Ad alta velocità, l'estrazione automatizzata di DNA e RNA da campioni clinici utilizzando la tecnologia TruTip su Robot Gestione liquidi comuni

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare il DNA genomico umano da sangue intero, utilizzando la tecnologia di estrazione con true tip e la workstation automatizzata per la movimentazione di liquidi Hamilton Star. Per raggiungere questo scopo, le cellule vengono lisate in una soluzione contenente tampone di lisi, proteinasi K ed etanolo; tale soluzione viene aspirata e dispensata più volte attraverso le true tip, determinando il legame del DNA alla matrice delle true tip. Successivamente, due distinti tamponi di lavaggio vengono fatti passare attraverso le true tip al fine di rimuovere le proteine residue, il tampone di lisi e altre contaminazioni dagli acidi nucleici legati.

Nel terzo passaggio, la matrice di legame della punta True viene essiccata aspirando ed erogando aria più volte per evaporare qualsiasi tampone di lavaggio residuo; nell'ultima fase, il tampone illusion viene fatto passare avanti e indietro attraverso la matrice di legame per rilasciare il DNA dalla matrice. Utilizzando la tecnologia True Tip, si ottiene così un DNA genomico ad alto peso molecolare privo di contaminanti, la cui presenza può essere confermata mediante assorbanza UV-vis, elettroforesi su gel e PCR quantitativa o sequenziamento. I vantaggi della True Tip rispetto ad altri metodi di preparazione del campione basati su colonne a centrifuga o su particelle magnetiche consistono nella facilità di automazione della True Tip.

Non richiede sistemi costosi dotati di centrifughe e aste magnetiche, e il semplice flusso di lavoro consente di risparmiare prezioso spazio operativo. Sebbene oggi ci concentreremo sul sangue intero, Tru Tip può essere applicato anche ad altre applicazioni di campioni di DNA genomico, nonché all'isolamento di RNA virale da campioni clinici prelevati con tampone o di DNA libero da cellule dal plasma, solo per citarne alcune. A dimostrare la procedura sarà Dane Brady, ingegnere specializzato in automazione del nostro laboratorio, che ha svolto un ruolo fondamentale nello sviluppo della procedura di estrazione Tru Tip sulla stazione di movimentazione liquidi Hamilton.

In questo protocollo, un robot automatico per la manipolazione di liquidi Hamilton Star estrae contemporaneamente il DNA da 96 pozzetti di sangue intero. Il Hamilton Star è dotato di un'unità opzionale di riscaldamento e agitazione montata sul deck, fondamentale per la digestione enzimatica di alcune matrici cliniche come il sangue intero. Poiché il sistema può essere equipaggiato con una testa pipettante a 96 canali, esiste una piastra a 96 pozzetti dedicata per ciascuno dei passaggi effettivi con le punte e per i reagenti.

Accendere innanzitutto l'equipaggiamento associato al robot Hamilton Star e il computer. Aprire il software Hamilton Run Control. Aprire il file di esecuzione fornito da ACON per 96 campioni.

Ora configurare il layout della star deck seguendo il diagramma. Posizionare punte filtrate da un millilitro in tutte le posizioni contrassegnate con uno; nella posizione due, posizionare punte non filtrate da un millilitro; nella posizione tre, posizionare punte Conni Hamilton da un millilitro LPT da due millimetri. Continuare facendo riferimento alla tabella per riempire le posizioni rimanenti, dalla cinque alla dodici, con le LabWare richieste, ma non caricare ancora i campioni.

Ora distribuire i reagenti: 75 millilitri di tampone di lisi e legame. F deve essere caricato nella posizione cinque della vaschetta. In alternativa, si possono utilizzare anche piastre pre-riempite con tamponi per ottimizzare l'allestimento e semplificare la disposizione del deck.

Continuare a caricare il robot di conseguenza. Infine, rimuovere i tappi dai tubi del sangue e posizionarli nei portacampioni o nella posizione quattro del deck. Posizionare il campione uno nella parte posteriore del portacampioni più a sinistra e procedere sequenzialmente lungo ogni portacampioni, con il campione 96 che occupa la posizione anteriore destra.

Dopo aver caricato tutti i campioni, lasciarli equilibrare alla temperatura ambiente. Poiché il protocollo è completamente automatizzato, le possibilità di errore da parte dell'operatore sono minime. I campioni devono essere posizionati nell'ordine corretto sul rack, ma è possibile implementare la codifica a barre per garantire un tracciamento accurato dei campioni.

Per avviare uno script automatizzato, selezionare il pulsante di riproduzione nell'angolo superiore sinistro della finestra del file di esecuzione e inserire il numero di campioni da processare. Il primo passaggio eseguito dallo script è il trasferimento di 80 microlitri di proteinasi K nella piastra di incubazione nella posizione 14 sul modulo agitatore riscaldante. Successivamente, lo script dispensa 200 microlitri di campione in ciascun pozzetto della piastra di incubazione utilizzando il braccio a otto canali.

Successivamente, si dispensano 600 microlitri di tampone di lisi F in ogni pozzetto della piastra di incubazione utilizzando il braccio a 96 canali. Lo script mescola quindi la soluzione per 10 cicli e la incuba per 20 minuti a 70 gradi Celsius e 500 giri al minuto nella piastra a pozzetti profondi; la temperatura è di soli 60 gradi Celsius, valore compreso nell'intervallo di attività della proteinasi K. Mentre i campioni sono in incubazione, il sistema di gestione dei liquidi continua a funzionare dispensando i reagenti di estrazione e di eluizione dai serbatoi principali nelle rispettive piastre a 96 pozzetti; vengono aggiunti 100 microlitri di tampone Elucian A in ogni pozzetto della piastra a pozzetti profondi.

Nella posizione 13, 800 microlitri di etanolo vengono depositati in ogni pozzetto della piastra a pozzetti profondi. Nella posizione dieci, 1,6 millilitri di buffer di lavaggio K vengono aggiunti a ciascun pozzetto della piastra a pozzetti profondi nella posizione 12 e 1,6 millilitri di buffer di lavaggio J vengono aggiunti a ciascun pozzetto della piastra a pozzetti profondi nella posizione 11. Dopo l'incubazione di 20 minuti, la miscela campione viene trasferita dalla piastra di incubazione alla piastra a pozzetti profondi contenente etanolo nella posizione 10, dove viene mescolata mediante 12 cicli di pipettaggio.

Durante tutto il processo, le punte dei reagenti vengono smaltite nel contenitore dei rifiuti secondo necessità. Il programma prosegue dalla fase di lisi all'estrazione del DNA caricando innanzitutto 96 punte vere dalla posizione tre del deck. Il passo successivo consiste nell'aspirare e dispensare i campioni nella posizione 10 per 10 cicli, consentendo così il legame degli acidi nucleici al monolite della punta vera.

Successivamente, le punte vere si spostano alla posizione 11, dove il Buffer di lavaggio J viene fatto passare attraverso il monolite cinque volte per rimuovere i residui di lisi, tampone e matrice del campione. Poi le punte vere si spostano alla posizione 12, dove il Buffer di lavaggio K viene fatto passare attraverso di esse cinque volte per rimuovere le proteine e altre contaminanti dagli acidi nucleici legati. Successivamente, le punte vere vengono essiccate all'aria facendole ciclare 80 volte ad alta velocità sopra la piastra di lavaggio.

Ora, le punte True si spostano nella posizione 13, dove il buffer Elucian passa attraverso di esse due cicli per cinque volte, rilasciando il DNA nella piastra a pozzetti profondi. Le punte True vengono ora espulse nel contenitore dei rifiuti. Il programma è ora terminato.

Rimuovere la piastra di eluizione dallo strumento e trasferire i campioni estratti nei tubi appropriati per la conservazione o per applicazioni successive. Il programma può inoltre essere personalizzato per trasferire automaticamente i campioni finali nel tubo o nella piastra desiderati in soli sessanta minuti. Il sistema automatizzato ha estratto il DNA genomico da 96 campioni di sangue utilizzando il robot.

I profili di assorbanza di 45 campioni di sangue positivi sono stati processati contemporaneamente con 45 bianchi del reagente. Il rapporto medio tra 260 e 280 era di 1,96, e il rapporto medio tra 260 e 230 era di 1,93, suggerendo campioni puri su un gel al 1% di agarosio. Campioni casuali presentavano un alto peso molecolare con minima frammentazione.

Il rendimento medio era di circa cinque microgrammi di DNA per 200 microlitri di sangue intero. Quando si ottimizza il protocollo automatizzato con vere punte, si presta particolare attenzione per assicurarsi che non vi sia contaminazione incrociata tra i pozzetti. La PCR in tempo reale mostra una chiara separazione tra positivi e negativi, come mostrato qui.

Per le estrazioni di RNA, l'intera procedura di 96 campioni può essere completata in meno di un'ora con un tempo minimo di manipolazione manuale richiesto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare il DNA genomico umano da sangue intero utilizzando la tecnologia automatizzata TRU sul sistema di manipolazione liquidi Hamilton Star.