Name: Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di Arabidopsis thaliana Semi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Impara a isolare embrioni precoci da semi di Arabidopsis thaliana con un metodo rapido ed efficiente. Questa tecnica consente di ottenere fino a 40 embrioni in 1-4 ore per analisi del trascrittoma, epigenoma e studi citologici.

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Vorremmo ringraziare Tal Nawy e Martin Bayer per i loro consigli su isolamento embrione. MTR, VG, UG e CB inventato l&#39;attrezzatura isolamento embrione. MTR, VG e CB sviluppato il protocollo di isolamento embrione. MTR, VG e CB stabilito il protocollo, isolati gli embrioni, e embrione generato cDNA, VG eseguito la PCR, MTR la colorazione GUS, JJ esperimenti il ​​pesce. MTR, VG, CG e UG ha scritto il manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;Università di Zurigo, una borsa di studio della Fondazione per la Ricerca Roche (a MTR), e sovvenzioni dal Fondo nazionale svizzero (di UG e CB).

La procedura è riassunto nel diagramma di flusso mostrato in Figura 1. Il microcapillari e il setup strumentale sono mostrati in Figura 2 e Figura 3, e fasi tipiche di isolamento embrioni sono mostrati in Figura 4. 1. Materiale e Buffer Preparazione 1.1 Silicon rivestimento di vetro microcapillari <ol><li> Collocare il microcapillari in una provetta Falcon 15 con ~ 5 ml di Sigmacote (Sigma) e capovolgere varie volte. </li><li> Rimuovere la soluzione, porre la provetta Falcon contenente i capillari in un foglio di alluminio e cuocere per 3 ore a 60 ° C. Conservare a temperatura ambiente. </li></ol> 1.2 Ottenere ~ 50-100 micron di diametro punte microcapillare <ol><li> Pull 1 millimetro di diametro in vetro capillari sia manualmente su un becco Bunsen o utilizzando un estrattore commerciale (verticale filamento estrattore o micropipetta estrattore). </li><li> Utilizzare un diamante-punta penna o la lama per tagliare la punta del capillare tirato per creare l&#39;apertura desiderata. Selezionare la migliore forma di capillari in un microscopio stereo. L&#39;apertura dovrebbe essere 50-100 micron (Figura 2). </li></ol> 1.3 Preparazione del vetrino <ol><li> Siliconize vetrini puliti coprendo tutti i pozzetti con Sigmacote (~ 1 ml / slide) per 5 minuti, togliere. Cuocere 3 ore in un foglio di alluminio. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i multi-pozzetto di vetro preparati microscopici per 10 min a 10% SDS, 2 x 2 min in acqua priva di nucleasi (autoclave DEPC-DDH 2 O), 2 min in etanolo al 70%, 2 min a 100% di etanolo, aria asciugare. Tutti i passaggi sono fatti in autoclave vasetti Vaschette. Le diapositive possono essere riutilizzati più volte fornendo un&#39;accurata pulizia tra ogni utilizzo. </li><li> Appena prima di embrione isolamento diffusione ~ 0,5 ml di 10 mg / ml di sieroalbumina bovina (BSA) con una pipetta su tutta la superficie di ogni pozzetto e asciugare. </li></ol> 1.4 Microscopio e configurazione capillare &lt;ol&gt; <li> Utilizzare un microscopio invertito con un 10x e 20x ingrandimento obiettivo. Ottimizzare il contrasto luce (gli embrioni sono abbastanza trasparenti). </li><li> Posizionare un micromanipolatore per tenere il capillare di vetro accanto al microscopio. Il capillare di vetro è collegato ad un microinjector (Figura 3A) o ad un normale P-200 pipetta attraverso un tubo di gomma (Figura 3B, vedere discussione per una descrizione dettagliata di questa configurazione). </li><li> Posizionare il capillare sopra il vetrino con un angolo di ~ 70 ° (figura 3) e regolare la posizione di avere l&#39;apertura nel campo di vista. </li><li> Appena prima dell&#39;isolamento embrione prendere e rilasciare ~ 5-10 microlitri BSA (1 mg / ml) per rivestire il capillare. </li></ol> 1.5 Buffer La tabella 1 riporta l&#39;isolamento e la destinazione buffer a seconda delle applicazioni a valle. <ol><li> Preparare ~ 1 ml di tampone di isolamento per campione al momento dell&#39;uso e tenerlo in ghiaccio. </li><li> Preparare il buffer di destinazione in una provetta Eppendorf ml basso legame 0,5 su ghiaccio (applicazioni molecolari) o su un vetrino da microscopio (applicazioni citologici) in una camera umida. </li></ol> 2. Seed Dissection e Embryo Estrazione 2.1 Sincronizzazione di sviluppo del seme <ol><li class="jove_content"> Evirare fiori e tenerli 2 giorni in camera di crescita, evitando il contatto dei pistilli vista con altri fiori, poi li (ad esempio 11) impollinare. </li><li class="jove_content"> Provare la fase di sviluppo sotto le condizioni di crescita da parte di indagine microscopica di semi liquidati. Con le nostre condizioni di crescita (16 ore luce a 21 ° C, 8 ore al buio a 18 ° C e 70% di umidità) semi raccolti 2,5 giorni dopo l&#39;impollinazione (DAP) ha prodotto principalmente 2-4 embrioni di cellule e semi raccolti 3,5-4 DAP prodotto globulare embrioni. </li></ol> 2.2 Seed Dissection e rottura <ol><li> Rimuovere il seeds 10-15 silique (~ 2,5 DAP) sotto uno stereomicroscopio con una pinza e aghi di insulina. </li><li> Immergere i semi in 20 microlitri di buffer di isolamento in una provetta Eppendorf da 2 ml a fondo rotondo posto sul ghiaccio. </li><li> Schiacciare delicatamente i semi con un pestello in plastica (pre-puliti con il 10% SDS, sciacquati con DEPC-DDH 2 O e lavato con etanolo al 70%) per liberare gli embrioni fino a quando l&#39;estratto di semi è nuvoloso. La forza da applicare è determinato da ogni utente al momento di prova. </li><li> Lavare pestello con 300 ml di buffer di isolamento per lavare il pestello e diluire il campione. </li><li> Spin-down l&#39;estratto a 5.000 xg per 5 sec. Risospendere delicatamente l&#39;estratto pellet pipettando su e giù 2-3 volte. </li><li> Filtrare l&#39;estratto con una rete di nylon 30 micron (montati su adattatori di tubo, ad esempio da PartecCelltricks). Sciacquare la maglia con un buffer di isolamento supplementare di 200 microlitri. </li></ol> 3. Embrione di isolamento 3.1 Preparazione del vetrino <ol> &lt;li&gt; Inserire una pulita, BSA-rivestito e siliconato slitta multi-bene sul palco del microscopio invertito, risospendere l&#39;estratto di semi filtrato pipettando delicatamente su e giù e pipettare 2 gocce di estratto di semi di 40-50 ml in 1 o 2 vasche . Vagliatura solo 1 o 2 gocce alla volta impedisce l&#39;evaporazione del campione. </li><li> Luogo 50 ml di tampone di isolamento fresco (1 ° goccia lavaggio) in un pozzo di una diapositiva diversa preparato come prima. Mantenere questa diapositiva in una coperta, camera umida per evitare l&#39;evaporazione. </li></ol> 3.2 schermo, pulire, raccogliere <ol><li> Schermare le gocce di estratto di semi di embrioni allo stadio desiderato con l&#39;obiettivo di ingrandimento di 10x. Se necessario, confermare il palco con l&#39;ingrandimento 20x. Gli embrioni di solito si depositano sul fondo della diapositiva. </li><li> Rimuovere manualmente i detriti intorno all&#39;embrione con un ago di tungsteno, un ago da insulina o apparecchiature simili. </li><li> Spostare il capillare di vetro vicino l&#39;embrione con il micromanipolatore, take l&#39;embrione con il minimo soluzione possibile. </li><li> Raccogliere diversi embrioni (p.es. tutti un&#39;unica goccia) e rilasciarli in 1 st goccia del lavaggio (applicazione molecolare) o in buffer di destinazione (applicazioni citologici). Ogni round di raccolta deve essere mantenuta entro 5-10 min e gli embrioni devono essere raccolti in un volume minimo (il volume totale di tutti i giri di raccolta deve essere &lt;5 ml). </li><li> Ripetere lo screening e raccolta fino alla quantità desiderata di embrioni viene raccolto in 1 ° goccia il lavaggio (centralmente, se possibile, per facilitare il raccoglimento). </li><li> Ricordare tutti gli embrioni in una volta dalla caduta di lavaggio (se i detriti sono riportati, rimuoverli con un ago prima di raccoglimento). </li><li> Rilasciare gli embrioni in una goccia di lavaggio 2 ° di 50 microlitri. Ripetere 3.2.6. </li><li> Rilasciare gli embrioni nel buffer di destinazione. Il trasferimento dovrebbe coinvolgere solo un contatto, e non ad immersione, della punta capillare. </li><li> Sostituire il microcapilLary per il campione successivo. </li></ol>

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<li>Nodine, M. D., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+and+paternal+genomes+contribute+equally+to+the+transcriptome+of+early+plant+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos.</a> Nature. 482 (7383), (2012).</li>
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<li>Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polycomb+group+protein+MEDEA+and+the+DNA+methyltransferase+MET1+interact+in+Arabidopsis+to+repress+autonomous+endosperm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development.</a> Plant J. 73 (5), In Press (1111).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Abbiamo sviluppato un protocollo di isolamento embrione che è rapido, efficace, e possono essere facilmente trasferiti ad altri laboratori. L&#39;apparecchiatura descritta qui consiste di un microscopio invertito, un micromanipolatore, vetro microcapillari, un estrattore verticale filamento e un microinjector (Figura 3A). La configurazione è simile a quella descritta per l&#39;isolamento singola cellula animale per transcrittomica analisi 17. Abbiamo anche lavorat...

L&#39;embrione di piante da fiore è circondato dal endosperma, un tessuto nutritivo derivato da un secondo evento fecondazione. Sia dell&#39;embrione e dell&#39;endosperma sono circondati da diversi strati di cellule del tegumento. Collettivamente questi tessuti formano un seme, che si sviluppano all&#39;interno del frutto. Così, tessuti e cellule specifiche analisi di embrioni di Arabidopsis sono fortemente compromesse a causa della loro inaccessibilità. Ciò nonostante, gli embrioni nelle fasi tardo-globulari o poi sono relativamente ben suscettibili di dissezione manuale utilizzando aghi sottili di tungsteno con lo stereomicroscopio, o applicando una leggera pressione sul seme con pinze per estrarre loro. Tali tecniche sono state utilizzate con successo per l&#39;analisi del trascrittoma o profilazione epigenoma come ibridazione di microarray, sequenziamento bisolfito, o RNA sequenza (ad esempio 1-3). Al contrario, gli studi di embrioni allo stadio di zigote globulare precoce restano tecnicamente impegnativo. Ad oggi, solo pochi studi hanno reported analisi trascrittoma sui giovani embrioni utilizzando sia microdissezione laser-capture (LCM) di tessuti embrionali di sezioni semi fissi 4 o estrazione manuale di singoli embrioni da dentro i semi utilizzando strumenti raffinati 5. Tuttavia, attrezzature LCM non è comunemente disponibile e l&#39;estrazione manuale embrione nelle fasi iniziali in termini di tempo e che richiedono ottime capacità di dissezione che non sono facilmente trasferibili. Oltre alle analisi genome-wide, analisi in situ di espressione genica sono anche difficili da eseguire sui giovani, tutto il montaggio embrioni di Arabidopsis. In una certa misura, i giovani embrioni possono essere rilasciati su vetrini da microscopio con una leggera pressione sui semi e utilizzati per i saggi reporter gene o il rilevamento di proteine ​​di immunoistochimica (per esempio vedi 6,7). Questa tecnica, tuttavia, non consente l&#39;isolamento embrione ad alta produttività, ostacolando analisi quantitative. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo efficiente e rapidaper l&#39;isolamento embrione precoce dai semi di Arabidopsis che è semplice da installare, facilmente trasferibile, e adatto per una varietà di applicazioni a valle. Il principio di base è quello di schiacciare delicatamente i semi - sezionato da giovani silique in una provetta Eppendorf con un pestello di plastica in un buffer di isolamento adeguato. L&#39;estratto di semi viene posto in goccioline in una diapositiva multi-pozzetto ed esaminato per la presenza di embrioni rilasciate nella fase desiderata utilizzando un microscopio invertito. Gli embrioni sono raccolti utilizzando un bicchiere microcapillare attaccato ad un microinjector o una pipetta di laboratorio standard. Per applicazioni molecolari, gli embrioni vengono lavati due volte mediante ripetute rilascio in gocce di nuovo buffer isolamento prima di trasferirli al buffer di destinazione in un volume minimo. Per le applicazioni citologici (saggi di giornalista, immunoistochimica, FISH), fasi di lavaggio possono essere omessi. Il metodo offre numerosi vantaggi: (i) cede 25-40 embrioni in ~ 45 min per app citologicacazioni o in 3-4 hr per applicazioni molecolari (comprese le fasi di lavaggio), (ii) permette l&#39;isolamento degli stadi embrionali specifici, (iii) è facilmente trasferibile ad altre persone e laboratori grazie alla sua semplice configurazione, (iv) richiede attrezzature conveniente per la configurazione di base che è suscettibile di aggiornamenti, e (v) è stato utilizzato con successo per varie applicazioni a valle come RNA sequenziamento 8, gene-specifico DNA-metilazione analisi 9, saggi Reporter (10 e Raissig et al., in prep.) e FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inedito, vedi figura 5).

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>SIGMA</td><td>SL2-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>RNAse OUT</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di primo filamento</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>18064-022</td><td>contenuto in pacchetto Superscript II</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen (life technologies)</td><td>18064-022</td><td>contenuto nella confezione di Superscript II</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA) 100x =10 mg/ml </td><td>New England Biolabs Inc.</td><td></td><td>Lavoreranno anche diversi fornitori </td></tr><tr><td>Capillari a parete sottile 1,0 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tubo DNA LoBind 0,5 ml</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>0030108.035</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics&#916; 30 &#956; m</td><td>PARTEC</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini da 10 mm di diametro a 5 pozzetti Microscopia</td><td>elettronica Sciences</td><td>63421-10</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino Superfrost Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>J1800AMNZ</td><td>Menzel-Gl&#228; ser</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amaresco</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fluka</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>SDS pellet</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pestello</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe da insulina microfine</td><td>BD</td><td>U-100</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Schaurlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Pinze N5</td><td>Dumont</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizzatore Pico Chip</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Nikon TMS (Giappone),</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Leitz</td><td></td><td>Leica</td></tr><tr><td>Micomanipolatore Sonda LH1 post mount</td><td>Leica microsystems</td><td>39430101</td><td>Anche diverse marche faranno il lavoro</td></tr><tr><td>Estrattore di filamenti verticale Strumento</td><td>Sutter</td><td>modello P-20</td><td>Altri modelli sono adatti anche </td></tr><tr><td>Cell Tram vario</td><td>Vaudaux-Eppendorf</td><td>5176.000.033</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizzatore</td><td>Agilent Technologies</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorimetro</td><td>Invitrogen (life technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; semi

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In piante da fiore, l&#39;embrione si sviluppa all&#39;interno di un tessuto nutriente - l&#39;endosperma - circondato dai tegumenti seminali materni (o tegumento). Come conseguenza, l&#39;isolamento di embrioni vegetali nelle fasi (1 cellula per stadio globulare) è tecnicamente difficile a causa della loro relativa inaccessibilità. Efficiente dissezione manuale a stadi precoci è fortemente compromessa dalla piccola dimensione di giovani semi di Arabidopsis e l&#39;adesività dell&#39;embrione ai tessuti circostanti. Qui, descriviamo un metodo che permette l&#39;isolamento efficiente di giovani embrioni di Arabidopsis, cedendo fino a 40 embrioni in 1 ora a 4 ore, a seconda dell&#39;applicazione a valle. Gli embrioni vengono rilasciati nel buffer di isolamento di poco schiacciamento 250-750 semi con un pestello di plastica in una provetta Eppendorf. Un bicchiere microcapillare collegato a entrambi una pipetta di laboratorio standard (tramite un tubo di gomma) o di un microinjector comando idraulico viene utilizzato per raccogliere gli embrioni da luogo gocciolined su una diapositiva multi-pozzetto su un microscopio a luce invertita. Le competenze tecniche richieste sono semplici e facilmente trasferibili, e l&#39;impostazione di base non richiede attrezzature costose. Gli embrioni raccolti sono adatti per una varietà di applicazioni a valle, come la RT-PCR, l&#39;RNA sequenziamento, analisi di metilazione del DNA, ibridazione in situ fluorescente (FISH), immunoistochimica, e saggi di geni reporter.

Nostra procedura di isolamento embrione (Figura 1) consente l&#39;isolamento di fino a 40 embrioni in 4 ore se lavaggi vengono eseguiti, ad esempio per applicazioni molecolari, o in meno di un&#39;ora se lavaggi sono omessi, ad esempio per applicazioni citologici. Figura 2 visualizza alta e bassa punte microcapillari qualità e la Figura 3 mostra la configurazione della macchina isolamento embrione. Figura 4 mostra il processo di isolam...

Riportiamo un metodo semplice ed efficace per isolare gli embrioni nelle prime fasi di sviluppo da<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi. Fino a 40 embrioni possono essere isolati in 1 ora a 4 ore, a seconda dell&#39;applicazione a valle. La procedura è adatta per transcriptome, metilazione del DNA, l&#39;espressione del gene reporter, immunostaining e fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Analisi di ibridazione.

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare gli embrioni di giovani piante. Ciò si ottiene sezionando prima i semi. Il secondo passo consiste nel frantumare delicatamente i semi in un tampone di isolamento.Successivamente, gli embrioni vengono sottoposti a screening e quindi raccolti mediante microaspirazione al microscopio invertito. La fase finale consiste nel raccogliere tutti gli embrioni in un volume minimo dopo il lavaggio e trasferirli nel tampone di destinazione. In definitiva, gli embrioni possono essere utilizzati per l'estrazione di RNA o DNA per analizzare il trascrittoma o l'epigenoma, o utilizzati per analisi citologiche, come i saggi di reporter genico o l'ibridazione fluorescente in situ.Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di essere in grado di isolare gli embrioni delle piante in massa e in specifiche fasi di sviluppo. In generale, le persone che non conoscono questo metodo non avranno problemi ad applicarlo in modo rapido ed efficiente. Per iniziare, seleziona i capillari dalla forma migliore sotto uno stereomicroscopio che sono stati precedentemente siliconati, tirati e tagliati.Come descritto nel protocollo di testo, l'apertura dovrebbe essere liscia e intorno ai 50-100 micron. Quindi, lavare i vetrini da microscopio in vetro siliconato a più pozzetti in barattoli di coplin per 10 minuti in SDS al 10% dopo il lavaggio con detersivo. Lavare i vetrini due volte per due minuti.In acqua priva di nucleasi per due minuti in etanolo al 70% per due minuti in etanolo al 100% e poi asciugare all'aria. Quindi distribuire circa 0,5 microlitri di 10 milligrammi per millilitro, albumina sierica bovina o BSA con una pipetta su tutta la superficie di ciascun pozzetto e asciugare all'aria. Quindi, prepara il microscopio per l'isolamento degli embrioni.Utilizzare un microscopio invertito con un obiettivo di ingrandimento 10x e 20x. Collegare il capillare di vetro a un microiniettore per rivestire il micro capillare. Prendi circa sei microlitri di BSA e rilascialo.Raccogli gli sleeks allo stadio di sviluppo desiderato, seguendo incroci o suole di autofecondazione. 2,5 giorni dopo l'impollinazione vengono utilizzati qui e contengono da due a quattro embrioni cellulari. Rimuovere i semi da 10 a 15 LIC sotto uno stereomicroscopio con pinza e insulina. Aghi.Immergere i semi in 20 microlitri di tampone isolante in un tubo rotondo da due millilitri posto sul ghiaccio. Schiaccia delicatamente i semi con un pestello di plastica pre-pulito come descritto nel protocollo di testo per rilasciare gli embrioni fino a quando l'estratto di semi non è torbido. La forza da applicare deve essere determinata da ogni utente al momento della prova.Sciacquare il pestello con 300 microlitri di tampone isolante per lavare il pestello e diluire il campione. Centrifugare l'estratto a 5.000 chi per cinque secondi dopo la centrifugazione. Risospendere delicatamente l'estratto pellettato pipettandolo su e giù due o tre volte.Filtrare l'estratto con una rete di nylon da 30 micron montata su adattatori per tubi e far oscillare il tubo. Risciacquare la rete con altri 200 microlitri di isolamento, tampone e oscillazione. Di nuovo. Per preparare i vetrini per l'isolamento degli embrioni, posizionare un vetrino multipozzetto pulito rivestito in BSA e siliconato sul tavolino del microscopio invertito.Posizionare il capillare sopra il vetrino e regolare la posizione per avere l'apertura nel campo visivo. Dopo Resus, sospendere l'estratto di semi filtrato pipettando delicatamente su e giù due goccioline da 40 a 50 microlitri di estratto di semi in uno o due pozzetti. Lo screening di una o due gocce alla volta, impedisce l'evaporazione del campione, collocare 50 microlitri di tampone di isolamento fresco in un pozzetto di un vetrino diverso preparato come in precedenza.Per fungere da prima goccia di lavaggio. Conservare questo vetrino in una camera umida coperta per evitare l'evaporazione. Se necessario, setacciare le goccioline di estratto di semi per gli embrioni allo stadio desiderato con l'obiettivo di ingrandimento 10x.Confermare il tavolino con l'ingrandimento 20x. Gli embrioni di solito affondano sul fondo del vetrino. L'aspetto più importante di questa procedura è raccogliere gli embrioni con il minimo di detriti.Ciò può essere ottenuto pulendo con un ago di tungsteno, controllando attentamente la goccia di lavaggio per potenziali detriti di trasporto e ripetendo la caduta se necessario. Rimuovere manualmente i detriti intorno all'embrione con un ago di tungsteno, un ago da insulina o un'attrezzatura simile. Spostare il capillare di vetro vicino all'embrione utilizzando il micromanipolatore e prelevare l'embrione con la minor quantità di soluzione possibile.Raccogli diversi embrioni e rilasciali al primo lavaggio. Goccia. Per le applicazioni molecolari per le applicazioni citologiche, gli embrioni possono andare direttamente al tampone di destinazione. Ogni giro di raccolta deve essere conservato entro 5-10 minuti e gli embrioni devono essere raccolti in un volume minimo.Ripetere lo screening e la raccolta fino a quando la quantità desiderata di embrioni non viene raccolta nella prima goccia di lavaggio. Se i detriti vengono trasportati nella goccia di lavaggio, rimuoverli con un ago prima di raccogliere tutti gli embrioni contemporaneamente dalla goccia. Rilasciare gli embrioni in una seconda goccia di lavaggio da 50 microlitri e ripetere il ricordo.Infine, rilascia gli embrioni nel buffer di destinazione. Il trasferimento deve comportare solo un contatto e non l'immersione della punta capillare mostrata. Qui ci sono diversi embrioni nell'ultima goccia dopo i lavaggi.Gli embrioni di piante isolati possono ora essere utilizzati per varie applicazioni a valle per controllare il CD NA embrionale. Librerie prima del sequenziamento. Sono stati mostrati in modo amplificato i trascritti specifici dell'embrione. Ecco i risultati dell'amplificazione PCR su CD NA. Librerie da due a quattro embrioni cellulari lavati una sola volta, e sul DNA genomico l'isolamento dell'embrione si è dimostrato molto utile nei saggi del gene reporter con bassa espressione embrionale e dove il rivestimento del seme materno confonde il rilevamento mostrato qui è un embrione che esprime un gene reporter GUS sotto il controllo del promotore Madea.Infine, l'ibridazione fluorescente in C 2 è stata applicata per studiare l'architettura nucleare in embrioni isolati incorporati in cuscinetti di acrilammide su vetrini. Qui viene mostrato un esempio che utilizza sonde contro le ripetizioni del centromero e le regioni organizzative nucleari inferiori. Una volta padroneggiata, questa tecnica consente l'isolamento di 30 embrioni in meno di un'ora per le applicazioni citologiche e in meno di tre ore per le applicazioni molecolari, comprese tutte le fasi di lavaggio.Infatti, questa tecnica permetterà alla comunità di ricerca vegetale di esplorare i meccanismi genetici ed epigenetici nell'embriogenesi.

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