Name: Un metodo per lisolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Impara a isolare le isole di Langerhans del topo per misurare i livelli di cAMP intracellulare. Questo metodo consente di valutare la funzione delle cellule β e studiare la fisiologia pancreatica nella ricerca sul diabete.

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Vorremmo ringraziare Renee L. Pasker e Harpreet K. Brar per l&#39;assistenza tecnica di esperti sui protocolli descritti in questo lavoro. Inoltre, vorremmo riconoscere il mentoring di Christopher B. Newgard alla Duke University e Alan D. Attie presso l&#39;Università del Wisconsin-Madison, con il supporto dei loro membri di laboratorio, che ci ha permesso il tempo e il supporto necessario per ottimizzare l&#39; protocolli descritti. In particolare, ringraziamo Hans HOHMEIER, Danhong Lu, e Helena Winfield nel Laboratorio Newgard e Maria Rabaglia nel Laboratorio Attie per le discussioni produttive e consigli. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH DK080845 sovvenzione e Juvenile Diabetes 594 Research Foundation concessione 17-2011-608 (a MEK)

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Con la prevalenza di diabete proiettate a pregiudicare il 7,7% della popolazione mondiale, l&#39;esigenza di nuove tecniche di ricerca è fondamentale sia per capire e curare il diabete 18. L&#39;attuale isolamento delle isole è un protocollo ben consolidata utilizzati per la sperimentazione in vitro ed è stato presentato in precedenza con lievi modifiche 11,14,16. Anche se la secrezione di insulina è un&#39;applicazione a valle comune di isole isolate, concentrandosi su componenti a monte,...

La rigorosa manutenzione di euglicemia è indispensabile per evitare morbosità come la neuropatia, nefropatia e retinopatia, che sono tutte caratteristiche della patologia di incontrollata di tipo 1 e 2 il diabete 1. Funzione β-cellulare ridotto e di massa sia di tipo 1 e diabete 2 perturbano le concentrazioni di glucosio nel sangue 2. Considerando che tipo immuno-mediata 1 diabete risultati da una perdita devastante di β-cellule che producono insulina, alterata secrezione di insulina β-cellulare e la segnalazione periferica all&#39;insulina nel diabete di tipo 2 insieme promuovono iperglicemia, dislipidemia, e aumento della produzione epatica di glucosio, che alla fine si traduce in sia la perdita della massa β-cellulare e la secrezione di insulina capacità da singoli β-cellule 3. La comprensione dei meccanismi alla base β-cellule nella progressione di tipo 1 e diabete 2 si spera, darà luogo a nuove terapie per prevenire e curare queste malattie. In vitro timodelli di coltura SSUE, come l&#39;INS-1 e MIN6 immortalati linee di β-cellule, possono essere strumenti utili per la comprensione delle funzioni β-cellulari specifici. Tuttavia, le interazioni tra i diversi tipi cellulari all&#39;interno isolotto si possono regolare la funzione β-cellulare. Ad esempio, l&#39;influenza paracrina di glucagone (rilasciato da α-cellule) e somatostatina (rilasciato da δ-cellule) in aumentando e diminuendo la secrezione di insulina, rispettivamente, dimostra l&#39;importanza della prossimità cella cella nella risposta endocrina 4. Inoltre, giunzioni gap tra β-cellule potenziano il rilascio di insulina 5. Inoltre, sebbene progressi sono stati fatti nel generare linee insulinoma che meglio replicato la risposta fisiologica di isole isolate al glucosio (ad esempio, l&#39;INS-1-derivato 832/13 e 832/3 linee cellulari), la rispondenza glucosio differenti rispetto ratto normale isolotti 6,7. Inoltre, la risposta di queste linee cellulari clonali insulinomaal peptide-1 (GLP-1) agonisti glucagone-simile possono differire notevolmente l&#39;uno dall&#39;altro, così come da isolotti normali 6. Pertanto, le linee cellulari immortalizzate non possono rappresentare il modello migliore per saggiare gli agenti che hanno un impatto sulla produzione di cAMP. In contrasto con le linee cellulari derivate insulinoma, studiando funzione β-cellula esclusivamente in modelli animali interi offre una propria serie di complicazioni. Una delle maggiori sfide nel lavoro con tessuto endocrino sta misurando la concentrazione precisa di ormone rilasciato. In particolare, il fegato gioca un ruolo importante metabolizzare insulina, e il pancreas flusso sanguigno va direttamente al fegato. Così, una misura insulinemia non può ritrarre con precisione le quantità di insulina essere secreti dal pancreas stesso o l&#39;impatto di trattamenti diversi sul tasso di secrezione insulinica 8. Inoltre, il metabolismo renale di glucagone può limitare l&#39;affidabilità di uscita glucagone dall&#39;Islet α-cellule 9. Pertanto, isolando isole primari di topo per la sperimentazione in vitro fornisce una comprensione più precisa di come l&#39;isolotto sta rispondendo a stimoli specifici per integrare le misurazioni effettuate in vivo. Il presente protocollo per l&#39;isolamento di isole di topo è un protocollo ben consolidata utilizzato da un certo numero di gruppi (con lievi modifiche che possono contribuire ad aumentare il successo) 10,11. Inoltre, la determinazione della produzione di cAMP consente una lettura diretta della reattività incretin delle β-cellule. In combinazione con la misurazione cAMP, contenuto proteico e la secrezione di insulina possono anche essere quantificato dal medesimo preparazione del campione cAMP, contribuendo a determinare se un difetto nella funzione β-cellula si trova prossimale o distale di cAMP 10. Il contenuto di cAMP e l&#39;applicazione finale secrezione insulinica in questo protocollo può essere uno strumento molto potente per comprendere l&#39;influenza delle componenti farmaceutici, alimentari, tra l&#39;altros, in cAMP e la secrezione di insulina. Oltre alla stimolazione da solo glucosio, altri composti possono essere utilizzati per misurare le variazioni di cAMP e secrezione insulinica 10,11. Infine, anche se l&#39;insulina è il principale ormone che saggio da isole isolate, altri ormoni, quali il glucagone e la somatostatina, così come le citochine, eicosanoidi e adenosina monofosfato ciclico, può anche essere misurata, mediante un saggio stimolazione transiente o quantificazione di ai livelli del terreno di coltura 12. Infine, anche se al di fuori del campo di applicazione di questo manoscritto, isolamento delle isole con il metodo di isolamento collagenasi descritto consente per la conservazione isolotto in modo che molte altre applicazioni a valle possono essere perseguiti, come il trapianto di isole, l&#39;isolamento di RNA per quantitativa in tempo reale PCR o microarray analisi, proteine isolamento per Western blotting, isolotto incorporamento e di imaging immunofluorescenza, e l&#39;incorporazione di [3H]-timidina come misura di replicazione delle cellule insularizione, alcuni dei quali sono stati descritti in precedenti articoli JoVE 13-16. Nel complesso, seguendo la procedura di isolamento delle isole descritta nel protocollo può fornire un ricercatore con informazioni importanti e utili per lo sviluppo di terapie e promuovere la scoperta di farmaci volti a migliorare la funzione β-cellulare.

<table><tbody><tr><td>Collagenasi da Clostridium histolyticum adatto per isolare isole attive</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Soluzione salina bilanciata 10X</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 (polvere)</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7888</td><td></td></tr><tr><td>3/0 Filo di sutura di seta</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td> per la <td>scienza fine</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>0,8 mm Pincipe&nbsp; &nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici curve</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; Forbici a molla bingen - Dritte/affilate/8,5 cm/5 mm Tagliente</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Siringa BD Luer-Lok da 5 ml</td><td>BD</td><td>309646</td> Siringa BD da 1 ml BD 309628 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 G Ago BD 1/2" Lunghezza</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>27 G Ago BD 1/2" Lunghezza</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Pietra per affilare</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2-tribromoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-metil-2-butanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240486-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monopotassico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaCHO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&#183; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&#183; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino inattivato termicamente (HI FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30088.03HI</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5879-100MG</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare camp determinazione

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

La glicemia incontrollata è una caratteristica del diabete mellito e promuove patologie come la neuropatia, nefropatia e retinopatia. Con la crescente prevalenza del diabete, sia immuno-mediata di tipo 1 e obesità legati tipo 2, gli studi volti a delineare fisiopatologia del diabete e dei meccanismi terapeutici sono di importanza critica. I β-cellule delle isole pancreatiche di Langerhans sono responsabili opportunamente secrezione di insulina in risposta a concentrazioni di glucosio nel sangue. Oltre al glucosio e altri nutrienti, i β-cellule sono stimolate dagli ormoni specifici, incretins, che sono secreti dall&#39;intestino in risposta ai pasti e agire sui recettori β-cellule che aumentano la produzione intracellulare di adenosina monofosfato ciclico (definito cAMP). Diminuzione della funzione β-cellulare, massa, e la reattività incretine sono ben compresi, per contribuire alla fisiopatologia del diabete di tipo 2, e sono anche sempre più collegate with diabete di tipo 1. L&#39;attuale topo isolamento delle isole e il protocollo determinazione cAMP possono essere uno strumento per aiutare a delineare i meccanismi che promuovono la progressione della malattia e gli interventi terapeutici, in particolare quelli che sono mediate dai recettori incretine o recettori che agiscono attraverso la modulazione della produzione di cAMP intracellulare legato. Mentre saranno descritte soltanto misurazioni cAMP, il protocollo di isolamento isolotto descritto crea un preparato pulito che consente anche per molte altre applicazioni a valle, come il glucosio stimolata la secrezione di insulina, [3 H]-timidina, proteine ​​abbondanza, e l&#39;espressione di mRNA.

Per garantire un alto rendimento isolotto durante l&#39;isolamento, tecniche chirurgiche descritte nel protocollo devono essere seguiti attentamente. Sebbene le tecniche qui presentate saranno su misura per ogni laboratorio, ci sono alcuni passaggi critici che porterà ad un isolamento di successo. Al fine di rendere il dotto biliare comune facilmente accessibile, si raccomanda che gli organi spostati a destra del mouse (Figura 1). Inoltre, questo permetterà il pancreas a gonfiare con una quantità inferi...

Saggio funzione in vitro β-cellulare utilizzando isolate del mouse isole di Langerhans è una componente importante nello studio della fisiopatologia del diabete e terapeutica. Mentre molte applicazioni a valle sono disponibili, questo protocollo descrive specificamente la misurazione di intracellulare adenosina monofosfato ciclico (cAMP) come parametro essenziale determinare la funzione β-cellulare.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare gli isolotti sani per misurare le differenze nella produzione di AMP ciclico in risposta a diversi trattamenti sperimentali. Questo viene ottenuto innanzitutto gonfiando e poi rimuovendo il pancreas nel secondo passaggio. Gli isolotti sani vengono isolati mediante una serie di centrifugazioni e lavaggi.Successivamente, gli anellini vitali vengono trasferiti in un mezzo di coltura per isolotti fresco e lasciati incubare tutta la notte. Nell'ultima fase, gli anellini vengono esposti ai trattamenti sperimentali desiderati e viene eseguito un saggio di AMP ciclico. Infine, un saggio immunoenzimatico viene utilizzato per misurare le variazioni nella produzione di AMP ciclico in risposta ai diversi trattamenti applicati agli anellini.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà perché è necessaria molta pratica per ottenere un'adeguata distensione del pancreas. Prima di iniziare, pre-caricare una siringa e una cannula con cinque millilitri di soluzione di collaghenasi. Applicare un ago smussato da 30 gauge sulla cannula e posizionare la siringa con la cannula sul ghiaccio.Dopo aver spostato l'intest

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Biologia

Il protocollo seguente delinea il processo di dissezione del pancreas per l'imaging fetta virtuale, e la successiva quantificazione di tutte le GFP-tagged beta-cellule del pancreas intero.

Quantificazione in situ di cellule beta pancreatiche Messa in topi

Una descrizione dettagliata di isolamento del mouse isolotto è descritta utilizzando la tecnica di incannulazione in situ duttale pancreatico e perfusione di una combinazione di purificato collagenasi e proteasi neutra.

Mouse Isolotto di Langerhans isolamento utilizzando una combinazione di Collagenasi depurato e proteasi neutra

Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che producono ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Questo protocollo spiega un metodo per isolare le isole pancreatiche mediante prima perfusione di collagenasi tramite l'ampolla di Vater per digerire il tessuto pancreatico esocrino e una centrifugazione semplificata in gradiente di densità per purificare le isole dai topi.

Isolamento delle isole pancreatiche attraverso la perfusione di collagenasi: un metodo enzimatico per isolare le cellule delle isole pancreatiche

Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Qui presentiamo un protocollo per isolare le cellule delle isole pancreatiche del mouse per lo screening di induzioni ROS dai xenobiotici al fine di identificare i potenziali prodotti chimici xenobiotici diabetogeni.

Uno Screening basati su cellule dell'isolotto pancreatico murino per prodotti chimici ambientali diabetogeni

Descriviamo un metodo per l'isolamento di cellule endocrine da pancreas embrionale, neonatale e postnatale, seguite dal sequenziamento di RNA di cella singola. Questo metodo consente analisi dello sviluppo del pancreas endocrino lignaggio, eterogeneità e trascrittomica dinamiche di cella.

Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging e la quantificazione della dinamica del calcio in popolazioni cellulari eterogenee, come le cellule delle isolotiche pancreatiche. I reporter fluorescenti vengono consegnati nello strato periferico delle cellule all'interno dell'isolotto, che viene poi immobilizzato e immagine, e viene eseguita l'analisi per cellula della dinamica dell'intensità della fluorescenza.

Imaging calcio Dynamics in sottopopolazioni di cellule di islet pancreatica del topo

Questo protocollo descrive l'isolamento di cellule endoteliali di topo dall'intero pancreas.

Isolamento delle cellule endoteliali pancreatiche di topo

Questo studio utilizza marcatori di morte cellulare e apoptosi basati sulla fluorescenza multi-colorazione combinati con la microscopia confocale per valutare l'apoptosi indotta da citochine e la morte specifica delle cellule β nelle isole pancreatiche. Rivela cambiamenti spaziali e temporali nella morte cellulare e nell'apoptosi in risposta a stimoli extracellulari.

Trattamento isolato delle isole pancreatiche e misurazione dell'apoptosi

Questo studio ha sviluppato un metodo semplificato per estrarre in modo efficiente isolotti primari funzionali e cellule acinar dal pancreas del topo, offrendo uno strumento prezioso per studiare la comunicazione intercellulare nella patogenesi del diabete indotto da pancreatite acuta.

Un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari e delle cellule acinari pancreatiche primarie da topi

Impara a isolare le isole di Langerhans del topo per misurare i livelli di cAMP intracellulare. Questo metodo consente di valutare la funzione delle cellule β e studiare la fisiologia pancreatica nella ricerca sul diabete.

Un metodo per l'isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

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