Name: Stabilire funghi entomopatogeni come endofiti: Verso endofiti Controllo Biologico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Scopri come stabilire Beauveria bassiana come endofita nel fagiolo comune (Phaseolus vulgaris) utilizzando metodi di inoculazione efficaci. Questo protocollo dimostra tecniche di spruzzo fogliare e drenaggio del suolo.

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La produzione e il lavoro sperimentale qui presentato riflette l&#39;aiuto devoto ed entusiasta di Reynaldo Pareja. Finanziato dal Dipartimento amministrativo della Colombia della Scienza, tecnologia e innovazione (Colciencias) e da una borsa di studio dalla Fondazione Bill &amp; Melinda Gates Foundation attraverso il Grand Challenges Explorations iniziativa.

1. Piante <ol><li> Surface-sterilizzare semi di fagiolo (cv. Calima) immergendole per due minuti in ipoclorito di sodio allo 0,5% e due minuti in etanolo al 70%. Sciacquare i semi tre volte in acqua distillata sterile. </li><li> Valutare il successo della vostra sterilizzazione con placcatura 100 pl di l&#39;ultima acqua di risciacquo per patate dextroxe agar (PDA) media, e incubando la piastra per 10 giorni a 25 ° C. Terminare e riavviare l&#39;esperimento se la crescita è visto sul piatto. </li><li> Piantare i semi in gruppi di tre in vasi contenenti una miscela sterile di terra e sabbia con un rapporto 2:1. Trasferire i vasi ad una camera di crescita a 25 ° C, ca. 50% UR e 12 ore fotoperiodo. Una settimana dopo la germinazione, eliminare le due piantine meno vigorose. Acqua, ogni 2-3 giorni con acqua distillata sterile e fertilizzare 10 e 20 giorni dopo la semina con un g / L 6 soluzione acquosa di concime NPK 15-15-15. </li></ol> 2. Fungo <ol><li> Ottenere un commerformulazione finanziaria di Beauveria bassiana ceppo GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colombia). </li><li> Per generare una singola spora coltura madre, sospendere ca. uno inoculo anello pieno di conidi in 1 ml di una soluzione acquosa al 0,1% di Triton X-100 e vortex per 10 sec. Poi, piastra 100 microlitri della sospensione sul 2,5% agar Noble e incubare per 24 ore a 25 ° C. Trasferire un singolo conidio germinando in un PDA 100 millimetri piatto contenente e crescere fino a coprire l&#39;intera piastra (circa 3-4 settimane). </li><li> In condizioni di sterilità, raschiare la crescita fungina dalla superficie del terreno e sospendere in 10 ml sterile 0,1% Triton X-100. Vortex per un minuto. Poi, filtrare la sospensione attraverso una garza sterile per rimuovere ife e ottenere la sospensione stock. </li><li> Utilizzare un emocitometro di valutare la concentrazione conidi della sospensione stock. Per facilitare i conteggi conidi, preparare un 10.000 volte diluizione seriale del magazzino, ogni volta che il trasferimento di 100 pl of sospensione di conidi in 900 pl di 0,1% Triton X-100, e di vortex per 10 secondi prima della successiva diluizione. </li><li> Per generare l&#39;inoculo, regolare la sospensione magazzino ad una concentrazione finale di 10 8 conidi / ml, usando la formula: <img src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1.jpg" alt="equazione 1" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360eq1highres.jpg"/></li><li> Per valutare la redditività conidi, piastra 100 microlitri della 10.000 volte diluizione sul 2,5% agar Nobile e incubare per 24 ore a 25 ° C. Quindi, controllare tre gruppi casuali di 100 conidi per stimare la germinazione per cento. Considerare un conidio germinato quando un tubo germe visibile più di metà del diametro dei progetti conidio da esso. Utilizzare solo la sospensione quando la germinazione percentuale media superiore al 90%. </li></ol> 3. Inoculazione <ol><li> Seminare piante quando raggiungono la loro prima fase foglie vere (circa 14 giorni dopo la semina). Le piante acquatiche alla capacità del suolo con sterile distillareed acqua 24 ore prima di vaccinazioni. </li><li> Per il metodo spray fogliare, utilizzare un atomizzatore manuale per applicare la sospensione di conidi (trattamento) o 0,1% Triton X-100 (controllo) al adaxial (superiore) superficie delle foglie fino a raggiungere la saturazione. Coprire la parte superiore del vaso con un foglio di alluminio per evitare il deflusso conidi al suolo. Dopo la spruzzatura, coprire le piante con un sacchetto di plastica per 24 ore per mantenere un elevato livello di umidità facilitare invasione fungina. </li><li> Per il metodo del suolo drench, utilizzare un cilindro graduato da applicare 10 ml di sospensione di conidi (trattamento) o 0,1% Triton X-100 (controllo) alla superficie del terreno alla base della pianta. </li><li> Dopo vaccinazioni, tornare impianti alle camere di crescita organizzare in un disegno randomizzato blocco completo. Non meno di quattro blocchi aggiuntivi sperimentali deve essere installato per consentire valutazioni di crescita delle piante, oltre a valutazioni di colonizzazione endofitica, nello stesso esperimento. </li></ol> 4. Evalgenza <ol><li> Valutare l&#39;esperimento un blocco alla volta, selezionando i blocchi in ordine casuale. Ciò è particolarmente importante per gli esperimenti di grandi dimensioni che non possono essere valutati in un solo giorno. </li><li> Prima di elaborare una pianta, misurare e registrare la sua altezza dalla base al meristema apicale. Poi, sradicare con attenzione e lavare accuratamente in acqua corrente. </li><li> Da ogni campione vegetale, due foglioline, due pezzi di radice e due pezzi di stelo. Selezionare casualmente campioni foglietto dalla prima foglia vera della pianta. Quindi, ottenere due campioni staminali, 3 cm di lunghezza ciascuno, dal centro della pianta e dalla prossimità della superficie del terreno. Infine, ottenere due campioni Taproot, anche 3 cm di lunghezza ciascuno, a partire dalla metà della radice e da 1 cm dietro la punta della radice. Porre i campioni in tre sacchetti di carta separati e di etichette in modo appropriato. </li><li> Dopo il lavaggio e campionamento tutte le piante in un blocco, iniziare lavorazione delle foglie, poi le radici, e, infine, i gambi. </li><li> Surface sterilizzare tproblemi in una cappa a flusso laminare sterile come in 1.1, di cui sopra. Lavare ogni campione tre volte per immersione in acqua distillata sterile e lasciare asciugare in un tovagliolo di carta sterile. Poi, sezionare e scartare i suoi bordi esterni, dove endofiti potrebbe essere stato eliminato a causa del contatto con disinfettanti. </li><li> Tagliare il campione tagliato in sei sezioni, con una media 6x6 millimetri per le foglie e 6 mm di lunghezza per steli e radici. Tavola delle sei sezioni su un piatto 60 millimetri Petri con i media PDA integrato con la tetraciclina antibiotici, streptomicina e penicillina a 2 mg / L ciascuno. Sigillare la piastra con parafilm e incubare al buio a 25 ° C. Ogni pianta produce sei piatti, due parti per impianti. </li><li> Cambiare l&#39;acqua di risciacquo dopo l&#39;elaborazione di ogni blocco di una parte dato impianto. Prima di eliminare l&#39;usato acqua di risciacquo, piatto un campione di 100 microlitri su supporti PDA e incubare per 10 giorni a 25 ° C per valutare il successo di sterilizzazione. Se la crescita fungina ne consegue, non considerano i campioni corrispondenti per le analisi. </li><li> Ispezionare le piastre ogni 2-3 giorni per 20 giorni per osservare e registrare la crescita di funghi. Sezioni d&#39;impianto accise e il trasferimento espone presenza di endofiti fungini alle piastre contenenti PDA fresco. Ciò consente di evitare la contaminazione delle sezioni d&#39;impianto connessi applicabili alla piastra originale. </li><li> Record B. crescita bassiana da sezioni dell&#39;impianto. Beauveria bassiana può essere identificato dal caratteristico miceli bianco denso diventando crema a giallo pallido al bordo. In caso di dubbio, montare il campione in una goccia d&#39;acqua e controllare al microscopio, alla ricerca di conidi globosi e zig-zag a forma di conidiofori, caratteristica della specie. </li><li> Utilizzare ulteriori blocchi sperimentali per valutare l&#39;impatto dei trattamenti sulla biomassa vegetale. Primo, misurare l&#39;altezza dalla base alla sommità del meristema apicale. Poi, con attenzione sradicare le piante e lavare in acqua corrente e lasciarli asciugare a 45 ° C per tre giorni per determinare il loro peso secco. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Molti fattori possono influenzare il risultato di un esperimento specifico per stabilire una entomopathogen fungina come endophyte. I nostri risultati dimostrano il metodo di inoculazione è uno di loro. Fattori biologici di sperimentare sono il raccolto specie o cultivar selezionata e il ceppo fungina entomopathogen specie o isolare utilizzati. Altri fattori da considerare includono manipolare la concentrazione dell&#39;inoculo, l&#39;età della pianta durante inoculazioni, e condizioni di crescita della pianta. Sarebbe ideale per un metodo di inoculazione di provocare colonizzazione vegetale sistemica da un fungo 14,17,18,21 entomopathogen. Invece, sembra che i metodi di inoculazione tendono a favorire un modello specifico di colonizzazione locale. Nel caffè, per esempio, spray fogliari favorire la colonizzazione foglia mentre inzuppa suolo favorire colonizzazione delle radici 17. Abbiamo trovato lo stesso modello nel fagiolo comune. In definitiva, la scelta del metodo di inoculazione dovrebbe essereguidati dalla posizione prevista del endofiti all&#39;interno di un impianto, presumibilmente corrispondente alla nicchia del erbivoro di destinazione o patogeno per le piante. Anche se comunemente usato, il rilevamento e la quantificazione endofiti basata sulle culture dei media può essere costoso, difficile e soggetto a errori. Ad esempio, un totale di 10.800 sezioni di impianto (piastrate su piastre Petri 1800) sono stati valutati in un esperimento per ottimizzare B. vaccinazioni bassiana su Banana 16. Di questi, 4.496 sezioni sono state colonizzate da un putativo B. bassiana, come individuate principalmente dalla morfologia delle colonie. Chiaramente, una verifica microscopica delle specie per ogni colonia sarebbe stato un passo auspicabile, ma inaccessibile. D&#39;altra parte, 1.176 sezioni sono state colonizzate da funghi e altri sono stati scartati e trattati come dati mancanti 16. La probabilità esiste, tuttavia, che B. bassiana era un concorrente povero o più lento a crescere, e avrebbe potuto eventualmente emerse da queste parti se unllowed tempo sufficiente. Di conseguenza, i metodi di rilevamento endofiti basati sulle culture dei media sono soggetti a falsi positivi e falsi negativi. Di conseguenza, lo sviluppo di un rilevamento più affidabile e quantificazione metodi, ad esempio quelle basate sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) saggi 20,21,24, è ben giustificata. L&#39;obiettivo finale per esperimenti di inoculazione dovrebbe essere quello di sviluppare un trattamento efficace che fornisce duratura resistenza sistemica contro erbivori e / o malattia. Una plausibile, ma ancora non testato, l&#39;ipotesi è che l&#39;entità della colonizzazione endofitica dovrebbe correlata positivamente con il grado di endofiti resistenza mediata. Un naturale passo successivo dopo la rifinitura metodi di inoculazione, quindi, potrebbe essere quello di esaminare la correlazione. Diversi protocolli video può aiutare i ricercatori a progettare un dosaggio adeguato di resistenza per un parassita o patogeno bersaglio 29-31. In definitiva, questo saggio è quello che determina il successo della inoculizione metodo, e il potenziale associato per endofitica controllo biologico.

Entomopatogeni fungine sono importanti regolatori di popolazioni di insetti con un notevole potenziale come mycopesticides 1. Solo recentemente, tuttavia, hanno entomopatogeni fungine stato verificato come endofiti, naturalmente o in risposta a vari metodi di inoculazione 2. La funzione ecologica di endofiti fungini entomopatogeni rimane in gran parte sconosciuta, ma alcuni studi li hanno implicato nella crescita delle piante 3,4, resistenza erbivoro 5-8, e la resistenza alle malattie 9,10. L&#39;obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di introdurre un entomopathogen fungina come endophyte, in preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico. Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) è il più studiato entomopathogen endofitica fungine 5-9,11-19, ed è disponibile come mycopesticide commerciale. Metodi di inoculazione testato per stabilire <em&gt; B. bassiana come endofiti includono inzuppa suolo 14,17, rivestimenti di semi 18 e immersioni 14, condimenti radichetta 13,15, radici e rizoma immersioni 11,16,18, iniezioni stelo 17, spray fogliari 14,17,20 e spruzzi di fiori 19. Usando questi metodi, i ricercatori hanno introdotto B. bassiana in banane 11, fagiolo 7, cacao 13, caffè 17, mais 7, cotone 7, della palma da datteri 12, iuta 21, papavero da oppio 20, zucca 7, radiata pino 18, sorgo 14, pomodoro 7 e grano 7. Recenti evidenze suggeriscono che endofitica B. bassiana ha il potenziale per proteggere le piante non solo dai parassiti artropodi 5-7,22-27, ma anche da alcuni agenti patogeni delle piante 9. Il fagiolo comune (Phaseolus vulgaris), si classifica tra le colture più vulnerabili ai parassitie malattie. Esso può essere influenzata da più di 400 e 200 parassiti patogeni, la cui attacco è pensato per essere il più fattore limitante produzione di fagioli tra le regioni 28. Di conseguenza, il fagiolo comune può essere una coltura eccellente modello per esaminare l&#39;intero spettro di endofitica controllo biologico di B. bassiana. Come primo passo in questa direzione, in questo articolo viene descritto spray fogliari e inzuppa suolo come metodi di inoculazione di introdurre B.bassiana come endophyte nel fagiolo comune.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Name of Reagent/Material</td><td>Numero di catalogo</td><td></td><td>dell'azienda</td></tr><tr><td>Mycotrol SE </td><td>Laverlam</td><td>4167</td><td></td></tr><tr><td>Noble agar</td><td>Sigma</td><td>A5431-250G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina G sale sodico</td><td>Sigma</td><td>P3032-25MU</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (100 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri (60 x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio di patate agar</td><td>Difco</td><td>213400</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina normale (NaOCl)</td><td>CLOROX</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sale solfato di streptomicina</td><td>Sigma</td><td>S6501-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Sigma</td><td>T3258-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tripla mela cotogna (NPK)</td><td>ABOCOL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Fisher</td><td>02-671-10</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM LB microscopio</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

stabilire funghi entomopatogeni come endofiti: verso endofiti controllo biologico

Establishing Fungal Entomopathogens as Endophytes: Towards Endophytic Biological Control

Beauveria bassiana è un entomopathogen fungina con la capacità di colonizzare piante endophytically. Come endophyte, B. bassiana può giocare un ruolo nel proteggere le piante da herbivory e malattia. Questo protocollo vengono illustrati due metodi di inoculazione per stabilire B. bassiana endophytically nel fagiolo comune (Phaseolus vulgaris), in preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico. Le piante sono cresciute da semi sterilizzati in superficie per due settimane prima di ricevere una B. trattamento bassiana di 10 8 conidi / ml (o acqua) applicati sia come spray fogliare o inzuppare suolo. Due settimane più tardi, le piante vengono raccolte e le loro foglie, steli e radici vengono campionati a valutare endofitica colonizzazione fungina. Per questo, i campioni sono individualmente superficie sterilizzati, tagliato in più sezioni, e incubate in media patata destrosio agar per 20 giorni. Il supporto viene controllato ogni 2-3 giorni per osservare la crescita di funghi comesociated con sezioni dell&#39;impianto e registrare il verificarsi di B. bassiana per stimare l&#39;estensione della sua colonizzazione endofitica. Analisi di successo inoculazione confronta il verificarsi di B. bassiana all&#39;interno di una parte dato impianto (cioè le foglie, steli o radici) attraverso trattamenti e controlli. In aggiunta al metodo di inoculazione, l&#39;esito specifico dell&#39;esperimento può dipendere coltura di destinazione o varietà, le specie fungine entomopathogen ceppo o isolare utilizzati, e condizioni di crescita della pianta.

B. bassiana è stato in grado di colonizzare endophytically-P. vulgaris in risposta ai trattamenti inoculazione dimostrato (Figura 1). Sia spray fogliari e inzuppa del suolo ha determinato la colonizzazione endofitica da B. bassiana in oltre l&#39;80% delle piante trattate (Figura 2). Tuttavia, il grado di colonizzazione dipendeva da parte dell&#39;impianto valutata e il metodo di inoculazione utilizzato. Foglie risposto meglio per vaccinazioni a spruzzo. Roots, invece, risposto solo a inoculazioni bagnarsi. Infine, steli risposto analogamente a entrambi i metodi di inoculazione. B. bassiana non è stata rilevata in nessuna delle sezioni dell&#39;impianto di controllo. Indipendentemente dalle endofiti, di trattamento di B. bassiana è cresciuto dal 15% delle sezioni d&#39;impianto valutate, ma sono stati sezionati fuori dalle piastre di supporto prima che potessero invadere sezioni confinanti e influenzare i risultati. Gli impianti di trattamento e di controllo sono visibilmente distinguibili due settimane dopo vaccinazioni. Nessuna differenza è stata rilevata nel loro peso secco e la loro altezza. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. I risultati rappresentativi dei trattamenti inoculazione sulla colonizzazione endofitica di piante di fagiolo (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Da Beauveria bassiana alto a sinistra:. Controllo lamiere senza crescita. In alto a destra: funghi endofiti da una sezione di impianto di contaminare l&#39;intera piastra. In basso a sinistra: B. bassiana crescente da due sezioni di impianto. In basso a destra: endofiti B. bassiana conidi e conidiofori come si è visto al microscopio. <img src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50360/50360fig2highres.jpg"/> Figura 2. Effetto di trattamenti inoculazione sulla colonizzazione endofitica di beaimpianti n (Phaseolus vulgaris cv. Calima) di Beauveria bassiana, due settimane dopo l&#39;inoculazione con GHA ceppo. colonizzazione Percent rappresenta il numero di sezioni di impianto colonizzati diviso per il numero di sezioni di coltura.

Questo protocollo vengono illustrati due metodi di inoculazione per introdurre il entomopathogen fungina<em&gt; Beauveria bassiana</em&gt; Come endophyte nel fagiolo comune (<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;), In preparazione per le successive valutazioni di endofitica controllo biologico.

Stabilire funghi entomopatogeni come endofiti: Verso endofiti Controllo Biologico

 Beauveria bassiana is a fungal entomopathogen with the ability to colonize plants endophytically. As an endophyte, B. bassiana may play a role in ...

Ciao. Mi chiamo Ush Parsa e sono un entomologo presso SEA, il Centro Internazionale per l'Agricoltura Tropicale. Sono ViiV Artiz, anch'io del Centro Internazionale per l'Agricoltura Tropicale, e sono Fernando Vega del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. L'obiettivo generale di questo video è mostrare come facilitare e verificare il consolidamento di un fungo come agente patogeno.Come endofita, è comune in natura trovare un insetto o un acaro infettato da un fungo patogeno, e da lungo tempo questi funghi entomopatogeni vengono utilizzati come pesticidi biologici. Più di recente, i funghi entomopatogeni sono stati occasionalmente ritrovati anche in piante infette, senza tuttavia provocare sintomi visibili della loro presenza. Tale scoperta indica il loro potenziale impiego come endofite protettive contro i parassiti agricoli.Per esplorare questa potenzialità, è innanzitutto fondamentale sviluppare un metodo di inoculazione che stabilisca in modo affidabile un patogeno fungino come endofita in una coltura bersaglio. B. bassiana è uno dei patogeni fungini meglio studiati ed è facilmente disponibile in commercio come prodotto pesticida. Questo fungo è stato rilevato come endofita in numerose specie vegetali, tra cui banane, caffè e noce moscata.Evidenze recenti hanno suggerito che il ceppo B bassiana ha la capacità di proteggere le piante non solo dagli insetti parassiti, ma anche da alcuni patogeni vegetali. I meccanismi alla base di questa protezione a spettro ampio sono poco compresi. Tuttavia, nell'ambito della valvola tic, potrebbe rappresentare una soluzione promettente per colture prive di resistenza genetica nei confronti di un parassita o di un patogeno; in particolare, per colture che tipicamente subiscono attacchi simultanei da parte di più nemici, il caso comune di fas vulgaris costituisce un esempio emblematico.È soggetto all'attacco di oltre 400 parassiti e 200 agenti patogeni, il cui impatto è considerato il fattore più limitante per la produzione di fagioli in diverse regioni. Per questo motivo, riteniamo che il fagiolo comune possa rappresentare una valida coltura per esaminare il potenziale protettivo di Endo bbar. Come primo passo in questa direzione, Arvid dimostra l'efficacia di nebulizzazioni fogliari e irrigazioni del terreno come metodi di inoculazione per stabilire Bana come endofita.I semi di fagiolo comune provenienti dalla varietà TOMA vengono sterilizzati superficialmente immergendoli per due minuti in ipoclorito di sodio allo 0,5%, seguiti da un'immersione di due minuti in etanolo al 70% e da tre risciacqui in acqua distillata sterile per verificare il successo della sterilizzazione. Un campione di cento microlitri dell'acqua di risciacquo viene seminato su una piastra Petri da 100 millimetri contenente terreno PDA e incubato al buio per 10 giorni a 25 gradi Celsius. L'esperimento deve essere interrotto e ripetuto se si osserva crescita in questi controlli.I semi vengono seminati in gruppi di tre in vasi larghi 11,5 centimetri, contenenti una miscela di terra e sabbia sterilizzata a vapore in rapporto due a uno. Le piante vengono coltivate in condizioni controllate a 25 gradi Celsius, 50% di umidità relativa e un fotoperiodo di 12 ore con un'intensità luminosa di 9.200 lux a partire da una settimana dopo la germinazione. Le piante vengono diradate a una per vaso per garantire vigore ed eliminare la competizione.Vengono irrigati secondo necessità ogni due o tre giorni e fertilizzati a 10 e 20 giorni dal trapianto con una soluzione acquosa di fertilizzante NPK a sei grammi per litro. Per garantire l'uniformità genetica dei nostri funghi, gli isolati devono essere ottenuti da colture monosporiche. Se la fonte del fungo è un insetto affetto da micosi, si porta il campione nell'incubatore a flusso laminare e si utilizza un’ansa di inoculo per trasferire un piccolo campione del fungo sporulante DYS su terreno PDA.Possono essere necessari trasferimenti successivi su piastre con nuovo terreno per rimuovere contaminanti una volta che il fungo bersaglio cresce e produce spore in una coltura pura. Un piccolo campione di kedia sospeso in un millilitro di soluzione acquosa allo 0,1% di Triton X-100 viene agitato con il vortex; Triton X-100 è un tensioattivo che riduce la tensione superficiale dell'acqua e permette alla kedia di disperdersi. Un’aliquota di 100 microlitri di questa sospensione viene spalmata su una piastra di Petri da 100 millimetri contenente uno strato sottile di agar nobilissimo al 2,5%, che consentirà la visualizzazione della kedia al loro stereomicroscopio.La piastra viene incubata a temperatura ambiente per 24 ore al buio; successivamente, un singolo mezzo di germinazione viene trasferito nella piastra contenente PDA e lasciato crescere per tre o quattro settimane, fino a quando non ricopre completamente l'intera piastra e produce spore. Questo metodo consente di ottenere una coltura pura del fungo per esperimenti successivi. Per questa dimostrazione, utilizziamo una coltura pura di Bavaria Bassiana, ceppo GH HA, ottenuta dal prodotto commerciale Microt.L'inoculo viene preparato in condizioni sterili. All'interno di una cappa a flusso laminare, utilizziamo una spatola sterile per raschiare circa un grammo della crescita fungina dalla superficie del terreno e lo sospendiamo in 10 millilitri di Triton X al 0,1% sterile. La sospensione viene agitata al vortex per un minuto e filtrata attraverso una garza sterile per separare le canadia dall'Hy-Vee. Questo passaggio produce una sospensione torbida che deve essere aggiustata a una concentrazione finale di 10 alla otto kedia per millilitro per le inoculazioni.Prima di tutto, la concentrazione della soluzione madre viene stimata mediante una diluizione seriale che facilita il conteggio delle kedia. In un Emocitometro, 100 microlitri della soluzione madre vengono diluiti in 900 microlitri di Triton X al 0,1% e vorticosati, ottenendo una diluizione uno a dieci. La procedura viene ripetuta serialmente altre tre volte per ottenere una diluizione uno a diecimila.I kedia saranno presenti in numeri estremamente elevati nella prima diluizione e in numeri bassi, facilmente contabili, nell'ultima diluizione. Ciascuna delle due camere del citometro Hema viene caricata con 10 microlitri della diluizione uno su 10.000 e posta sotto microscopio per contare i kedia. L'area graduata del citometro Hema è costituita da nove quadrati grandi, ognuno dei quali contiene 100 nanolitri o 0,0001 millilitri rispettivamente.Per stimare la concentrazione di ED nel campione, si contano e si fa la media delle ED nelle quattro grandi caselle d'angolo di ogni camera, dividendola poi per 0,0001. Moltiplicando questa concentrazione per il fattore di diluizione 10 000 si ottiene la concentrazione della soluzione madre, necessaria per calcolare il volume finale a cui deve essere portata la soluzione madre. Per ottenere l'inoculo di 10 38 edia per millilitro, si applica la formula.Il volume finale è uguale al volume della soluzione madre moltiplicato per la concentrazione della soluzione madre diviso la concentrazione finale. Nella nostra dimostrazione, la soluzione madre deve essere aggiustata a un volume finale di 195,5 millilitri per ottenere la concentrazione desiderata. Prima di utilizzare l'inoculo, è importante eseguire un test di germinazione per valutare la vitalità del canale.Per questo test, si depositano 100 microlitri della diluizione uno a 10.000 su una piastra di Petri da 100 millimetri contenente il 2,5% di uovo nobile o terreno di coltura. Il campione viene distribuito sulla superficie del terreno con una bacchetta di vetro sterile e incubato al buio a 25 gradi Celsius per 24 ore. La vitalità viene valutata al microscopio stimando la percentuale di chedia con tubo germinativo in crescita.Per tre campioni casuali di 100 piantine canadesi, la sospensione canadese può essere utilizzata per inoculazioni solo se la germinazione media è superiore al 90%. In questa dimostrazione, otteniamo una germinazione media del 97%. Illustreremo due metodi di inoculazione: irrorazione fogliare e bagnatura del terreno, entrambi applicati quando le piante raggiungono lo stadio della prima foglia vera. Circa 14 giorni dopo la semina, il metodo di irrorazione fogliare viene eseguito con un atomizzatore manuale, dirigendo la sospensione inoculante sulla superficie assiale o superiore delle foglie fino a saturazione. La superficie superiore di ogni vaso viene ricoperta con carta d'alluminio per evitare che la sospensione coli nel terreno. Dopo l'irrorazione, ogni pianta viene ricoperta con un sacchetto di plastica per 24 ore per mantenere un'elevata umidità, favorendo così l'invadenza fungina.Il metodo di inoculazione mediante irrorazione del terreno viene eseguito alla capacità idrica del suolo. Circa 24 ore dopo l'irrigazione delle piante fino alla saturazione del terreno, vengono applicati 10 millilitri di una sospensione cial sulla superficie del terreno. Alla base della pianta, il controllo riceve Tritton X sterilizzato allo 0,1%, applicato nello stesso modo dei rispettivi trattamenti.Le piante vengono riportate nelle camere di crescita e disposte secondo un disegno sperimentale a blocchi completi randomizzati con tre ripetizioni per trattamento. Abbiamo valutato l'insediamento due settimane dopo l'inoculazione, analizzando un blocco alla volta. Le piante vengono raccolte con cura e lavate singolarmente sotto acqua corrente del rubinetto, partendo da ciascuna pianta.Vengono prelevati due foglioli, due frammenti di radice e due frammenti di fusto. I foglioli vengono selezionati casualmente dal primo foglio vero della pianta e tagliati in forma quadrata. Campioni di circa tre centimetri di lunghezza vengono ottenuti dalla parte centrale della pianta e da una zona vicina alla superficie del suolo. Campioni di radice principale di lunghezza simile vengono prelevati dalla parte centrale della radice e da un centimetro dietro l'apice radicale.Ogni campione viene sterilizzato singolarmente per superficie in cappa sterile con ipoclorito di sodio allo 0,5% per due minuti, seguito da etanolo al 70% per due minuti e risciacquato tre volte con acqua distillata sterile prima di essere lasciato asciugare. Su carta da filtro sterile, il campione sterilizzato viene quindi accuratamente dissezionato per eliminare il bordo esterno dove gli endofiti potrebbero essere stati eliminati a causa del contatto con gli antisettici. Il campione ridotto viene quindi tagliato in sezioni più piccole di dimensioni medie di sei per sei millimetri per le foglie e di sei millimetri di lunghezza per fusti e radici.I campioni vengono seminati su piastre di Petri da 60 millimetri contenenti PDA arricchito con gli antibiotici tetraciclina, streptomicina e penicillina, ciascuno alla concentrazione di due milligrammi per litro. Infine, le piastre vengono sigillate con paraffina e incubate al buio a 25 gradi Celsius. L'acqua di risciacquo viene sostituita dopo l'elaborazione di ogni blocco, ma prima che un campione da 100 microlitri venga seminato su una piastra di Petri da 100 millimetri, su terreno PDA, e incubato per 10 giorni a 25 gradi Celsius per verificare se la serializzazione è avvenuta con successo.Se in questo controllo si osserva una crescita, il blocco viene scartato e non viene considerato per l'analisi. Le piastre vengono ispezionate ogni due o tre giorni per un periodo di 20 giorni al fine di osservare e registrare la crescita fungina. Le sezioni vegetali colonizzate vengono escisse e trasferite singolarmente su nuove piastre di terreno per evitare la contaminazione di sezioni adiacenti.La crescita di B. bassiana viene registrata in base al micelio bianco denso caratteristico che diventa crema fino a giallo pallido ai margini. In caso di dubbio, il campione viene montato in una goccia d'acqua su un microscopio a luce e osservato per individuare la forma globulare e a zig-zag dei conidi caratteristica della specie, lo stesso giorno in cui si valuta la colonizzazione. Valutiamo inoltre l'impatto dei nostri trattamenti sulla crescita delle piante.Misuriamo innanzitutto l'altezza della pianta dalla base fino alla sommità del punto di crescita. Successivamente, estraiamo con cura le piante e le laviamo in acqua corrente, quindi le lasciamo essiccare a 45 gradi Celsius per tre giorni al fine di misurarne il peso secco. Per questa dimostrazione, abbiamo condotto l'esperimento completo due volte per ottenere risultati rappresentativi.Entrambi i metodi di inoculazione hanno determinato la colonizzazione da parte di Bana in oltre l'80% delle piante trattate. Tuttavia, l'estensione della colonizzazione dipendeva dalla parte della pianta valutata e dal metodo di inoculazione utilizzato. Le parti aeree hanno risposto meglio.Le inoculazioni mediante irrorazione delle radici, d'altro canto, hanno risposto solo alle inoculazioni con bagnatura del terreno. Infine, i fusti hanno mostrato una risposta simile a entrambi i metodi di inoculazione. Bana non è stato rilevato in nessuna delle sezioni vegetali controllate, indipendentemente dal trattamento, tranne per gli endofiti appartenenti a Bana, che sono stati rinvenuti nel 15% delle sezioni vegetali valutate; tuttavia, questi ultimi sono stati asportati manualmente dalle piastre di coltura prima che potessero invadere le sezioni adiacenti e influenzare i nostri risultati.Le piante trattate e quelle di controllo erano visibilmente indistinguibili due settimane dopo l'inoculazione, e non sono state rilevate differenze significative nel loro peso secco e nella loro altezza. Molti fattori possono influenzare un risultato specifico di un esperimento volto a stabilire un endopatogeno come effetto finale. Come dimostra questo video, il metodo di inoculazione è uno di questi fattori biologici; altri fattori biologici su cui sperimentare includono la specie o il cultivar della coltura selezionata e la scelta della specie o dell'isolato del patogeno OMA. Altri fattori da considerare e da manipolare includono la concentrazione dell'inoculo, l'età della pianta durante l'inoculazione e le condizioni di crescita della pianta.L'obiettivo finale di questi esperimenti deve essere quello di sviluppare un trattamento efficiente in grado di fornire una resistenza sistemica duratura contro INE o malattie. Quando sarete pronti per verificare la resistenza mediata dagli endofiti, raccomandiamo di guardare un video che illustra i meccanismi di resistenza ereditaria, anch'esso pubblicato nel Journal of Visualized Experiments. Si tenga presente che gli endofiti sono molto comuni nelle piante e potrebbero influenzare la capacità di stabilire e rilevare in modo persistente un patogeno fungino bersaglio come un endofita.Speriamo che questa dimostrazione si riveli utile. Buona fortuna con i vostri esperimenti.

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