Name: In vivo imaging dellangiogenesi tumorale mediante fluorescenza confocale Videomicroscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: Impara a quantificare la microcircolazione tumorale in vivo mediante videomicroscopia a fluorescenza confocale. Questo metodo misura la densità capillare funzionale e l'indice di permeabilità per valutare la vascolarità e la risposta alle terapie mirate.

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1. Preparazione del mezzo di contrasto <ol><li> Per FITC-destrano 70 kDa, la dose iniettata è di 500 mg / kg (10 mg di FITC-destrano diluito in 0,1 ml di soluzione fisiologica per un mouse pesatura 20 g). </li><li> L&#39;agente non deve essere esposto a luce troppo lungo. Per evitare sbianca, si raccomanda di coprire il tubo con un foglio di alluminio. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> I topi sono stati anestetizzati con una iniezione intraperitoneale di una miscela 1:4 di xilazina (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Francia) e ketamina (ketamina 500, Virbac, Carros, Francia), rispettivamente 66 mg / kg e 264 mg / kg per un 20 g mouse. </li></ol> 3. Preparazione del Organo d&#39;interesse <ol><li> Abbiamo rasato i topi nella posizione di interesse (ad esempio, nel corso di un tumore sottocutaneo). Peli di animali è spesso auto-fluorescente quando bianco. Quando nero, assorbe la luce. </li><li> La pelle rivolta verso l&#39;organo ad essere ripreso è stato inciso. E &#39;importante attendere l&#39;bleeding è fermato prima di iniettare il mezzo di contrasto, altrimenti colerà nel sangue e contaminare l&#39;immagine. </li></ol> 4. Acquisizione <ol><li> L&#39;agente di contrasto è stato iniettato attraverso sia la vena giugulare o la vena caudale. Nessuna o poca segnale di fondo c&#39;è nell&#39;organo osservata in assenza di un agente di contrasto fluorescente. </li><li> La sonda è stata posta di fronte dell&#39;organo da acquisire. Nel nostro studio, questo era il tumore. </li><li> Il laser è stato acceso per illuminare il tumore e vedere la fluorescenza nei capillari. </li><li> Il tumore è stato esplorato manualmente spostando la sonda in un movimento molto lento durante la registrazione di visualizzare la rete capillare. È importante mantenere una mano ferma, e questa tecnica richiede un minimo di esperienza. Nel nostro studio, questo primo passo consentita la quantificazione della densità capillare funzionale. </li><li> Il secondo passo è stato l&#39;acquisizione dinamica nel tempo. Per questo studio, abbiamo utilizzato 70 kDa FITC-destrano. Non vi siano perdite interstiziale in maggior parte degli organi normali ma c&#39;è nei tumori. Per acquisire immagini della stessa posizione nel tempo (come nel nostro caso), è importante creare un sistema per mantenere la sonda sulla zona di interesse. Ciò è stato fatto utilizzando un supporto a mano per tenere la sonda, e ponendo un po &#39;di gel ultrasuoni sulla punta della sonda. Prima della registrazione, il tempo è stato speso per stabilizzare la sonda posta a contatto con il tumore. Una volta che la posizione è stata assicurata, c&#39;era solo il movimento minimo dovuto alla respirazione del mouse. Il laser è acceso per registrare 3 immagini ogni 30 sec per 20 min per rilevare la presenza di perdite capillare. Si è spento tra ogni registrazione per ridurre il contrasto agente sbiancante. </li><li> Nel nostro esperimento, i topi sono stati sacrificati al termine della procedura di analisi istologica dei tumori. </li></ol>

<ol><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+concepts+of+the+angiogenic+process%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Fundamental concepts of the angiogenic process.</a> Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).</li>
<li>Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibered+confocal+fluorescence+microscopy+%28Cell-viZio%29+facilitates+extended+imaging+in+the+field+of+microcirculation.+A+comparison+with+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Res%22%5BJournal%5D)">Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy.</a> J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).</li>
<li>Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).</li>
<li>Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+contrast+enhanced+optical+imaging+of+capillary+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage.</a> Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).</li>
<li>Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+nitric+oxide+production.+Mechanisms+of+vascular+albumin+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage.</a> Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).</li>
<li>Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+capillary+leakage+is+involved+in+the+onset+of+anaphylactic+hypotension%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension.</a> Anesthesiology. , (2012).</li>
<li>Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).</li>
<li>Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+tumour+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Disrupting tumour blood vessels.</a> Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).</li>
<li>Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+antitumor+treatment+by+means+of+fluorescence+molecular+tomography+with+an+annexin+V-Cy5.5+conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).</li>
<li>Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+optical+contrast+agent+dynamics+in+rat+tumors+by+use+of+diffuse+optical+spectroscopy+with+magnetic+resonance+imaging+coregistration%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration.</a> Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Lo studio del microcircolo tumore è diventato essenziale nella comprensione della fisiopatologia della crescita del tumore, la diffusione e la risposta alla terapia 1. Imaging ottico è una delle tecniche che possono essere utilizzate per osservare i capillari utilizzando un agente di contrasto fluorescente e quantificare morfologica (densità capillare funzionale) e parametri funzionali (indice di dispersione). La microscopia a fluorescenza che abbiamo usato in questo studio presen...

L&#39;angiogenesi è un processo complesso 1 che comporta la formazione di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti. Alterazioni patologiche microcircolazione del tessuto, composto da arteriole, capillari e venule, sono implicati in una vasta gamma di malattie come il cancro, infiammazione, o diabete. E &#39;quindi essenziale per sviluppare metodi per valutare quantitativamente la struttura e la funzione microvascolare. Imaging consente lo studio di microvasi in un non-o micro-invasiva modo, in tempo reale e in vivo, e misure ripetute nel tempo nello stesso animale 2. Attualmente, dinamico con mdc (DCE) di imaging 3 è comunemente utilizzato per valutare la microcircolazione dei tessuti. L&#39;imaging mdc dinamico è una tecnica che segue nel tempo la biodistribuzione di un tracciante iniettato per via endovenosa. Da questa acquisizione, parametri quantitativi possono essere estratti riflettente vascolarizzazione dei tessuti. Immagini DCEè stato più spesso utilizzato con la TAC, risonanza magnetica o ecografia. Tuttavia, queste tecniche di imaging non consentono la visualizzazione diretta dei microvasi, poiché la loro risoluzione, se non con l&#39;uso di specifici dispositivi sperimentali, spesso rimane macroscopico. In questo lavoro, ci proponiamo di studiare il sistema vascolare del tumore alla scala microscopica e in vivo utilizzando imaging ottico dinamico contrast-enhanced, con fibrata videomicroscopia confocale. Abbiamo utilizzato un agente di contrasto macromolecolare (FITC-destrano) che rimane esclusivamente all&#39;interno navi o perdite attraverso la barriera endoteliale nell&#39;interstizio, in base al suo peso molecolare e le caratteristiche dell&#39;endotelio del tessuto studiato 4. Questo ha permesso lo studio di entrambi struttura microvasi, delineando correttamente navi, e la permeabilità capillare, da perdite e accumulando nell&#39;interstizio.

<table><tbody><tr><td>Insulina serynge Myjector 1ml 29G</td><td>Terumo Europe</td><td>BS-05M2913</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceina isotiocianato-destrano 70 kDa </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01619HH</td><td>100 mg/mL diluito in soluzione salina</td></tr><tr><td>Videomicroscopia confocale in fibra</td><td>Cellvizio - MaunaKea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di calibrazione e pulizia per LEICAFCM1000</td><td>Leica Microsystems</td><td>LSU-488</td><td>Negozio a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Probe ProFlexTM Z</td><td>MaunaKea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di mosaicatura</td><td>MaunaKea Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di rilevamento vasi</td><td>MaunaKea Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging dell&#39;angiogenesi tumorale mediante fluorescenza confocale videomicroscopy

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocale a fluorescenza imaging in vivo con un fascio di fibre ottiche utilizza lo stesso principio microscopia confocale a fluorescenza. Si può eccitare fluorescente in situ elementi attraverso le fibre ottiche, e quindi registrare alcuni dei fotoni emessi, tramite le stesse fibre ottiche. La sorgente luminosa è un laser che invia la luce eccitante attraverso un elemento all&#39;interno del fascio di fibre e durante la scansione sul campione, ricrea l&#39;immagine pixel per pixel. Poiché questa scansione è molto veloce, combinandolo con un software di elaborazione delle immagini dedicato, le immagini in tempo reale con una frequenza di 12 fotogrammi / sec possono essere ottenuti. Abbiamo sviluppato una tecnica per caratterizzare quantitativamente la morfologia e la funzione capillare, utilizzando un dispositivo di fluorescenza videomicroscopia confocale. Il primo passo nel nostro esperimento era di registrare film 5 sec nei quattro quadranti del tumore per visualizzare la rete capillare. Tutti i film sono stati elaborati utilizzando il software (ImageCell, Mauna Kea Tecnologia, Parigi, Francia) che esegue una segmentazione automatica delle navi intorno ad un diametro scelto (10 micron nel nostro caso). Quindi, potremmo quantificare la &#39;densità capillare funzionale&#39;, che è il rapporto tra l&#39;area totale del vaso e la superficie totale dell&#39;immagine. Questo parametro è stato un marker surrogato per la densità microvascolare, di solito misurata utilizzando strumenti di patologia. Il secondo passo è stato quello di registrare filmati del tumore oltre 20 min per quantificare fuoriuscita del mezzo di contrasto macromolecolare attraverso la parete capillare nell&#39;interstizio. Misurando il rapporto di intensità di segnale nell&#39;interstizio oltre che nei vasi, un &#39;indice di dispersione&#39; stato ottenuto, agendo come marker surrogato permeabilità capillare.

Utilizzando i dati raccolti, potremmo analizzare quantitativamente diversi parametri che riflettono la microcircolazione. Abbiamo studiato in vivo la rete vascolare periferico di un tumore al colon impiantato nei topi BALB-c utilizzando un sistema di fluorescenza confocale videomicroscopia fibered (Cellvizio, Maunakea Tecnologia, Paris, France 2), dopo l&#39;iniezione di un mezzo di contrasto fluorescente macromolecolare fluoresceina isotiocianato-destrano ( FITC-destrano...

In questo articolo, vi presentiamo un metodo per analizzare microvasi tumorali in vivo utilizzando dinamico con mdc fluorescenza videomicroscopia. Due parametri quantitativi sono stati acquisiti: densità capillare funzionale che riflette la vascolarizzazione del tumore, e perdite indice che riflette la permeabilità della parete endoteliale.

In vivo imaging dell&#39;angiogenesi tumorale mediante fluorescenza confocale Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare la microcircolazione in un modello di tumore del colon murino mediante un sistema di microscopia confocale a fluorescenza in tempo reale. Questo viene ottenuto innanzitutto tramite l'iniezione endovenosa di un agente di contrasto e la registrazione di filmati dei microvasi tumorali. Successivamente, vengono acquisite immagini di quattro quadranti del tumore, consentendo la quantificazione della densità funzionale dei capillari.Successivamente, si osserva il passaggio dell'agente di contrasto dai vasi all'interstizio al fine di quantificare la perdita dell'indice capillare, che riflette la permeabilità della parete endoteliale. Infine, è possibile quantificare le caratteristiche morfologiche e funzionali dei vasi tumorali per rilevare differenze tra modelli tumorali o dopo una terapia mirata. Questa tecnica dinamica di imaging ottico con mezzo di contrasto consente l'analisi della microcircolazione tumorale.Riflette l'architettura e la funzione dei vasi tumorali quantificando la densità e la permeabilità dei capillari. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla fisiologia tumorale, può essere applicato anche ad altri sistemi come lo shock anafilattico, l'infiammazione, le malattie cardiovascolari e il diabete. Iniziare con la rasatura del topo anestetizzato nella sede di interesse.Quindi praticare un'incisione nella pelle, rivolta verso l'organo da immagine, quando l'emorragia si è arrestata. Iniettare l'agente di contrasto per quantificare la densità funzionale dei capillari. Posizionare innanzitutto la sonda davanti all'organo da immagine.Successivamente, accendere il laser che illumina l'organo. Quindi, mantenendo una mano ferma, spostare lentamente la sonda registrando mentre viene visualizzata la rete capillare fluorescente.Per stabilizzare l'acquisizione dinamica nel tempo, applicare una piccola quantità di gel ecografico sulla punta della sonda, quindi posizionare la sonda su un supporto manuale. Dopo aver posto la sonda a contatto con l'organo di interesse, stabilizzarla. Una volta che la posizione è sicura, impostare il laser per registrare tre immagini ogni 30 secondi per 20 minuti al fine di rilevare la presenza di fuoriuscita capillare.Spegnere il laser tra ogni registrazione per ridurre il fotobiancamento dell'agente di contrasto dopo aver acquisito filmati di cinque secondi in ciascuno dei quattro quadranti dell'organo di interesse, al fine di visualizzare il processo della rete capillare. Analizzare i filmati, mediante un software appropriato, eseguendo una segmentazione automatica dei vasi nelle immagini intorno a un diametro scelto per quantificare la densità funzionale dei capillari, ovvero il rapporto tra l'area totale dei vasi e l'area totale dell'immagine. Successivamente, dall'acquisizione dinamica effettuata per rilevare la presenza di fuoriuscita capillare, tracciare tre regioni di interesse nei capillari e tre regioni di interesse nell'interstizio ai tempi 0, 5, 10 e 20 minuti. Infine, mediare le intensità del segnale all'interno dei tre diversi capillari e delle aree interstiziali adiacenti e calcolare la percentuale di indice di fuoriuscita.Secondo questa formula, in cui IP è l'intensità perivascolare o interstiziale e II è l'intensità intravascolare, il parametro di densità funzionale dei capillari rappresenta un marcatore surrogato della densità microvascolare, generalmente misurata mediante strumenti istopatologici. Qui di seguito sono mostrati un esempio dei tipi di immagini ottenute e il risultato della segmentazione dei vasi. In questo esempio, la densità funzionale dei capillari è stata misurata al 36%. In queste immagini, viene mostrato un esempio di fuoriuscita di mezzo di contrasto nell'interstizio con un indice di fuoriuscita di 1,47 ai tempi 0, 5, 10 e 20 minuti dopo l'iniezione.In ciascuna delle immagini, i vasi appaiono come strutture lineari ad alto segnale immediatamente dopo l'iniezione. Nessun segnale è visibile nell'interstizio. Nel tempo, tuttavia, si può osservare il mezzo di contrasto che fuoriesce nell'interstizio attraverso il tumore anomalo.L'esperienza con la barriera endoteliale è necessaria per padroneggiare questa procedura. Tuttavia, una volta acquisita padronanza, la tecnica può essere completata in 30 minuti se eseguita correttamente.

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