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L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare i monociti dal sangue periferico umano e differenziarli verso diversi tipi di polarizzazione dei macrofagi. Ciò si ottiene isolando prima le cellule mononucleate del sangue periferico umano mediante centrifugazione in gradiente di densità. In una seconda fase, viene eseguito l'isolamento negativo delle microsfere per ottenere monociti positivi al CD 14 puro.

Successivamente, i monociti vengono coltivati in condizioni specifiche al fine di indurre macrofagi specificamente polarizzati. In definitiva, l'espressione differenziale dei marcatori di polarizzazione dei macrofagi in risposta alle loro condizioni di coltura può essere determinata mediante PCR quantitativa. Questo metodo può aiutare a sezionare la differenziazione dei macrofagi verso diversi tipi di polarizzazione.

Una caratteristica estremamente importante nelle malattie infiammatorie come l'aterosclerosi. Dopo aver prelevato 30 millilitri di sangue intero dalla vena dell'avambraccio da un volontario, dividere il sangue in modo uniforme in due tubi conici da 50 millilitri non in polistirene. Quindi diluire il sangue in ogni provetta con 10 millilitri di PBS.

Successivamente, aggiungere 25 millilitri di histo pack ai 25 millilitri di sangue intero e PBS in ciascuna provetta, facendo attenzione che l'histo pack e il sangue non si mescolino. Quindi centrifugare le provette per 30 minuti a 400 g e temperatura ambiente senza interruzioni. Dopo la centrifuga, aspirare prima lo strato di plasma e poi trasferire lo strato di interfaccia opaco in una provetta fresca da 50 millilitri.

Lavare le celle dall'interfaccia in 20 millilitri di PBS più CDTA per cinque minuti a 250 Gs e quattro gradi Celsius. Quindi, dopo aver scartato il surnatante resus, sospendere il pellet in 10 millilitri di PBS più CDTA e mescolare bene le cellule agitando per 10 secondi. Ora diluire 200 microlitri di sospensione cellulare in 300 microlitri di PBS più EDTA e 500 microlitri di triam blue.

Per ottenere circa 200-500 cellule per 10 quadrati e un emocitometro iniziare l'isolamento negativo facendo girare le cellule tre volte per 10 minuti a 120 Gs Dopo il secondo lavaggio, sospendiamo il pellet in nove millilitri di acqua sterile per tre secondi. Quindi aggiungere un millilitro di 10 XPBS dopo aver lavato e contato le cellule ancora una volta, diluirle in un tampone easy set a cinque volte 10 delle sette cellule per millilitro. Ora incubare le cellule per 10 minuti a quattro gradi Celsius in 50 microlitri per millilitro di cocktail di arricchimento di monociti.

Durante l'ultimo minuto del vortice di incubazione, il cet monocita l'arricchimento perle per 30 secondi. Quindi aggiungere 50 microlitri per millilitro di perle alle cellule e incubare la perlina in sospensione cellulare per altri cinque minuti. Dopo la seconda incubazione, portare il volume della soluzione cellulare fino a 2,5 millilitri.

Con più buffer eep, la soluzione apparirà ora di un colore brunastro. Quindi, posizionare il tubo in un magnete eep per due minuti e mezzo a temperatura ambiente. Dopo che le cellule legate alle perle hanno avuto la possibilità di attaccarsi, versare il tampone contenente i monociti non leganti in una nuova provetta sterile.

La soluzione apparirà ora di un colore biancastro dopo aver lavato una volta le cellule non legate con PBS più EDTA, trasferire le cellule in una piastra a più pozzetti, quindi aggiungere un millilitro di terreno di coltura per uno volte 10 alle sei cellule della piastra di coltura. Infine, coltivare le cellule nelle condizioni sperimentali di interesse per sei giorni per indurre la differenziazione dei macrofagi. Sostituire metà del supporto dopo tre giorni con un nuovo supporto dopo sei giorni.

Raccogliere le cellule per l'analisi sperimentale desiderata. Utilizzando il protocollo sopra descritto, circa 25 volte 10 dei sei monociti vengono ottenuti di routine da 100 millilitri di purezza dei monociti nel sangue, come determinato dalla colorazione citofluorimetrica per CD 14, è di routine superiore al 95% quando viene aggiunto per la prima volta alla coltura. I monociti sono inizialmente di forma rotonda e galleggiano nel giro di poche ore.

Tuttavia, aderiscono, dando loro un aspetto simile a un uovo fritto o a un fuso dopo sei giorni. In coltura con MCSF da solo o con l'aggiunta di LDL ossidato nelle ultime 24 ore, circa l'80% delle cellule non esposte a LDL ossidate sono vitali come determinato dallo ioduro di propidio. Il trattamento di colorazione con LDL ossidato, d'altra parte, determina circa il 70% di vitalità cellulare dopo sei giorni di coltura.

Con il flusso MCSF, l'analisi citometrica dimostra che mentre le cellule continuano a esprimere il marcatore leucocitario CD 45 ro, sottoregolano il marcatore monocitario CD 14. A seconda delle condizioni specifiche che possono indurre la polarizzazione dei macrofagi durante la coltura cellulare, sono necessari ulteriori marcatori per garantire il successo della polarizzazione. Condizioni specifiche possono indurre la polarizzazione dei macrofagi.

Ad esempio, i macrofagi polarizzati M1 esprimono marcatori tipici come IL sei e TNF alfa, mentre i macrofagi polarizzati M due esprimono CD 36 e CD 2 0 6, i macrofagi possono essere ulteriormente studiati in esperimenti funzionali. Ad esempio, l'assorbimento di LDL ossidato può essere studiato utilizzando LDL marcate in fluorescenza. In questo esperimento, le cellule sono state esposte a 10 microgrammi per millilitro di LDL ossidato marcato con DII per quattro ore e i nuclei si sono colorati con dpi.

L'istogramma dimostra la misurazione citofluorimetrica dell'assorbimento di LDL ossidato DII da parte dei macrofagi indotti da MCSF, con l'istogramma grigio solido che rappresenta le cellule di controllo non trattate e l'istogramma nero aperto. Rappresenta i macrofagi LDL ossidati trattati dopo il suo sviluppo. Questa tecnica consente ai ricercatori di studiare la differenziazione e l'eterogeneità dei macrofagi umani.

In tal modo consente loro di studiare malattie infiammatorie come l'aterosclerosi per identificare nuovi meccanismi di malattia e nuovi bersagli terapeutici.