Isolamento dei nativi microrganismi del suolo con un potenziale di Breaking Down biodegradabili di pacciamatura film plastici utilizzati in agricoltura

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare i funghi e i batteri del suolo che colonizzano e degradano i film di pacciamatura biodegradabili. Ciò si ottiene incubando prima film di pacciamatura biodegradabili in sacchi a rete nel terreno abbastanza a lungo da consentire una sostanziale colonizzazione da parte dei microbi nativi del suolo. Dopo l'incubazione, i pacciami vengono estratti e la diluizione viene placcata, il che produce singole colonie isolate di ciascun tipo coltivabile di microbo intimamente associato.

Quindi i microbi isolati vengono applicati su pacciamatura fresca, disinfestata e biodegradabile, nonché su piastre di agar con o senza fonte di carbonio. Per confrontare la crescita, i risultati vengono poi confermati in mezzo liquido. I risultati mostrano la colonizzazione e/o la degradazione da parte di alcuni isolati sulla base della microscopia elettronica a scansione e possono essere verificati mediante cromatografia a permeazione di gel.

Non dimenticare che lavorare con isolati fungini e batterici non identificati può essere pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura, come indossare guanti, sigillare provette e piatti di coltura e lavorare in un armadio di biosicurezza. Dopo aver incubato i pezzi di pacciame nel terreno e preparato i terreni e i reagenti secondo il protocollo di testo, tagliare i nuovi pezzi di pacciame in quadrati di 4,25 centimetri per decontaminare i pezzi di pacciame. Autoclavali se non li altera o li degrada per pezzi di pacciamatura non autoclavabili come quelli realizzati in plastica.

Dopo aver preparato una cappa di biosicurezza secondo il protocollo di testo, posizionare i pezzi di pacciamatura nella cappa decontaminata in file e incubare i pezzi di pacciamatura sotto la luce UV per due ore, utilizzando una pinza sterilizzata pulita e iniziando dalla prima fila e lavorando verso la parte posteriore per evitare di mettere mani e braccia sulle superfici appena decontaminate. Capovolgere i pezzi di pacciame, posizionando il lato disinfestato verso il basso su un'area pulita, esposta ai raggi UV, ma non precedentemente a contatto con il pacciame. Dopo due ore di trattamento UV su ciascun lato, di nuovo, lavorando dalla parte anteriore a quella posteriore.

Utilizzare una pinza sterile per rimuovere i pezzi di pacciame dall'armadio di biosicurezza e metterli in contenitori sterili e asciutti come i becher ricoperti di alluminio. Conservarli a temperatura ambiente al buio sotto una cappa di trasferimento sterile. Utilizzando una tecnica asettica, adagiare i pezzi di pacciamatura disinfestati dai raggi UV sulla superficie delle piastre di agar posizionando prima un angolo e delicatamente, lasciando che il resto del quadrato ruoti a contatto con l'agar.

Per le pellicole non permeabili all'acqua, posizionare quattro gocce da 10 microlitri di terreno semisolido fuso e minimo sopra gli angoli dei pezzi di pacciamatura per fornire una fonte di acqua e nutrienti per la colonizzazione iniziale delle plastiche idrofobiche. Non toccare la superficie dei pezzi di pacciamatura. Con la punta della pipetta, le gocce si induriscono in perline.

Incubare le piastre coperte in posizione verticale per una notte a temperatura ambiente per solidificare. Quindi conservare le piastre con l'agar rivolto verso l'alto al buio a quattro gradi Celsius. Tutti i materiali necessari per i biotest sono ora preparati e si è pronti per iniziare l'isolamento dei potenziali funghi che degradano il pacciame dai pezzi di pacciame che sono stati sepolti nel terreno.

Scava i sacchi a rete dal terreno e rimuovi i pezzi di pacciame dai sacchi a rete. Utilizzare una spatola sterile e una pinza per rimuovere delicatamente il terreno in eccesso dai pacciami senza disturbare il terreno che è attaccato alla superficie. Tagliare il film BDM in pezzi quadrati di un centimetro fino a recuperare 0,5 grammi di materiale.

Per ogni trasferimento di campione replicato, 0,5 grammi di pezzi di pacciamatura e terreno attaccato in 25 millilitri. Le provette di coltura contenenti 9,5 millilitri di PBS aggiungono 0,5 grammi di terreno alle provette di controllo del terreno o ai campioni in cui il pacciame è completamente degradato per rompere eventuali biofilm e staccare le cellule dai pezzi di pacciamatura. Agitare i tubi per 30 secondi ad alta velocità, quindi sonicarli a bagnomaria per 10 minuti e farli vorticare di nuovo.

Questo dovrebbe produrre una sospensione omogenea di cellule microbiche che sono state associate ai pezzi di pacciame. Per una diluizione seriale dei campioni. Preparare una provetta di coltura con 4,5 millilitri di PBS sterile e riempire tre pozzetti di una piastra a pozzetti profondi con 450 microlitri di PBS per campione dalle provette originali di sospensione.

Trasferire 0,5 millilitri nei 4,5 millilitri di PBS sterile per ottenere una terza diluizione da 5,0 volte 10 a negativa dopo aver agitato ad alta velocità per 30 secondi, aggiungere 50 microlitri a 450 microlitri di PBS nella miscela per piastre a 96 pozzetti pipettando delicatamente su e giù 10 volte, ripetere fino a completare diluizioni fino a 5,0 volte 10 verso i sei negativi. Utilizzare bacchette di vetro piegate sterilizzate a fiamma per distribuire uniformemente 100 microlitri da ciascuna delle diluizioni sulla superficie dell'agar delle piastre PDA che contengono cloramfenicolo per inibire la crescita batterica. Conservare le piastre in posizione verticale per 30 minuti per lasciare che il liquido si impregni.

Quindi sigillare le piastre con paraform per evitare la fuoriuscita di spore da isolati non identificati. Incubare le piastre capovolte a 20 gradi Celsius al buio per cinque giorni per consentire ai funghi a crescita rapida e lenta di formare colonie in una cabina di biosicurezza. Esaminare le piastre di diluizione per singole colonie isolate utilizzando un singolo stuzzicadenti sterile.

Toccare delicatamente una colonia e poi toccare l'agar di terreno minimo fungino, terreno minimo fungino più piastre di plastica e mezzo minimo di glucosio in questo ordine per inoculare le perle di agar sopra i film di plastica. Strofina delicatamente lo stuzzicadenti sulla superficie del punto di agar e poi passalo sulla pellicola di plastica. Ripetere l'inoculazione dalla stessa colonia di origine fino a quando non ce ne sono quattro.

Replicare le striature su ciascuna piastra dopo aver incubato le piastre a 20 gradi Celsius al buio per cinque giorni. Confronta le piastre per identificare gli isolati che crescono su pezzi di pacciamatura meglio di quanto crescano su un terreno minimo che non contenga carbonio aggiunto a parte l'agar. Questi sono potenziali degradatori del pacciame.

La piastra GMM dovrebbe contenere la maggior parte della crescita poiché è una piastra di controllo positivo in cui il terreno contiene glucosio. Gli isolati del terreno potrebbero non essere del tutto puri a questo punto, quindi usa uno stuzzicadenti sterile per raschiare l'inoculo dal fungo, colonizzando il pacciame e striscialo per l'isolamento sull'agar destrosio di patata, quindi sigilla la piastra e incuba per cinque giorni. Dopo i cinque giorni di incubazione, saranno sorte singole colonie isolate.

Confermare che queste nuove colonie purificate mostrino una colonizzazione del pacciame nel biotest su piastra simile a quella osservata con gli isolati potenzialmente impuri originali. Una volta che i potenziali degradatori del pacciame sono stati identificati dal biotest su piastra, verificare utilizzando un biotest liquido in questo saggio di conferma finale, manca anche l'agar sotto il pacciame. I pezzi sono veramente l'unica fonte di carbonio per la crescita microbica in questo terreno rigorosamente preparato per iniziare il saggio in un pezzo di pacciame disinfestato in superficie in un mezzo fungino privo di qualsiasi altro carbonio aggiunto per ogni replica di un isolato microbico.

Preparare tre provette per l'inoculazione. Uno, un tubo sperimentale con cinque millilitri di mezzo minimo qui etichettato FMM contenente un pezzo di pacciamatura della dimensione predeterminata. Due, un controllo negativo con cinque millilitri di terreno minimo senza fonte di carbonio.

E tre, un controllo positivo con cinque millilitri di liquido contenente glucosio. Qui etichettato GMM. Inoltre, preparare una provetta replicata di terreno minimo contenente ogni pacciame da testare, ma non inocularlo.

Questa provetta di controllo rivelerà qualsiasi crescita microbica derivante dalla contaminazione dopo la crescita e la raccolta di spore fresche. Secondo il protocollo di testo, in una cappa di trasferimento sterile inoculare le provette di coltura precedentemente preparate con un milione di spore o cellule di lievito, sigillare i tappi e incubare al buio senza agitare a 20 gradi Celsius. Osservare i campioni settimanalmente per la crescita.

crescita miceliale di funghi su pezzi di pacciame può essere visibile entro la prima settimana dopo l'inoculazione, specialmente ai bordi dei pezzi di pacciamatura per il lievito planctonico monitorare la crescita mediante letture di densità ottica a 600 nanometri perché è probabile che i funghi filamentosi si attacchino direttamente ai pezzi di pacciame. Valutare la crescita a occhio e confermare con microscopia ottica e/o microscopia elettronica a scansione in soli controlli con terreno minimo. Cerca minuscole flessione bianca troppo piccola per registrare un cambiamento nella densità ottica.

Utilizzo di metodi spettrofotometrici. Utilizzare una pipetta paster per aspirare la flessione e osservarla utilizzando l'interferenza differenziale. Microscopia a contrasto dopo aver isolato tre potenziali isolati degradanti del pacciame nel biotest su piastra sia da un pacciame cellulosico chiamato weed guard plus che era il nostro controllo positivo che da un pacciame di plastica a base di amido chiamato Biore.

Sono stati incubati nel bioassay liquido per 68 giorni e raccolti prima di sottoporli a microscopia elettronica a scansione. Come previsto. L'ifia fungina è stata osservata su tutti i campioni, ad eccezione di XX e YY, dove sono state osservate cellule a forma di bastoncino per gli isolati sul nostro pacciame di controllo della cellulosa.

Non è stata osservata alcuna crescita nell'FMM, solo i controlli, come mostrato qui nei controlli inoculati dalle Nazioni Unite, per la protezione dalle infestanti e gli elementi residui della trachea delle fibre di origine vegetale, erano rilevabili solo come lievi segni di butteratura osservati nelle file su alcune delle fibre, sebbene l'ifia fungina sia stata osservata in tutti e tre i campioni inoculati del nostro pacciame di controllo della cellulosa. Gli elementi trachey erano chiaramente visibili solo nei campioni SS, suggerendo che la digestione del materiale cellulosico ha rivelato gli elementi tracheali lignificati sotto l'isolato SS è stato identificato provvisoriamente utilizzando 18 s ribosomiale, DNA come soda mye all'interno dell'ordine bibite per il pacciame di plastica a base di amido. Isolati non è stata osservata alcuna crescita significativa nel terreno minimo, solo i controlli hanno evidenziato singole specifiche bianche visibili al roteamento nelle provette di coltura degli isolati, VV e ZZ sono stati osservati utilizzando la microscopia a contrasto interferenziale differenziale per l'isolato vv.

La specifica era una massa di spore, presumibilmente residua dall'inoculazione iniziale. Per isolare zz. La massa era composta da maglie sciolte di ifi, di circa 0,2 millimetri di diametro, suggerendo che l'inoculo di spore originale era germogliato ma non era cresciuto oltre la massa qui raffigurata.

Come si vede qui nei controlli inoculati dalle Nazioni Unite per il pacciame di plastica a base di amido, si osserva una consistenza irregolare. L'identità dei lineamenti bianchi è sconosciuta, ma sono assenti in un film colonizzato da VV isolato mostrato qui. Sia le particelle bianche che le protuberanze sono sparite in un film colonizzato dall'isolato zz.

Inoltre, quest'ultimo campione ha mostrato la presenza uniforme di fessure attraverso gli isolati di superficie BDM. VV e ZZ sono stati identificati utilizzando il DNA ribosomiale come Penicillium e ACE rispettivamente nell'ordine dell'ipo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biodegradazione dei pacciami di plastica per l'industria agricola, può essere applicato anche a qualsiasi altra plastica la cui biodegradazione nell'ambiente è in discussione.

Ad esempio, la plastica che potrebbe finire nell'ambiente marino. Sono quelli utilizzati per l'industria alimentare? Io.