Separazione dei Plasmodium falciparum Fine Stage-eritrociti infettati da mezzi magnetici
2 marzo 2013
Le proprietà paramagnetiche di emozoina sono utilizzati per isolare fasi avanzate della Plasmodium falciparum-Infetti globuli rossi crescono in coltura. Il metodo è semplice e veloce e non influenza le capacità invasive successive dei parassiti.
Il Plasmodium falciparum è un parassita umano che vive esclusivamente all'interno dei globuli rossi. Nel processo di crescita, utilizza le molecole all'interno degli eritrociti per nutrirsi di loro, e poiché le molecole di ferro all'interno dell'emoglobina sarebbero tossiche per il parassita, le prende e le mette in un cristallo inerte chiamato emina. Questo cristallo di emo conferisce un certo magnetismo param ai parassiti.
È questa proprietà paramagnetica che viene utilizzata per separare gli eritrociti infetti da quelli che non portano un parassita all'interno. Con l'uso di un magnete, una coltura che ha una percentuale molto bassa di parassiti può essere concentrata per ottenere quasi il cento per cento di paras. Questa separazione dei globuli rossi infetti da quelli non infetti è molto desiderabile in una serie di esperimenti in cui un particolare tratto del parassita deve essere studiato senza i fattori confondenti degli eritrociti in eccesso.
La metodologia mostrata qui è veloce, semplice e innocua per il parassita. Oggi descriveremo la procedura di separazione del plasmodium falciparum dello stadio chizen. Questa attrezzatura multicomponente deve essere assemblata per ogni canto. Isolamento.
Posizionare prima il supporto della colonna sul supporto metallico, quindi la colonna magnetica viene posizionata sul supporto del set. Per la nostra procedura, utilizziamo Ls, colonne di milian. Successivamente, utilizziamo un tubo da 50 ml per aggiungere 23,2 ml di RPMI 1640 e 750 microlitri di una soluzione di barcarbonato di sodio al 7,5%, che deve essere la soluzione di lavoro affinché questo processo abbia successo, è necessario calibrare la colonna Prima di iniziare.
Per questo, aggiungi tre ml di soluzione di lavoro e questo scorrerà nella provetta da 50 ml etichettata come scarto. Quindi aggiungere otto ml di coltura per ustioni FCI al plasmodio alla colonna. Osservando che non appena l'ultima parte della soluzione di lavoro è stata espulsa dalla colonna dalla coltura, la provetta viene sostituita con l'altra provetta da 50 ml sottostante.
Per iniziare a raccogliere la Cultura. Una volta cessato il flusso di coltura attraverso la colonna, aggiungere un ml della soluzione di lavoro alla colonna per spingere i globuli rossi rimanenti non attaccati. A partire dal successivo, aggiungere tre ml della soluzione di lavoro alla colonna e passare alla provetta di scarto in modo da non alterare le proporzioni della coltura.
Una volta che i tre ml sono passati attraverso la colonna, staccarla dal supporto e posizionare un tubo da 15 ml. Quindi, aggiungi tre ml della soluzione di lavoro. Questo eluirà i chizen che sono stati intrappolati nelle perline della colonna.
A seconda dell'esperimento che viene eseguito, siamo in grado di raccogliere tutti i parassiti di cui abbiamo bisogno. Se la nostra cultura ha un'alta semia, possiamo ottenere la quantità di canto necessaria nella prima raccolta. In caso contrario, poiché la capacità di legare la colonna è probabilmente inferiore al nostro contenuto di shant, possiamo passare la nostra coltura attraverso la colonna più volte e raccogliere più parassiti.
Fatto ciò, centrifughiamo la provetta da 15 ml per cinque minuti a 150 forze centrifughe. Dopo la centrifugazione, potremmo vedere il pellet formarsi sul fondo del tubo. Quindi rimuoviamo la soluzione di lavoro del natante SUP, lasciandone abbastanza per rendere possibile determinare la nostra resa attraverso la microscopia.
Possiamo quindi decidere se ripetere o interrompere la raccolta a quel punto, e in caso affermativo, raccogliere altro chizen nello stesso tubo da 15 ml. Questa procedura può essere applicata per saggi di invasione, sincronizzazione dei parassiti e saggi di crescita.
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Panoramica
Questo studio analizza le proprietà paramagnetiche dell'emozoina per isolare globuli rossi infettati da Plasmodium falciparum in fase tardiva. Il metodo è efficiente e preserva le capacità invasive dei parassiti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Parassitologia
- Biologia cellulare
- Malattie infettive
Sfondo
- Plasmodium falciparum è un parassita umano che risiede nei globuli rossi.
- Il parassita utilizza molecole degli eritrociti per nutrirsi.
- Il ferro dell'emoglobina è tossico per il parassita, portando alla formazione dell'emozoina.
- La proprietà paramagnetica dell'emozoina facilita la separazione delle cellule infette.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per isolare i globuli rossi infetti.
- Potenziare lo studio di caratteristiche specifiche del parassita.
- Minimizzare fattori di confusione provenienti da eritrociti non infetti.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo delle proprietà paramagnetiche dell'emozoina.
- Separazione magnetica delle cellule rosse infette da quelle non infette.
- Tecniche di coltura per la crescita di Plasmodium falciparum.
- Valutazione dell'impatto del metodo sull'invasività del parassita.
Risultati principali
- Il metodo concentra efficacemente gli eritrociti infetti.
- Ha permesso di ottenere una purezza quasi del 100% delle cellule infette.
- Ha preservato le capacità invasive dei parassiti.
- Ha facilitato ulteriori studi sulle caratteristiche del parassita.
Conclusioni
- La proprietà paramagnetica dell'emozoina è uno strumento utile per isolare le cellule infette.
- Questo metodo è semplice, rapido ed efficiente.
- Apre nuove possibilità per ricerche più mirate su Plasmodium falciparum.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di eritrociti infettati da Plasmodium falciparum in fase avanzata permette uno studio mirato della biologia del parassita, eliminando le cellule non infette che potrebbero interferire. Questo metodo di separazione magnetica sfrutta la proprietà paramagnetica intrinseca dell'emozoina, evitando l'uso di marcatori o modificazioni genetiche. Supporta la validazione di bersagli e lo sviluppo di saggi nella scoperta di farmaci antimalarici, fornendo popolazioni di parassiti purificati per schermate meccanicistiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di caratteristiche del parassita specifiche dello stadio, arricchendo gli eritrociti infettati negli stadi tardivi.
- Valore operativo: Fornisce un metodo privo di marcatura per isolare cellule infette in base al prodotto endogeno della detossificazione dell'eme.
- Valore terapeutico: Supporta la riduzione del rischio sui bersagli, permettendo la valutazione degli effetti dei composti su popolazioni di parassiti sincronizzati.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce campioni di parassiti altamente arricchiti, adatti per lo screening fenotipico di inibitori dell'invasione o dell'egresso.
- Valore operativo: Utilizza colonne magnetiche per raggiungere una parasitemia prossima al cento per cento, riducendo il rumore di fondo del saggio.
- Prontezza per il saggio: Mantiene la vitalità e l'invasività dei parassiti dopo la separazione, consentendo letture funzionali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici isolando i parassiti per lo studio dei percorsi di degradazione dell'emoglobina.
- Valore operativo: Permette cicli ripetuti di separazione per ottenere una quantità sufficiente di materiale per saggi biochimici successivi.
- Continuità traslazionale: Fornisce un metodo riproducibile per preparare materiale parassitario da utilizzare nella validazione degli obiettivi durante campagne di test di composti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, in cui sono necessarie popolazioni di parassiti purificati per valutare l'interazione con il bersaglio e il meccanismo d'azione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi eliminando l'interferenza degli eritrociti non infetti nei saggi specifici per stadio.
- Screening: Permette la preparazione standardizzata di popolazioni di eritrociti infetti per campagne di screening di composti.
- Analisi: Fornisce un arricchimento quantitativo del parassita misurabile mediante microscopia o citometria a flusso dopo la separazione.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica fornendo materiale parassitario costante per studi sulla modulazione del bersaglio.
- Riutilizzo aziendale: Le colonne magnetiche possono essere riutilizzate previa calibrazione, sostenendo applicazioni scalabili in diversi progetti di scoperta.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo il rumore biologico derivante da cellule non infette.
- Valore operativo: Offre una procedura semplice, rapida e innocua che richiede soltanto colonne magnetiche e reagenti standard per la coltura.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione sperimentale consentendo letture fenotipiche più pulite nei test di screening antimalarici.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione dei bersagli aggiustata per il rischio grazie a una preparazione affidabile dei parassiti specifica per stadio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella gestione della coltura parassitaria e nell'allestimento della separazione magnetica.
- Necessita di colonne LS, supporti magnetici e mezzi di coltura comprensivi di RPMI e bicarbonato di sodio.
- Richiede la standardizzazione delle portate e dei volumi per garantire un recupero costante dei parassiti tra diverse prove.
- Deve tenere conto della variabilità della parasitemia e del contenuto di emoziina, che influiscono sulla capacità di legame magnetico.
- Limitato ai parassiti in stadio avanzato a causa dell'accumulo di emoziina dipendente dallo stadio.
