Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di
7 giugno 2013
Riportiamo un metodo semplice ed efficace per isolare gli embrioni nelle prime fasi di sviluppo da Arabidopsis thaliana Semi. Fino a 40 embrioni possono essere isolati in 1 ora a 4 ore, a seconda dell'applicazione a valle. La procedura è adatta per transcriptome, metilazione del DNA, l'espressione del gene reporter, immunostaining e fluorescenza In situ Analisi di ibridazione.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare gli embrioni di giovani piante. Ciò si ottiene sezionando prima i semi. Il secondo passo consiste nel frantumare delicatamente i semi in un tampone di isolamento.
Successivamente, gli embrioni vengono sottoposti a screening e quindi raccolti mediante microaspirazione al microscopio invertito. La fase finale consiste nel raccogliere tutti gli embrioni in un volume minimo dopo il lavaggio e trasferirli nel tampone di destinazione. In definitiva, gli embrioni possono essere utilizzati per l'estrazione di RNA o DNA per analizzare il trascrittoma o l'epigenoma, o utilizzati per analisi citologiche, come i saggi di reporter genico o l'ibridazione fluorescente in situ.
Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di essere in grado di isolare gli embrioni delle piante in massa e in specifiche fasi di sviluppo. In generale, le persone che non conoscono questo metodo non avranno problemi ad applicarlo in modo rapido ed efficiente. Per iniziare, seleziona i capillari dalla forma migliore sotto uno stereomicroscopio che sono stati precedentemente siliconati, tirati e tagliati.
Come descritto nel protocollo di testo, l'apertura dovrebbe essere liscia e intorno ai 50-100 micron. Quindi, lavare i vetrini da microscopio in vetro siliconato a più pozzetti in barattoli di coplin per 10 minuti in SDS al 10% dopo il lavaggio con detersivo. Lavare i vetrini due volte per due minuti.
In acqua priva di nucleasi per due minuti in etanolo al 70% per due minuti in etanolo al 100% e poi asciugare all'aria. Quindi distribuire circa 0,5 microlitri di 10 milligrammi per millilitro, albumina sierica bovina o BSA con una pipetta su tutta la superficie di ciascun pozzetto e asciugare all'aria. Quindi, prepara il microscopio per l'isolamento degli embrioni.
Utilizzare un microscopio invertito con un obiettivo di ingrandimento 10x e 20x. Collegare il capillare di vetro a un microiniettore per rivestire il micro capillare. Prendi circa sei microlitri di BSA e rilascialo.
Raccogli gli sleeks allo stadio di sviluppo desiderato, seguendo incroci o suole di autofecondazione. 2,5 giorni dopo l'impollinazione vengono utilizzati qui e contengono da due a quattro embrioni cellulari. Rimuovere i semi da 10 a 15 LIC sotto uno stereomicroscopio con pinza e insulina. Aghi.
Immergere i semi in 20 microlitri di tampone isolante in un tubo rotondo da due millilitri posto sul ghiaccio. Schiaccia delicatamente i semi con un pestello di plastica pre-pulito come descritto nel protocollo di testo per rilasciare gli embrioni fino a quando l'estratto di semi non è torbido. La forza da applicare deve essere determinata da ogni utente al momento della prova.
Sciacquare il pestello con 300 microlitri di tampone isolante per lavare il pestello e diluire il campione. Centrifugare l'estratto a 5.000 chi per cinque secondi dopo la centrifugazione. Risospendere delicatamente l'estratto pellettato pipettandolo su e giù due o tre volte.
Filtrare l'estratto con una rete di nylon da 30 micron montata su adattatori per tubi e far oscillare il tubo. Risciacquare la rete con altri 200 microlitri di isolamento, tampone e oscillazione. Di nuovo. Per preparare i vetrini per l'isolamento degli embrioni, posizionare un vetrino multipozzetto pulito rivestito in BSA e siliconato sul tavolino del microscopio invertito.
Posizionare il capillare sopra il vetrino e regolare la posizione per avere l'apertura nel campo visivo. Dopo Resus, sospendere l'estratto di semi filtrato pipettando delicatamente su e giù due goccioline da 40 a 50 microlitri di estratto di semi in uno o due pozzetti. Lo screening di una o due gocce alla volta, impedisce l'evaporazione del campione, collocare 50 microlitri di tampone di isolamento fresco in un pozzetto di un vetrino diverso preparato come in precedenza.
Per fungere da prima goccia di lavaggio. Conservare questo vetrino in una camera umida coperta per evitare l'evaporazione. Se necessario, setacciare le goccioline di estratto di semi per gli embrioni allo stadio desiderato con l'obiettivo di ingrandimento 10x.
Confermare il tavolino con l'ingrandimento 20x. Gli embrioni di solito affondano sul fondo del vetrino. L'aspetto più importante di questa procedura è raccogliere gli embrioni con il minimo di detriti.
Ciò può essere ottenuto pulendo con un ago di tungsteno, controllando attentamente la goccia di lavaggio per potenziali detriti di trasporto e ripetendo la caduta se necessario. Rimuovere manualmente i detriti intorno all'embrione con un ago di tungsteno, un ago da insulina o un'attrezzatura simile. Spostare il capillare di vetro vicino all'embrione utilizzando il micromanipolatore e prelevare l'embrione con la minor quantità di soluzione possibile.
Raccogli diversi embrioni e rilasciali al primo lavaggio. Goccia. Per le applicazioni molecolari per le applicazioni citologiche, gli embrioni possono andare direttamente al tampone di destinazione. Ogni giro di raccolta deve essere conservato entro 5-10 minuti e gli embrioni devono essere raccolti in un volume minimo.
Ripetere lo screening e la raccolta fino a quando la quantità desiderata di embrioni non viene raccolta nella prima goccia di lavaggio. Se i detriti vengono trasportati nella goccia di lavaggio, rimuoverli con un ago prima di raccogliere tutti gli embrioni contemporaneamente dalla goccia. Rilasciare gli embrioni in una seconda goccia di lavaggio da 50 microlitri e ripetere il ricordo.
Infine, rilascia gli embrioni nel buffer di destinazione. Il trasferimento deve comportare solo un contatto e non l'immersione della punta capillare mostrata. Qui ci sono diversi embrioni nell'ultima goccia dopo i lavaggi.
Gli embrioni di piante isolati possono ora essere utilizzati per varie applicazioni a valle per controllare il CD NA embrionale. Librerie prima del sequenziamento. Sono stati mostrati in modo amplificato i trascritti specifici dell'embrione. Ecco i risultati dell'amplificazione PCR su CD NA. Librerie da due a quattro embrioni cellulari lavati una sola volta, e sul DNA genomico l'isolamento dell'embrione si è dimostrato molto utile nei saggi del gene reporter con bassa espressione embrionale e dove il rivestimento del seme materno confonde il rilevamento mostrato qui è un embrione che esprime un gene reporter GUS sotto il controllo del promotore Madea.
Infine, l'ibridazione fluorescente in C 2 è stata applicata per studiare l'architettura nucleare in embrioni isolati incorporati in cuscinetti di acrilammide su vetrini. Qui viene mostrato un esempio che utilizza sonde contro le ripetizioni del centromero e le regioni organizzative nucleari inferiori. Una volta padroneggiata, questa tecnica consente l'isolamento di 30 embrioni in meno di un'ora per le applicazioni citologiche e in meno di tre ore per le applicazioni molecolari, comprese tutte le fasi di lavaggio.
Infatti, questa tecnica permetterà alla comunità di ricerca vegetale di esplorare i meccanismi genetici ed epigenetici nell'embriogenesi.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per isolare in modo efficiente embrioni in fase iniziale da semi di Arabidopsis thaliana. La procedura consente di isolare fino a 40 embrioni in 1-4 ore, rendendola adatta a diverse applicazioni successive.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Sviluppo vegetale
- Isolamento dell'embrione
- Analisi genetica
Sfondo
- Comprendere lo sviluppo dell'embrione vegetale è fondamentale per gli studi genetici.
- Arabidopsis thaliana è un organismo modello nella biologia vegetale.
- Tecniche efficienti di isolamento degli embrioni potenziano le capacità di ricerca.
- Le applicazioni includono l'analisi del trascrittoma e dell'epigenoma.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo semplice per isolare embrioni vegetali giovani.
- Facilitare varie analisi, come l'estrazione di RNA e DNA.
- Supportare analisi citologiche, inclusi saggi con geni reporter.
Metodi Utilizzati
- Dissezione dei semi per accedere agli embrioni.
- Frantumazione dei semi in un buffer di isolamento.
- Microaspirazione per raccogliere gli embrioni al microscopio invertito.
- Lavaggio e trasferimento degli embrioni in un buffer di destinazione.
Risultati principali
- È possibile isolare fino a 40 embrioni in modo efficiente.
- Il metodo è adattabile a diverse applicazioni successive.
- Gli embrioni possono essere utilizzati per l'estrazione di RNA o DNA.
- Adatto ad analisi citologiche come l'immunomarcatura.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato è efficiente e diretto.
- Migliora la capacità di studiare lo sviluppo vegetale nella fase embrionale.
- Fornisce una base per ulteriori ricerche genetiche ed epigenetiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di embrioni vegetali in stadio precoce permette un'analisi precisa dei meccanismi genetici ed epigenetici durante l'embriogenesi, sostenendo la validazione degli obiettivi nella scoperta di biotecnologie basate sulle piante. Questo metodo fornisce una fonte scalabile e riproducibile di embrioni specifici per stadio, destinati ad analisi molecolari e citologiche, riducendo le barriere tecniche nei processi di de-risking degli obiettivi. Supporta una maggiore affidabilità predittiva nell'identificazione dei candidati principali facilitando dati omici e di imaging di alta qualità provenienti da finestre di sviluppo ben definite.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette la validazione funzionale di geni bersaglio nell'embrione isolando popolazioni purificate di embrioni a 2-4 cellule per analisi successive.
- Valore operativo: Consente di ottenere fino a 40 embrioni in 1-4 ore, favorendo schermature di media portata sui bersagli senza necessità di attrezzature specializzate.
- Valore predittivo: Fornisce materiale biologico risolto per stadio per analisi del trascrittoma e dell'epigenoma, migliorando la robustezza delle ipotesi sui bersagli.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Gli embrioni isolati sono adatti per RT-PCR, RNA-seq, metilazione del DNA, FISH, immunostaining e saggi di geni reporter, consentendo schermate multi-omiche.
- Valore operativo: Utilizza tecniche a basso costo e trasferibili (pestello di plastica, capillare di vetro, microscopio invertito) per la standardizzazione dei saggi tra diversi laboratori.
- Scalabilità: Una configurazione semplice permette la replicazione tra gruppi di lavoro per un prelievo di embrioni costante nei processi di scoperta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Supporta la scoperta di biomarcatori consentendo il profilo epigenomico e trascrittomico di embrioni precoci.
- De-risking meccanicistico: Facilita l'analisi citologica (ad esempio, FISH, saggi con reporter) per convalidare i modelli di espressione genica nel contesto embriogenico nativo.
- Rilevanza del modello preclinico: Fornisce un sistema di sviluppo definito (Arabidopsis) per lo studio di meccanismi conservati di embriogenesi rilevanti per le piattaforme di miglioramento delle colture.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, fornendo embrioni di stadio specifico per analisi omiche e di imaging che guidano la selezione dei bersagli e l'ottimizzazione dei composti promettenti prima della validazione preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo l'isolamento di embrioni a stadi di sviluppo precisi per analisi genetiche ed epigenetiche.
- Screening: Genera campioni standardizzati di embrioni adatti a saggi molecolari quantitativi (RNA-seq, metilazione) e a valutazioni citologiche.
- Analisi: Fornisce materiale embrionale ad alta purezza per misurazioni basate su trascrittoma, epigenoma e imaging, che guidano la priorizzazione degli obiettivi.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase iniziale della scoperta alla continuità preclinica fornendo informazioni meccanicistiche sulla regolazione dell'embriogenesi.
- Riutilizzo aziendale: Un protocollo a basso costo e con ridotta necessità di attrezzature ne permette un'ampia adozione tra gruppi di ricerca come capacità riutilizzabile.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica fornendo materiale embrionale purificato, privo di contaminazioni da testa e endosperma.
- Valore operativo: Una tecnica semplice e trasferibile garantisce riproducibilità e minimizza la variabilità nell'isolamento degli embrioni tra diversi utilizzatori.
- Valore strategico: Consente decisioni più rapide di tipo go/no-go nella validazione degli obiettivi accelerando l'accesso a dati embrionali specifici per stadio.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione degli obiettivi in base al rischio grazie a dati omici e fenotipici embrionali affidabili.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di base nelle tecniche di microscopia e nell'identificazione delle fasi embrionali mediante microscopia invertita a luce visibile.
- Necessita di attrezzature di laboratorio standard: pestello in plastica, provette Eppendorf, capillari di vetro, vetrini rivestiti con BSA e tampone di isolamento.
- Richiede una manipolazione costante dei semi e un'ottimizzazione della forza di schiacciamento per evitare danni agli embrioni o un'eccessiva formazione di detriti.
- Impone l'adattamento dei tempi di raccolta e dei passaggi di lavaggio in base all'applicazione successiva (molecolare rispetto a citologica).
- È limitato dalla fragilità degli embrioni e dall'adesione ai tessuti materni, richiedendo una manipolazione accurata per mantenere vitalità e purezza.
