Name: Ad alta velocità, lestrazione automatizzata di DNA e RNA da campioni clinici utilizzando la tecnologia TruTip su Robot Gestione liquidi comuni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Scopri l'estrazione automatizzata di DNA genomico da sangue intero utilizzando la tecnologia TruTip su Hamilton Star. Questo metodo elimina centrifughe e barre magnetiche, garantendo purezza elevata e throughput elevato per applicazioni cliniche.

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Parti di questo lavoro sono stati sostenuti dal National Institutes of Health (NIH) in concessione R 44 AI072784. Ringraziamo il Dr. Kirsten San Giorgio, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson e Amy Dean del Laboratorio di virologia, Wadsworth Center, New York State Dipartimento di Sanità per virioni influenzali quantificati e l&#39;accesso ai clinicamente validato influenza in tempo reale PCR.

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Gli autori sono dipendenti di Akonni Biosystems, Inc. che producono materiali utilizzati in questo articolo. Accesso libero e produzione di questo articolo è sponsorizzato da Akonni Biosystems, Inc.

La semplicità del concetto TruTip e workflow (Figura 1) lo rendono facilmente adattabile, automatizzato, efficiente ed efficace per una serie di matrici di campioni clinici, volumi di campionamento in ingresso, e sistemi di manipolazione dei liquidi. Va riconosciuto, tuttavia, che ogni campione clinico è unico, e varierà uno all&#39;altro in viscosità, particolati, muco, contaminanti, microbici, e / o sfondi genetiche umane. Dato variazioni previste nella composizione del campione clinico e usi previsti per un protocollo di preparazione del campione TruTip automatizzato, può quindi essere necessario modificare alcuni passaggi in una procedura TruTip al fine di ottenere i risultati desiderati per un tipo specifico campione. Indipendentemente dal tipo di campione, tuttavia, TruTip parametri che in genere hanno l&#39;impatto più significativo sulla purezza dell&#39;acido nucleico e / o recupero comprendono: <ol><li> Campione miscelazione ed omogeneizzazione con tampone di lisi (e alcool). Mentre TruTips hanno una rilatively grande dimensione dei pori, omogeneizzazione del campione e liquefazione è molto importante per la lisi cellulare efficiente, e le successive fasi di legame alla TruTip monolito. Con un lisato omogeneo e ben liquefatto, i campioni possono muoversi attraverso il TruTip con portate maggiori, il che riduce il tempo di elaborazione del campione complessivo. Il grande volume di plasma protocollo dimostra il potenziale per gli utenti di omogeneizzare accuratamente e liquefare campioni difficili (on-line o off-line), nonostante il volume del campione di ingresso di grandi dimensioni. </li><li> Portate. Portate più lenti durante legame dell&#39;acido nucleico o l&#39;eluizione tipicamente producono una maggiore resa di acido nucleico, sia pure a scapito del tempo di elaborazione totale. Portate più lenti possono anche ridurre l&#39;entità del taglio del DNA. </li><li> Numero di cicli. Il numero ottimale di aspirazione e dispensazione dei cicli dipende dal tipo di campione, il volume totale del campione e le portate. Fase 1 nella figura 1 è tipicamente il punto in cui il ciclo numbers (e portata) può richiedere alcuni ottimizzazione empirica, con campioni come nasofaringeo (Figura 5) rappresenta uno dei lisati più impegnative per ottimizzare dovuto la gamma di NPA viscosità da pazienti diversi. </li><li> Asciugatura. Completa asciugatura della TruTip monolite è indispensabile per evitare che residui di solventi organici da co-eluizione con il campione di acido nucleico purificato e processi a valle inibendo o prove. Perché TruTip non viene essiccato tramite centrifugazione o filtrazione sotto vuoto, è importante massimizzare sia la portata e numeri del ciclo durante la fase di essiccazione. A volte c&#39;è una goccia residuo di soluzione di lavaggio sul capolinea del TruTip dopo i cicli di essiccazione sono stati completati. La Hamilton robot ha la capacità di effettuare un &quot;tocco punta&quot; sul lato del pozzo per rilasciare la gocciolina, assicurando così una eluizione solventi. Il sistema epMotion non ha questa funzione, ma un pre-risciacquo del capolinea TruTip a elution tampone può essere programmato per ottenere lo stesso effetto. </li></ol> Perchè la geometria, materiale pipetta punta, e il metodo di fissaggio ai bracci robotici canale sono unici per ogni marca di strumenti, è richiesto un diverso costrutto TruTip per ogni sistema di gestione dei liquidi. Le dimensioni monolite TruTip (diametro, spessore e dimensione dei pori) sono correlate con l&#39;acido nucleico capacità di legame (e l&#39;efficienza di eluizione), come previsto per qualsiasi tecnica di estrazione in fase solida. Mentre spessi (&gt; 4 mm), matrici possono essere incorporati in un TruTip 1 ml di acido nucleico per aumentare capacità di legame per campioni di grande volume e / o equalizzare la capacità di legame di tutti i formati TruTip specifici, vi è un compromesso tra lo spessore TruTip e portate durante la fase di legame iniziale (in presenza di lisati greggio). Così, a volte è vantaggioso incorporare monoliti di diametro maggiore in grandi volumi puntali per le fasi iniziali di un protocollo automatizzato, (ad es &lt;/ Em&gt; i 5 ml Hamilton / Akonni TruTips per estrazioni di grande volume). Date le configurazioni TruTip specifiche dettate dai costruttori di robot di manipolazione dei liquidi, tuttavia, non necessariamente aspettiamo TruTip rendimenti di acidi nucleici per essere identici per tutte le piattaforme di gestione dei liquidi di diversi produttori, o attraverso diverse dimensioni TruTip. Campioni clinici (per definizione) conterranno quantità significative di DNA genomico umano a meno che non sono acquisite da siti normalmente sterili (ad esempio liquido cerebro-spinale). A volte il DNA genomico umano è desiderato (come in figura 6), mentre in altre applicazioni del DNA umano rappresenta un fondo genomico indesiderato (come per la Figura 5). La presenza di DNA di sfondo non è solitamente problematico finché la quantità totale di acido nucleico nel campione non supera la capacità di legame del monolito, e il DNA sfondo può servire come un trasportatore, se il nucleico target desideratoacido è presente in tracce. L&#39;obiettivo del protocollo di estrazione del plasma ad alta disponibilità (Figura 7) è isolare (frammentato) DNA fetale in presenza di un eccesso di piega 10-20 DNA materno, che è simile all&#39;obiettivo preparazione del campione di test di malattie infettive tranne che le sequenze sono altamente congruenti e possono essere distinti da collaudo molecolare altamente specifico e / o di discriminazione dimensione. In questo caso, il DNA totale circolante viene isolato utilizzando un 5 ml TruTip, e successiva DNA fetale peso molecolare elevato e basso peso molecolare vengono separati mediante eluizione e successivo legame ad un 1 ml TruTip alterando le condizioni del tampone di legame. Separazione dimensionale selettivo e arricchimento di acidi nucleici bersaglio in base alle loro proprietà di legame e di eluizione di un monolito di silice è una modalità di azione significativamente diverso rispetto raggiunto da membrane o esclusione dimensionale colonne di rotazione. Separazione dimensione e l&#39;arricchimento del DNA microbico da DNA genomico umano può essere unccomplished in future applicazioni tramite la personalizzazione TruTip vincolante e tamponi di eluizione. I protocolli automatizzati dimostrato qui sottolineare l&#39;utilità del TruTip monolite stesso per l&#39;elaborazione di diversi campioni clinici, e come può essere adattato per grandi volumi e specifiche robot di manipolazione dei liquidi. I metodi semplificati di solito sfociano in protocolli di estrazione più veloce rispetto ad altri sistemi automatizzati. La semplicità della tecnologia TruTip, tuttavia, offre anche alcuni vantaggi di costo per coloro che sono interessati all&#39;acquisto di un nuovo sistema automatizzato di purificazione acido nucleico, perché l&#39;hardware primaria necessaria per l&#39;automazione delle procedure TruTip è il braccio pipetta canale stesso, piuttosto che barrette magnetiche, sistemi per il vuoto , oppure a bordo centrifughe. Utilizzando le piastre dei reagenti preriempite può anche ridurre lo spazio e materiali di consumo necessari, e raddoppiare la velocità per corsa. Riducendo al minimo spazio della piattaforma con i protocolli TruTip consente inoltre agli utenti avanzati di integrare a monte o dprocessi automatizzati ownstream con il TruTip. Per esempio soluzione easyBlood di Hamilton al sangue intero frazionare può essere incorporato con il metodo di estrazione TruTip automatizzato, che sarebbe snellire significativamente i processi bio-banking. Processi di post-estrattivi, come la quantificazione degli acidi nucleici, la normalizzazione, PCR set-up, o sequenziamento del DNA sono anche facilmente integrati con TruTip sulle grandi piattaforme di gestione dei liquidi.

Nucleico purificazione acido è necessario per la diagnostica molecolare più, uso di ricerca, e le applicazioni delle scienze della vita. Vari approcci sono emerse dopo il tempo di fenolo / cloroformio, molte delle quali sono basate sul principio fondamentale di legame alla silice in presenza di sali di acido nucleico caotropici 1. Il processo di estrazione è stato semplificato e automatizzato attraverso l&#39;uso di vari formati di perline e membrana a base, con filtri rotativi, perline magnetiche e approcci connessi dominano il settore delle scienze della vita (vedi esempi in 2-13). Mentre efficace, le particelle e le membrane hanno conosciuto limiti quando si confronta con le matrici clinici difficili. Per esempio, le membrane e colonne bead-based sono compliant, hanno piccole dimensioni dei pori (quindi, elevate pressioni di schiena), e richiedere un certo tipo di sostegno al fine di essere trasformati con un sistema di centrifugazione o di vuoto. Le caratteristiche fisiche di membrane e colonne tallone risultato insignificativa resistenza fluida, che limita il tipo di campioni che possono essere elaborati in modo efficiente senza intasare il consumo, e / o il volume totale (input) di esempio che può essere unidirezionalmente elaborati attraverso il percorso di flusso. Viceversa, particelle magnetiche devono essere distribuiti in tutto il campione mediante agitazione. La necessità di distribuire omogeneamente particelle magnetiche all&#39;interno di una soluzione limita il volume del campione totale di ingresso che può essere elaborato con i materiali di consumo di perline più magnetici. Esempio di attributi clinici (quali viscosità o complessità) può portare ad una concentrazione inefficiente particella magnetica sul lato di un tubo o asta. Inoltre, silice polveri sottili possono staccarsi delle perline durante il processo di estrazione, perdendo la loro magnetizzazione e contaminare il campione finale. La tecnologia TruTip stata sviluppata per superare alcuni di questi vincoli di acido nucleico campione e limiti di lavorazione 14. Incorporando un monolite poroso all&#39;interno di unpunta di pipetta, fluidico contropressione si abbassa, che permette il controllo del flusso di aspirazione (cioè pipetta di aspirazione). Questa caratteristica consente al processo di estrazione e strumentazione necessaria per purificare acidi nucleici da tipi di campioni difficili essere notevolmente semplificato (Figura 1). La geometria e la porosità del monolito è su misura per minimizzare intasamento, mentre lo spessore del monolito fornisce sufficiente acido nucleico capacità di legame per volumi di campione che vanno 1,0-5,0 ml. Flusso bidirezionale durante l&#39;aspirazione del campione e di erogazione consente tempi di residenza prolungati tra il campione e il monolito vincolante per efficiente recupero di acido nucleico e di eluizione, e consente relativamente grandi volumi di campione da lavorare che superi la capacità di volume del puntale stesso. Abbiamo precedentemente riportato lo sviluppo e l&#39;applicazione di una procedura TruTip manuale per la purificazione di RNA di influenza da campioni del rinofaringe utilizzando un singolo o multi-canale Rainin pipetta 15. Efficienze di estrazione equivalenti sono stati ottenuti tra automatizzato QIAcube e metodi TruTip manuali a 10 6 copie del gene influenza A per ml aspirato nasofaringeo. L&#39;obiettivo di questo studio era di dimostrare a medio e alto-rendimento, automatizzati TruTip nucleici procedure di purificazione di acidi per aspirato nasofaringeo (NPA) e altri tipi di campioni clinicamente rilevanti, utilizzando robot di manipolazione dei liquidi che si trovano comunemente nei laboratori clinici di riferimento.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagente/Materiale &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit di estrazione TruTip per Influenza (EPM TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-11120</td><td></td></tr><tr><td>Etilene al 95%</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>Acetone al 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-4L</td><td></td></tr><tr><td>Acqua trattata con DEPC</td><td>Life Technologies</td><td>AM9906</td><td></td></tr><tr><td>Reservoir reagente, 30 ml</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a pozzetti profondi 96/2.000 &amp;mu;l</td><td>USA Scientific</td><td>30502302</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1.000 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>960050100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Attrezzatura&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sistema epMotion 5070</td><td>Eppendorf</td><td>5070 000.000</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di dispensazione TM1000-8</td><td>960001061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porta-reservoir</td><td>960002148</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabella 1. &lt;/strong&gt; Reagenti e attrezzature per l'estrazione automatizzata di RNA da NPA.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagente/Materiale &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit di estrazione TruTip per gDNA da sangue (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>300-20341</td><td></td></tr><tr><td>Etilene al 95%</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC615110040</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>Porta-punte CO-RE 96 filtrate da 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235905</td><td></td></tr><tr><td>Porta-punte CO-RE 96 non filtrate da 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235904</td><td></td></tr><tr><td>Tramoggia reagente da 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a pozzetti profondi da 2 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96 DWP-2 ml</td><td>Thermofisher</td><td>27874</td><td></td></tr><tr><td>Tramoggia reagente</td><td>Fisher</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Attrezzatura&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sistema Hamilton STAR</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173027</td><td></td></tr><tr><td>Canali pipetta indipendenti da 1 ml / Braccio modulare</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173050</td><td></td></tr><tr><td>Testa 96 canali da 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199090</td><td></td></tr><tr><td>Porta-punte</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>Porta-campioni/Inserti</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400/182238</td><td></td></tr><tr><td>Porta-piastre</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Porta-multiflessibile</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>Unità agitatore riscaldante HHS2</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>199033</td><td></td></tr><tr><td>Porta-porta-rack</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabella 2. &lt;/strong&gt; Reagenti e attrezzature per l'estrazione di DNA genomico in 96 pozzetti da sangue intero.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagente/Materiale &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Kit di estrazione TruTip R+D per DNA circolante (Hamilton TruTips)</td><td><a href="http://www.akonni.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Akonni Biosystems, Inc.</a></td><td>Richiedi informazioni</td><td></td></tr><tr><td>Etilene al 100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459828-1L</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Acros Organics/ThermoFisher Scientific</td><td>AC327270010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>AMRESCO LLC</td><td>E195</td><td></td></tr><tr><td>Punte filtrate da 4 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184022</td><td></td></tr><tr><td>Punte non filtrate da 1 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>235939</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a pozzetti profondi 96</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2800</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici da 50 ml</td><td>Corning/ThermoFisher Scientific</td><td>05-526B</td><td></td></tr><tr><td>Tramogge reagente da 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>187297</td><td></td></tr><tr><td>Tramogge reagente da 120 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182703</td><td></td></tr><tr><td>Tramogge reagente a grande volume con 96 posizioni</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-222-412</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Attrezzatura&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Base / Modulo ponte workstation STARplus Autoload</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173025/190012</td><td></td></tr><tr><td>Canali pipetta indipendenti da 1 ml / Braccio</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173081/173052</td><td></td></tr><tr><td>Canale indipendente da 5 ml / Braccio modulare</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>184090/173050</td><td></td></tr><tr><td>Porta-piastre</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182090</td><td></td></tr><tr><td>Porta-multiflessibile</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188039</td><td></td></tr><tr><td>Porta-porta-tramogge reagente da 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>188047</td><td></td></tr><tr><td>Porta-tramoggia reagente da 120 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>185290</td><td></td></tr><tr><td>Porta-punte</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182085</td><td></td></tr><tr><td>Porta-tubi da 50 ml</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>182245</td><td></td></tr><tr><td>Porta-campioni con 24 posizioni</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173400</td><td></td></tr><tr><td>Porta-campioni con 32 posizioni</td><td>Hamilton Robotics, Inc.</td><td>173410</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabella 3. &lt;/strong&gt; Reagenti e attrezzature per l'estrazione di DNA da plasma a grande volume.</td></tr></tbody></table>

ad alta velocità, l&#39;estrazione automatizzata di dna e rna da campioni clinici utilizzando la tecnologia trutip su robot gestione liquidi comuni

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip è una tecnologia semplice estrazione degli acidi nucleici in cui una porosa, monolitica matrice legante viene inserito in una punta di pipetta. La geometria del monolite può essere adattato per specifici puntali variano nel volume di 1,0-5,0 ml. La grande porosità del monolite consente campioni viscosi o complessi di passare facilmente attraverso di esso con la minima contropressione fluidico. Flusso bidirezionale massimizza il tempo di permanenza tra il monolito e il campione, e consente grandi volumi di campione da elaborare all&#39;interno di un singolo TruTip. I passi fondamentali, indipendentemente dal volume di campione o geometria TruTip, includono la lisi cellulare, vincolante per i pori interni della TruTip monolite acido nucleico, lavando via i componenti del campione non legato e buffer di lisi e eluizione di acidi nucleici purificati e concentrati in un tampone appropriato. Gli attributi e le capacità di adattamento di TruTip sono dimostrate in tre protocolli di trattamento del campione clinici automatici utilizzando un epMotion Eppendorf 5070, STARPLUS robot di manipolazione dei liquidi, inclusi l&#39;isolamento dell&#39;RNA da aspirato nasofaringeo, estrazione di DNA genomico da sangue intero, e l&#39;estrazione del DNA fetale e arricchimento da grandi volumi di plasma materno (rispettivamente) e Hamilton STAR.

Dati real-time PCR per l&#39;influenza RNA da NPA sono mostrati in Figura 5A. Acido nucleico efficienza di estrazione stimato è simile ai risultati ottenuti con la versione manuale del protocollo 15. Una risposta lineare in media valori di C t è osservata tra 10 4 e 10 6 copie del gene ml -1 modificato influenza (R 2 = rispettivamente 0,99 e 0,98 per l&#39;influenza A e B,), con deviazioni standard in media C t valori inferiori a 1 ciclo. L&#39;assenza di contaminazione incrociata con il sistema epMotion è dimostrato in Figura 5B, dove 12 campioni NPA positivi contenenti 10 6 copie del gene ml -1 NPA sono stati intervallati con 12 spazi tampone. Il C t media per i controlli positivi era 30,16 ± 0,14, e tutti gli spazi del buffer sono stati negativi. Il tempo di elaborazione totale del campione è 16, 28 e 40 min per 8, 16 e 24 campioni, rispettivamente.Poiché un tipico nasofaringeo clinico o tampone conterrà 10 7 gene copie ml -1 (supponendo 1.000 virioni per TCID 50 16 e&gt; 10 4 TCID 50 ml -1 influenzale 17), il protocollo epMotion automatizzata dovrebbe essere efficace su una maggioranza di esemplari NPA clinici. Data la gamma dei test molecolari condotti su DNA genomico umano, l&#39;obiettivo primario di estrazione degli acidi nucleici da sangue intero è produrre senza contaminanti, ad alto peso molecolare del DNA genomico. Il protocollo automatizzato per 96 campioni è completata entro 1 ora, che è un miglioramento rispetto altri sistemi automatizzati (ad es Promega MagneSil = 90 min e Qiagen QIAamp DNA Sangue BioRobot sistema MDx = 2,5 hr). Figura 6A mostra i profili di assorbanza UV / Vis per 45 campioni di sangue positivi trattati contemporaneamente con 45 reagenti bianchi sul protocollo Hamilton STAR, con una media A <sub&gt; 260/280 rapporto di 1,96 e media A 260/230 rapporto di 1,93. Un A 260/280 rapporto tra 1,7-2,0 e A 260/230 rapporto&gt; 1,7 sono in genere indicativo di DNA molto pura, priva di sali residui, proteine ​​o solventi, e accettabile per le applicazioni molecolari più a valle. Il gel di agarosio 1% in Figura 6B mostra che il gDNA risultante è di alto peso molecolare (&gt; 24 kb), con minima tranciatura. La resa media di acido nucleico, dal set di 45 campioni positivi è 5,26 ± 0,46 mg di DNA umano per 200 ml di sangue intero, sulla base della Life Technologies Quantifiler umana quantificazione Kit DNA. Studi cross-contaminazione simili a quelli mostrati nella Figura 5B sono state effettuate con sbozzati tampone controllo negativo intervallati da campioni positivi ed estratta in parallelo; tutti gli spazi erano nuovamente negativi mediante PCR (non mostrato). Il gDNA purificato è inoltre adatto per numerose altre analisi basate sulla PCR (non mostrato). Risultati in tempo reale da otto campioni replicati di un campione di plasma materno pooled processato con la procedura TruTip grande volume sono mostrati in Figura 7. Il protocollo completo (compreso off-line proteinasi K incubazione) è finito in circa 2,5 ore, simile al manuale Qiagen circolazione nucleici Kit Acids (senza kit di estrazione automatizzati comparabili sono ancora disponibili). I valori medi C t oltre tutte le repliche sono 34,58 ± 0,66 e 29,76 ± 0,50 per il maschio fetale (CHY) e DNA totale (CH1), rispettivamente, che dimostra eccellente ripetibilità del metodo di estrazione automatica. La concentrazione di DNA fetale all&#39;interno della piscina DNA totale (in equivalenti genoma), viene calcolata sulla base del confronto analisi punto di adattamento agli standard, con la conseguente% DNA fetale media per tutti i campioni di 2,8%. Il DNA fetale effettivo% per questo campione è sconosciuto poiché i campioni sono stati aggregati prima di eseguire l&#39;estrazione. Composizione del DNA fetalecampioni di plasma in non aggregati estratti utilizzando il metodo TruTip sono tipicamente 1,5 volte superiore rispetto ai risultati con un kit Qiagen circolazione Acidi Nucleici (non mostrato). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig1.jpg" /> Figura 1. Il processo di estrazione TruTip e flusso di lavoro, indipendentemente dal sistema di gestione dei liquidi. Altra preparazione del campione o fasi di manipolazione di liquidi possono essere incorporati nella routine automatizzate seconda delle capacità dello strumento di gestione dei liquidi e software specifici. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig2.jpg" /> Figura 2. (A) Eppendorf epMotion 5070 campione layout di piastra. (B) Disposizione dei reagenti / ConsumaBles sul piano di lavoro. piatto del campione può essere configurato per un massimo di 24 campioni (colonne 1, 5 e 9, rispettivamente), anche se il epMotion elaborerà solo un massimo di 8 campioni simultaneamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig3.jpg" /> Figura 3. Hamilton STAR disposizione della piattaforma per la purificazione di DNA genomico da sangue intero (non in scala) Deck posizione 1 = Hamilton 1 ml suggerimenti filtrato. 2 = Hamilton 1 ml suggerimenti non filtrati, 3 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 2 millimetri TruTips; 4 = ingresso vettori campione di sangue (provette o tubi microcentrifuga); 5-9 = 290 ml depressioni reagenti per Lysis Buffer F, Etanolo, il tampone di lavaggio J, K e il tampone di lavaggio tampone di eluizione A2, rispettivamente; 10 = 96 dEEP piastra ben Binding; 11 = 96 pozzo profondo Lavare J; 12 = 96 pozzo profondo Lavare K; 13 = 96 Piatto fondo eluizione bene; 14 = Hamilton HHS2 riscaldatore / shaker con Nunc 96 profondo piastra di incubazione bene; 15 = 50 ml di reagente trogolo contenente proteinasi K. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig4.jpg" /> Figura 4. Hamilton STARPLUS disposizione della piattaforma per purificare il DNA da campioni di plasma di grande volume (non in scala). Il sistema è dotato di 8 x 5 canali e 8 ml x 1 ml canali (non mostrato nel layout ponte). Deck Posizione 1 = Hamilton 4 ml punte filtrati; 2 = Akonni / Hamilton 5 ml TruTips; 3 = campioni di plasma di origine; 4 = 50 ml provette coniche; 5 = 120 ml depressioni reagenti contenenti CN-W1, W2 e CN-CN-W4 Reagenti; 6 = depressioni reagente a basso volume contenente proteinasi K, CN-B2, CN-B3, EBA2, EBB e CN-W3 reagenti; 7 = 290 ml attraverso reagente contenente reagente CN-L1; 8 = 290 ml di reagente recipiente contenente CN -B1 reagente; 9 = 96 pozzetti profondi per la Fase 1, 10 = 96 piatti fondi e per la fase 2, 11 = porta campioni per purificato, prodotto finale; 12 = Hamilton 1 ml suggerimenti non filtrate; 13 = Akonni / Hamilton 1 ml LPT 4 TruTips mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig5.jpg" /> Figura 5. (A). PCR in tempo reale i risultati di estrazione TruTip automatizzata del virus dell&#39;influenza aggiunte in aspirato nasofaringeo (NPA). INPUT VOLUME NPA = 100 l, volume di eluizione = 50 ml. Risultati sono la media di 3 replicare extractions da 5 distinti ambiti di NPA (n = 15) per livello di diluizione e di destinazione influenza. qPCR è stata eseguita sul sistema LightCycler 480 con condizioni descritte in precedenza 15. (B) n contaminazione incrociata viene rilevata quando 12 campioni NPA positivi si alternano senza controlli template e sulla base della procedura di estrazione automatica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig6.jpg" /> Figura 6. Risultati di estrazione di DNA genomico umano da sangue intero a.) Tracce UV-visibile da un NanoDrop 1000 (ThermoFisher) di 10 selezionati in modo casuale repliche. B) 1% gel di TruTip purificato gDNA. M = Fisher 24 kb Max DNA Ladder. Lanes 1-4 = ~ 100 ng purificato gDNA da quattro selezionati casualmente repliche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50356/50356fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50356/50356fig7.jpg" /> Figura 7. PCR in tempo reale i risultati di otto replica TruTip estrazioni di DNA circolante liberamente dal plasma. Campioni indicati da asterischi (* o **) sono stati estratti in giorni separati. CHY quantifica il DNA fetale maschio e CH1 quantifica il DNA totale presente (fetale e materna). qPCR è stata eseguita su un sistema 480 LightCycler (Roche) con saggi precedentemente pubblicati rivolte CHY e CH1 18.

TruTip è una tecnologia semplice estrazione degli acidi nucleici in cui una porosa, monolitica matrice legante viene inserito in una punta di pipetta. Conseguentemente, il formato preparazione del campione è compatibile con gli strumenti di manipolazione più liquidi, e può essere utilizzato per molte applicazioni cliniche medio-alto throughput e tipi di campione.

Ad alta velocità, l&#39;estrazione automatizzata di DNA e RNA da campioni clinici utilizzando la tecnologia TruTip su Robot Gestione liquidi comuni

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare il DNA genomico umano da sangue intero, utilizzando la tecnologia di estrazione con true tip e la workstation automatizzata per la movimentazione di liquidi Hamilton Star. Per raggiungere questo scopo, le cellule vengono lisate in una soluzione contenente tampone di lisi, proteinasi K ed etanolo; tale soluzione viene aspirata e dispensata più volte attraverso le true tip, determinando il legame del DNA alla matrice delle true tip. Successivamente, due distinti tamponi di lavaggio vengono fatti passare attraverso le true tip al fine di rimuovere le proteine residue, il tampone di lisi e altre contaminazioni dagli acidi nucleici legati.Nel terzo passaggio, la matrice di legame della punta True viene essiccata aspirando ed erogando aria più volte per evaporare qualsiasi tampone di lavaggio residuo; nell'ultima fase, il tampone illusion viene fatto passare avanti e indietro attraverso la matrice di legame per rilasciare il DNA dalla matrice. Utilizzando la tecnologia True Tip, si ottiene così un DNA genomico ad alto peso molecolare privo di contaminanti, la cui presenza può essere confermata mediante assorbanza UV-vis, elettroforesi su gel e PCR quantitativa o sequenziamento. I vantaggi della True Tip rispetto ad altri metodi di preparazione del campione basati su colonne a centrifuga o su particelle magnetiche consistono nella facilità di automazione della True Tip.Non richiede sistemi costosi dotati di centrifughe e aste magnetiche, e il semplice flusso di lavoro consente di risparmiare prezioso spazio operativo. Sebbene oggi ci concentreremo sul sangue intero, Tru Tip può essere applicato anche ad altre applicazioni di campioni di DNA genomico, nonché all'isolamento di RNA virale da campioni clinici prelevati con tampone o di DNA libero da cellule dal plasma, solo per citarne alcune. A dimostrare la procedura sarà Dane Brady, ingegnere specializzato in automazione del nostro laboratorio, che ha svolto un ruolo fondamentale nello sviluppo della procedura di estrazione Tru Tip sulla stazione di movimentazione liquidi Hamilton.In questo protocollo, un robot automatico per la manipolazione di liquidi Hamilton Star estrae contemporaneamente il DNA da 96 pozzetti di sangue intero. Il Hamilton Star è dotato di un'unità opzionale di riscaldamento e agitazione montata sul deck, fondamentale per la digestione enzimatica di alcune matrici cliniche come il sangue intero. Poiché il sistema può essere equipaggiato con una testa pipettante a 96 canali, esiste una piastra a 96 pozzetti dedicata per ciascuno dei passaggi effettivi con le punte e per i reagenti.Accendere innanzitutto l'equipaggiamento associato al robot Hamilton Star e il computer. Aprire il software Hamilton Run Control. Aprire il file di esecuzione fornito da ACON per 96 campioni.Ora configurare il layout della star deck seguendo il diagramma. Posizionare punte filtrate da un millilitro in tutte le posizioni contrassegnate con uno; nella posizione due, posizionare punte non filtrate da un millilitro; nella posizione tre, posizionare punte Conni Hamilton da un millilitro LPT da due millimetri. Continuare facendo riferimento alla tabella per riempire le posizioni rimanenti, dalla cinque alla dodici, con le LabWare richieste, ma non caricare ancora i campioni.Ora distribuire i reagenti: 75 millilitri di tampone di lisi e legame. F deve essere caricato nella posizione cinque della vaschetta. In alternativa, si possono utilizzare anche piastre pre-riempite con tamponi per ottimizzare l'allestimento e semplificare la disposizione del deck.Continuare a caricare il robot di conseguenza. Infine, rimuovere i tappi dai tubi del sangue e posizionarli nei portacampioni o nella posizione quattro del deck. Posizionare il campione uno nella parte posteriore del portacampioni più a sinistra e procedere sequenzialmente lungo ogni portacampioni, con il campione 96 che occupa la posizione anteriore destra.Dopo aver caricato tutti i campioni, lasciarli equilibrare alla temperatura ambiente. Poiché il protocollo è completamente automatizzato, le possibilità di errore da parte dell'operatore sono minime. I campioni devono essere posizionati nell'ordine corretto sul rack, ma è possibile implementare la codifica a barre per garantire un tracciamento accurato dei campioni.Per avviare uno script automatizzato, selezionare il pulsante di riproduzione nell'angolo superiore sinistro della finestra del file di esecuzione e inserire il numero di campioni da processare. Il primo passaggio eseguito dallo script è il trasferimento di 80 microlitri di proteinasi K nella piastra di incubazione nella posizione 14 sul modulo agitatore riscaldante. Successivamente, lo script dispensa 200 microlitri di campione in ciascun pozzetto della piastra di incubazione utilizzando il braccio a otto canali.Successivamente, si dispensano 600 microlitri di tampone di lisi F in ogni pozzetto della piastra di incubazione utilizzando il braccio a 96 canali. Lo script mescola quindi la soluzione per 10 cicli e la incuba per 20 minuti a 70 gradi Celsius e 500 giri al minuto nella piastra a pozzetti profondi; la temperatura è di soli 60 gradi Celsius, valore compreso nell'intervallo di attività della proteinasi K. Mentre i campioni sono in incubazione, il sistema di gestione dei liquidi continua a funzionare dispensando i reagenti di estrazione e di eluizione dai serbatoi principali nelle rispettive piastre a 96 pozzetti; vengono aggiunti 100 microlitri di tampone Elucian A in ogni pozzetto della piastra a pozzetti profondi.Nella posizione 13, 800 microlitri di etanolo vengono depositati in ogni pozzetto della piastra a pozzetti profondi. Nella posizione dieci, 1,6 millilitri di buffer di lavaggio K vengono aggiunti a ciascun pozzetto della piastra a pozzetti profondi nella posizione 12 e 1,6 millilitri di buffer di lavaggio J vengono aggiunti a ciascun pozzetto della piastra a pozzetti profondi nella posizione 11. Dopo l'incubazione di 20 minuti, la miscela campione viene trasferita dalla piastra di incubazione alla piastra a pozzetti profondi contenente etanolo nella posizione 10, dove viene mescolata mediante 12 cicli di pipettaggio.Durante tutto il processo, le punte dei reagenti vengono smaltite nel contenitore dei rifiuti secondo necessità. Il programma prosegue dalla fase di lisi all'estrazione del DNA caricando innanzitutto 96 punte vere dalla posizione tre del deck. Il passo successivo consiste nell'aspirare e dispensare i campioni nella posizione 10 per 10 cicli, consentendo così il legame degli acidi nucleici al monolite della punta vera.Successivamente, le punte vere si spostano alla posizione 11, dove il Buffer di lavaggio J viene fatto passare attraverso il monolite cinque volte per rimuovere i residui di lisi, tampone e matrice del campione. Poi le punte vere si spostano alla posizione 12, dove il Buffer di lavaggio K viene fatto passare attraverso di esse cinque volte per rimuovere le proteine e altre contaminanti dagli acidi nucleici legati. Successivamente, le punte vere vengono essiccate all'aria facendole ciclare 80 volte ad alta velocità sopra la piastra di lavaggio.Ora, le punte True si spostano nella posizione 13, dove il buffer Elucian passa attraverso di esse due cicli per cinque volte, rilasciando il DNA nella piastra a pozzetti profondi. Le punte True vengono ora espulse nel contenitore dei rifiuti. Il programma è ora terminato.Rimuovere la piastra di eluizione dallo strumento e trasferire i campioni estratti nei tubi appropriati per la conservazione o per applicazioni successive. Il programma può inoltre essere personalizzato per trasferire automaticamente i campioni finali nel tubo o nella piastra desiderati in soli sessanta minuti. Il sistema automatizzato ha estratto il DNA genomico da 96 campioni di sangue utilizzando il robot.I profili di assorbanza di 45 campioni di sangue positivi sono stati processati contemporaneamente con 45 bianchi del reagente. Il rapporto medio tra 260 e 280 era di 1,96, e il rapporto medio tra 260 e 230 era di 1,93, suggerendo campioni puri su un gel al 1% di agarosio. Campioni casuali presentavano un alto peso molecolare con minima frammentazione.Il rendimento medio era di circa cinque microgrammi di DNA per 200 microlitri di sangue intero. Quando si ottimizza il protocollo automatizzato con vere punte, si presta particolare attenzione per assicurarsi che non vi sia contaminazione incrociata tra i pozzetti. La PCR in tempo reale mostra una chiara separazione tra positivi e negativi, come mostrato qui.Per le estrazioni di RNA, l'intera procedura di 96 campioni può essere completata in meno di un'ora con un tempo minimo di manipolazione manuale richiesto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare il DNA genomico umano da sangue intero utilizzando la tecnologia automatizzata TRU sul sistema di manipolazione liquidi Hamilton Star.

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