saggio rilevante per l'uomo per la modulazione del bersaglio.
- Valore scientifico: Si concentra sulla riduzione del rischio predittivo identificando alterazioni strutturali che potrebbero prevedere gli esiti clinici del dolore.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto attivo, fornendo un fenotipaggio strutturale delle fibre nocicettive in biopsie cutanee rilevanti per l'uomo.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica di ipotesi, la chiarificazione di vie biologiche o la riduzione del rischio biologico attraverso la visualizzazione di cambiamenti specifici delle fibre nocicettive.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio, la riproducibilità o le uscite quantitative, quando supportate dall'articolo mediante imaging tridimensionale di sezioni di cute marcate con immunofluorescenza.
- Analisi: Evidenzia misurazioni, letture o risultati statistici che aiutano i gruppi a confrontare condizioni, inclusi volume assonale, rigonfiamenti e parametri di ramificazione.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica o all'allineamento con biomarcatori solo quando la fonte lo supporta utilizzando biopsie di cute umana per modellare una neuropatia dolorosa.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, grazie a protocolli standardizzati di colorazione, acquisizione di immagini e ricostruzione tridimensionale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Esperienza scientifica richiesta in immunoeistochimica, microscopia confocale e analisi di immagini 3D.
- Necessità di strumentazione e infrastrutture analitiche, inclusi microscopio confocale con capacità di sezione in Z e software per la ricostruzione 3D.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi di lavoro per protocolli di colorazione, parametri di acquisizione delle immagini e quantificazione morfologica.
- Considerazioni sull'adattamento in diversi sistemi modello, come colture organotipiche spesse o colture cellulari 3D, per lo studio di complesse modificazioni morfologiche.
- Limitazioni pratiche supportate dalla letteratura, tra cui la necessità di un'acquisizione di immagini di qualità per generare animazioni 3D significative e la natura intensiva in termini di tempo del protocollo (superiore ai quattro giorni).
