Name: Un In vitro Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Impara a isolare monociti dal sangue periferico umano e a differenziarli in macrofagi polarizzati. Questo modello in vitro utilizza centrifugazione a gradiente di densità e PCR quantitativa per studiare l'eterogeneità di differenziazione.

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Ringraziamo Nadine Wambsganss per l&#39;eccellente supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) e in parte da una sovvenzione da parte del Fondo Innovazione FRONTIER (Università di Heidelberg) a CAG

1. Protocollo <ol><li> Preparare Buffer come segue: <ol><li> Preparare tampone per l&#39;isolamento PBMC: &quot;Tampone di lavaggio&quot; = 0,02% in PBS EDTA (uso 0.5 M EDTA). </li><li> Preparare buffer per l&#39;isolamento dei monociti: &quot;MACS risciacquo cuscinetto&quot; = 0,5% di BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 microlitri) PBS + (50 ml). Degas il buffer. </li><li> Preparare tampone per FACS colorazione e conservazione di cellule: &quot;FACS tampone&quot; = 10% FCS in PBS e &quot;Tampone di fissaggio&quot; = 1% in PBS PFA. </li></ol></li><li> Disegnare 30 ml di sangue intero da una vena dell&#39;avambraccio. Utilizzare EDTA come anticoagulante. </li><li> Isolare PBMC (HISTOPAQUE) come segue: <ol><li> Preparare due provette sterili ml 50 (senza poli-stirene). </li><li> Diluire il sangue dal punto 2 con PBS 1:1. </li><li> Aggiungere 25 ml HISTOPAQUE + 25 ml di sangue intero / PBS per provetta. Assicurarsi che HISTOPAQUE e il sangue non si mescolano. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 30 min a TA, nessun freno. </li><li> Aspirare al plasma e degli scarti. </li><li> Aspirare interfaccia opaca e trasferirli in clean 50 ml vascae. </li><li> Aggiungere 20 ml di 0,02% in PBS EDTA. </li><li> Centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 10 ml di 0,02% in PBS EDTA. </li></ol></li><li> Contare le cellule come segue: <ol><li> Mescolare bene nel vortex per 10 sec. </li><li> Prendete 200 microlitri di sospensione cellulare + 300 ml 0,02% in PBS EDTA + 500 ml di Trypan blu (200-500 cells/10 piazze, altrimenti cambiare fattore di diluizione). </li></ol></li><li> Procedere all&#39;isolamento negativo di monociti come segue: <ol><li> Centrifugare cellule ottenute nel passo 3.10 per 10 min, 120 x g. Scartare il surnatante. </li><li> Lavare pellet cellulare 2x aggiungendo 10 ml di PBS + 0,02% EDTA e centrifugare per 10 min, 120 x g. </li><li> Aggiungere 9 ml di acqua sterile per 3 sec, aggiungere 1 ml di PBS 10X. </li><li> Lavare nuovamente con PBS + 0,02% EDTA e centrifugare 10 min, 120 x g. </li><li> Conte durante la centrifugazione. </li><li> Diluire in tampone EasySep a 5 x 10 7 / ml. </li><li> Aggiungere 50 cazzo arricchimento monociti microlitri / mlcoda. </li><li> Incubare per 10 min a 4 ° C. </li><li> Perline Vortex per 30 sec. </li><li> Aggiungere 50 perle microlitri / ml. </li><li> Incubare per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Riempire con tampone EasySep per completare il volume di 2,5 ml. La soluzione appare ora brunastro. </li><li> Metti nel magnete. </li><li> Attendere 2,5 minuti a temperatura ambiente. Durante questo periodo cellule non monocitiche legati alla perla magnetica si muoveranno sulla parete del tubo e bastone lì. </li><li> Versare il tampone con monociti non vincolanti in provetta sterile. Questa soluzione sembra biancastro. </li><li> Lavare una volta con PBS + 0,02% EDTA e centrifugare per 10 minuti, 120 x g. </li></ol></li><li> Cellule piastra in un piatto di plastica o lamiera multiparete ad una densità di 0,5 x 10 6 / cm 2. Aggiungere 1 ml di mezzo di coltura / 1 x 10 6 cellule. </li><li> Cellule di coltura in condizioni di interesse per 6-14 giorni. </li><li> Cambiare i media dopo 3 giorni, sostituendo il 50% dei mezzi di comunicazione con mezzi freschi (vedi Tabella 1 per i dettagli). </li><li>Sei giorni dopo, le cellule raccolto per l&#39;isolamento di mRNA, citometria a flusso, Western blotting, ecc. </li></ol>

<ol><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+plasticity+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes.</a> European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Ingersoll, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene+expression+profiles+between+human+and+mouse+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets.</a> Blood. 115, 10-19 (2010).</li>
<li>Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+aldose+reductase+during+foam+cell+formation+as+possible+link+among+diabetes%2C+hyperlipidemia%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).</li>
<li>Gleissner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCL4+downregulates+the+atheroprotective+hemoglobin+receptor+CD163+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages.</a> Circ. Res. , (2009).</li>
<li>Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXC+chemokine+ligand+4+induces+a+unique+transcriptome+in+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages.</a> J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization%3A+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li>
<li>Verreck, F. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+il-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+il-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+%28myco%29bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li>
<li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> PLoS One. 7, e42656(2012).</li>
<li>Boyle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+intraplaque+hemorrhage+evokes+a+novel+atheroprotective+macrophage+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype.</a> American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).</li>
<li>Cho, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dendritic+cell-like+phenotype+in+macrophages+during+foam+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation.</a> Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).</li>
<li>Vogt, G., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+human+macrophages+with+enhanced+antimycobacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).</li>
<li>Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+low+density+lipoprotein+exposure+alters+the+transcriptional+response+of+macrophages+to+inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus.</a> Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).</li>
<li>Qin, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+pma-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5, e8668(2010).</li>
<li>Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWahl%2C+LM+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Martín-Fuentes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+variation+of+scavenger+receptor+expression+in+human+macrophages+with+oxidized+low-density+lipoprotein+is+associated+with+a+differential+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response.</a> The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno di rivelare qualsiasi conflitto di interesse.

Macrofagi derivate da monociti rappresentano il tipo cellula fondamentale del sistema immune innato. Essi svolgono un ruolo importante in molte malattie infiammatorie comprese aterosclerosi o cancro 2. Pertanto, lo studio della biologia dei macrofagi è essenziale per aumentare la nostra conoscenza sulla fisiopatologia di molte malattie e per consentire lo sviluppo di nuove terapie. Molti studi si applicano modelli di topo iperespressione o privi alcuni geni di interesse. Nel caso ...

Macrofagi derivate da monociti rappresentano un importante componente cellulare del sistema immunitario innato e contribuiscono a molti processi infiammatori acuti o cronici 1. I macrofagi giocano un ruolo importante in molte malattie infiammatorie come l&#39;aterosclerosi o il cancro 2. Macrofagi mostrano un elevato grado di plasticità e sono in grado di assumere differenti fenotipi seconda del micromilieu locale 3. Così, studiando la differenziazione dei macrofagi e l&#39;eterogeneità è essenziale per aumentare la nostra conoscenza della fisiopatologia di molte malattie e per consentire l&#39;identificazione di nuovi bersagli terapeutici e lo sviluppo di nuove terapie. In molti casi, i modelli murini sono usati per studiare la fisiopatologia di malattie specifiche. Tuttavia, lo studio della biologia dei macrofagi utilizzando modelli murini è accompagnato da numerose carenze: (1) La percentuale dei numeri sottoinsieme di leucociti (ossia monociti e granulociti) in peripHeral sangue di topi o esseri umani differisce significativamente suggerendo diversi ruoli dei monociti in fisiopatologia murine e umane. (2) Non ci sono sostanziali differenze nell&#39;espressione genica tra murine e umane monociti del sangue periferico che suggeriscono differenze sostanziali nella loro funzione durante la salute e la malattia 4. (3) Un numero di marcatori che vengono utilizzati per identificare i monociti e macrofagi murini (F4/80, LYC, ecc.) Non esiste in cellule mieloidi umane, rendendo il trasferimento dei risultati in modelli murini per la situazione umana piuttosto difficile. Pertanto, al fine di aumentare la nostra comprensione della differenziazione dei macrofagi e l&#39;eterogeneità nella malattia umana, abbiamo bisogno di fare uso di modelli di lavoro con i macrofagi umani. Pertanto, noi qui descriviamo un modello di generazione macrofagi primari umani che è facile da usare e permette studio dei macrofagi derivate da monociti umani in vitro in condizioni diverse conseguente diversa macrofagi PoTipi di vascolarizzazione. In diversi studi, abbiamo usato il modello in vitro di monociti derivati ​​da macrofagi umani primari per analizzare la biologia dei macrofagi e la sua potenziale rilevanza per l&#39;aterosclerosi umana 5-7. Anche se non sostituendo completamente gli esperimenti con gli animali o tessuti umani ottenuti post mortem, il modello qui descritto consente l&#39;identificazione e la validazione dei meccanismi della malattia e bersagli terapeutici che possono essere molto importanti per diverse patologie umane.

<table><tbody><tr><td>Provetta da centrifuga da 50 ml (sterile)</td><td>Fisher</td><td>055398</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1X), liquido (senza calcio o magnesio)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-8806</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit per l'arricchimento di monociti umani</td><td>StemCell Technologies</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>tubi FACS</td><td>Fisher</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Macrofago-SFM (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P-4458</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td></td></tr><tr><td>umano M-CSF 10 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>Fisher</td><td>07-200-80</td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vitro</em&gt; modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Macrofagi derivate da monociti rappresentano un importante tipo di cellule del sistema immune innato. Modelli murini che studiano la biologia dei macrofagi soffrono delle differenze fenotipiche e funzionali tra murine e umane derivate da monociti macrofagi. Pertanto, noi descriviamo qui un modello in vitro per generare e studiare macrofagi umani primari. In breve, dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue periferico prelevato da una vena dell&#39;avambraccio, monociti sono isolati da cellule mononucleate del sangue periferico utilizzando negativo magnetico isolamento tallone. Questi monociti vengono poi coltivate per sei giorni in condizioni specifiche per indurre diversi tipi di differenziamento macrofagi o polarizzazione. Il modello è facile da usare e elude i problemi causati dalle differenze specie-specifiche tra topo e uomo. Inoltre, è più vicino alla condizioni in vivo che l&#39;uso di linee cellulari immortalizzate. In conclusione, il modello qui descritto è adatto per studiare macrophage biologia, individuare meccanismi di malattia e nuovi target terapeutici. Anche se non sostituendo completamente gli esperimenti con gli animali o tessuti umani ottenuti post mortem, il modello qui descritto consente l&#39;identificazione e la validazione dei meccanismi della malattia e bersagli terapeutici che possono essere molto importanti per diverse patologie umane.

Utilizzando il protocollo sopra descritto, abbiamo quotidianamente otteniamo 25,1 x 10 6 ± 2.2 x 10 6 monocytes/100 ml di sangue (± errore standard medio di 26 esperimenti indipendenti, Figura 1A). Purezza monociti come determinato dal flusso citometria colorazione per CD14 è ordinariamente maggiore del 95% (97,1 ± 0,4%, ± errore standard media di 3 esperimenti indipendenti, Figura 1B). La vitalità cellulare dei monociti appena isolate come determinato da trypan bl...

Derivate da monociti macrofagi sono cellule importanti del sistema immune innato. Qui, descriviamo un facile da usare<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per generare queste cellule. Utilizzando centrifugazione in gradiente, isolamento perlina negativo e specifiche condizioni di coltura cellulare, macrofagi derivate da monociti possono essere generati per studi fenotipici e funzionali.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare i monociti dal sangue periferico umano e differenziarli verso diversi tipi di polarizzazione dei macrofagi. Ciò si ottiene isolando prima le cellule mononucleate del sangue periferico umano mediante centrifugazione in gradiente di densità. In una seconda fase, viene eseguito l'isolamento negativo delle microsfere per ottenere monociti positivi al CD 14 puro.Successivamente, i monociti vengono coltivati in condizioni specifiche al fine di indurre macrofagi specificamente polarizzati. In definitiva, l'espressione differenziale dei marcatori di polarizzazione dei macrofagi in risposta alle loro condizioni di coltura può essere determinata mediante PCR quantitativa. Questo metodo può aiutare a sezionare la differenziazione dei macrofagi verso diversi tipi di polarizzazione.Una caratteristica estremamente importante nelle malattie infiammatorie come l'aterosclerosi. Dopo aver prelevato 30 millilitri di sangue intero dalla vena dell'avambraccio da un volontario, dividere il sangue in modo uniforme in due tubi conici da 50 millilitri non in polistirene. Quindi diluire il sangue in ogni provetta con 10 millilitri di PBS.Successivament

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Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra l'innesco dei monociti primari nei macrofagi. I monociti umani primari possono essere isolati e differenziati in un fenotipo pro-infiammatorio M1-simile utilizzando il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) o in un fenotipo antinfiammatorio M2-simile utilizzando il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF).

Coltura in vitro e differenziazione dei monociti primari in macrofagi

In questo video, dimostriamo una procedura per indurre la differenziazione e la polarizzazione di monociti derivati dal sangue periferico in macrofagi M1 o M2. L'incubazione con fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi, lipopolisaccaride e interferone-gamma produce macrofagi M1 pro-infiammatori, mentre l'incubazione con fattore stimolante le colonie di macrofagi e interleuchina-4 induce la produzione di macrofagi M2 antinfiammatori.

Differenziazione e polarizzazione di cellule derivate da monociti in cellule simili ai macrofagi

L'articolo descrive un semplice facilmente...

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

Presentiamo un protocollo semplice ed efficiente per la generazione di macrofagi umani. Buffy coats sono trattati con doppia centrifugazione in gradiente di densità e monociti isolati sono poi differenziate a macrofagi in sacchi di coltura cellulare teflonato. Questo massimizza i rendimenti macrofagi e facilita la raccolta di cellule per esperimenti successivi.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Presentato qui è un protocollo per rilevare la produzione di trap extracellulari macrofalo (MET) nella coltura di cellule vive utilizzando microscopia e colorazione a fluorescenza. Questo protocollo può essere ulteriormente esteso per esaminare specifici marcatori proteici MET mediante colorazione immunofluorescenza.

Stimolazione in vitro e visualizzazione del rilascio di trap extracellulari nei Macrofagi derivati da Monciti Umani differenziati

Questo protocollo descrive la robusta generazione di macrofagi da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e metodi per la loro successiva caratterizzazione. L'espressione del marcatore di superficie cellulare, l'espressione genica e i saggi funzionali vengono utilizzati per valutare il fenotipo e la funzione di questi macrofagi derivati da iPSC.

Produzione e caratterizzazione di macrofagi umani da cellule staminali pluripotenti

Questo protocollo fornisce un metodo per studiare l'infezione da Mycobacterium tuberculosis nei macrofagi polarizzati M1 o M2 umani basati sulla differenziazione dei monociti del sangue periferico alle cellule simili a macrofagi che sono infettate dal ceppo virulento H37Rv etichettato GFP e analizzate con citometria a flusso utilizzando un pannello a 10 colori che include l'espressione di marcatori M1/M2 selezionati.

Polarizzazione delle cellule derivate da monociti umani M1 e M2 e analisi con citometria a flusso sull'infezione da tubercolosi del micobatterio

I macrofagi associati al tumore M2-like (TAM) sono associati alla progressione del tumore e alla prognosi sfavorevole nel cancro. Questo protocollo serve come guida dettagliata per differenziare e polarizzare in modo riproducibile le cellule simili ai monociti THP-1 in macrofagi simili a M2 entro 14 giorni. Questo modello è la base per studiare gli effetti antinfiammatori della TAM all'interno del microambiente tumorale.

Differenziazione e polarizzazione dei macrofagi in un fenotipo M2-like utilizzando una linea cellulare di leucemia THP-1 simile a un monocita umano

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per valutare il potenziale immunomodulatorio delle superfici implantari in vitro, con l'obiettivo di migliorare l'affidabilità e la riproducibilità dei protocolli attuali e promuovere ulteriori ricerche. I profili delle citochine secretorie, l'espressione dell'mRNA e i marcatori della superficie cellulare sono stati monitorati utilizzando macrofagi derivati da monociti nel sangue per studiare la polarizzazione dei macrofagi coltivata sul titanio.

Polarizzazione e caratterizzazione di macrofagi derivati da monociti umani M1 e M2 su superfici implantari 

I monociti e i macrofagi sono cellule immunitarie molto plastiche e riprogrammabili, cruciali per la salute e la malattia. Percepiscono e rispondono a un'ampia gamma di stimoli adottando specifici programmi di differenziazione e fenotipi. Abbiamo standardizzato un modello in vitro per studiare la polarizzazione e la riprogrammazione dei macrofagi, fornendo uno strumento prezioso per la ricerca.

Riprogrammazione del modello di macrofagi derivati da monociti umani per saggi in vitro

Impara a isolare monociti dal sangue periferico umano e a differenziarli in macrofagi polarizzati. Questo modello in vitro utilizza centrifugazione a gradiente di densità e PCR quantitativa per studiare l'eterogeneità di differenziazione.

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