Un metodo per l'isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare gli isolotti sani per misurare le differenze nella produzione di AMP ciclico in risposta a diversi trattamenti sperimentali. Questo viene ottenuto innanzitutto gonfiando e poi rimuovendo il pancreas nel secondo passaggio. Gli isolotti sani vengono isolati mediante una serie di centrifugazioni e lavaggi.

Successivamente, gli anellini vitali vengono trasferiti in un mezzo di coltura per isolotti fresco e lasciati incubare tutta la notte. Nell'ultima fase, gli anellini vengono esposti ai trattamenti sperimentali desiderati e viene eseguito un saggio di AMP ciclico. Infine, un saggio immunoenzimatico viene utilizzato per misurare le variazioni nella produzione di AMP ciclico in risposta ai diversi trattamenti applicati agli anellini.

Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà perché è necessaria molta pratica per ottenere un'adeguata distensione del pancreas. Prima di iniziare, pre-caricare una siringa e una cannula con cinque millilitri di soluzione di collaghenasi. Applicare un ago smussato da 30 gauge sulla cannula e posizionare la siringa con la cannula sul ghiaccio.

Dopo aver spostato l'intestino tenue sul lato destro del topo, individuare lo sfintere di Oddi, situato all'estremità del dotto biliare comune e che si espande sull'intestino tenue formando un triangolo bianco. Una volta localizzato lo sfintere, prendere un paio di pinzette Dumont numero cinque e far scivolare la punta al di sotto del dotto biliare comune il più vicino possibile all'intestino tenue, avendo cura di non perforare il dotto.

Dopo aver perforato l'intestino tenue e il tessuto connettivo, utilizzare la punta della pinzetta di Dumont per afferrare il filo di sutura e tirarlo sotto il dotto biliare comune. Legare il dotto biliare comune il più vicino possibile allo sfintere di Oddi, assicurandosi che il nodo sia ben stretto per prevenire perdite. Successivamente, afferrare entrambe le estremità del filo di sutura e tirarle verso la coda per applicare una certa tensione sul dotto biliare comune.

Quindi, utilizzando una mano libera, effettuare una piccola incisione con un paio di forbici microchirurgiche nel dotto biliare comune appena al di sopra dell'ultima biforcazione nel fegato, tenendo i due capi del filo in modo da mantenere teso il dotto biliare comune. Rimuovere la siringa e la cannula dal secchio del ghiaccio. Appoggiare la siringa e inserire l'ago ottuso preparato da 30 gauge nell'incisione.

Condotto biliare comune. Fare attenzione a non perforare la parete del dotto. Ottenere un'espansione completa del pancreas è la parte più delicata.

Utilizziamo un ago che garantisce una buona tenuta. Se il primo ago non garantisce una buona tenuta, utilizzarne uno più grande, ad esempio un ago da 27 gauge. Ora premere lentamente lo stantuffo della siringa, rilasciando la pressione in modo pulsatile fino a quando la prima parte del pancreas si gonfia.

Proseguire applicando una pressione costante e delicata finché il pancreas non si gonfia più. Un gonfiamento riuscito mostrerà una distribuzione uniforme del tessuto esocrino e la parte del pancreas situata sopra lo stomaco risulterà gonfia. Per rimuovere il pancreas, utilizzare una pinza con una mano per afferrare l'intestino tenue allo sfintere di od.

Con l'altra mano, inserire la punta chiusa di un paio di forbici curve per staccare una parte del pancreas dall'intestino tenue. Spostare la punta lungo l'intestino tenue fino al tessuto connettivo rosa. Successivamente, afferrare l'intestino tenue in prossimità del punto di attacco allo stomaco e recidere il pancreas dal resto dell'intestino tenue.

Prelevare la maggior quantità possibile di pancreas e sollevarlo delicatamente. Con le forbici curve, recidere i rimanenti collegamenti tra il pancreas e la cavità toracica.

Per rimuovere completamente il pancreas, conservare ogni pancreas rimosso in circa 2,5 millilitri di soluzione di collaghenasi. Utilizzare un singolo tubo conico da 50 millilitri su ghiaccio per lavare i pancreas. Trasferire innanzitutto ogni pancreas in un nuovo tubo conico da 50 millilitri contenente 25 millilitri di collaghenasi.

Quindi posizionare il pancreas in provette coniche da 50 millilitri, in posizione verticale, in un bagno d'acqua agitato a 37 gradi Celsius, in grado di oscillare tra 220 e 250 giri al minuto, con l'agitatore spento. A questo punto, gassare ciascuna provetta conica da 50 millilitri con una miscela di 95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica per cinque minuti.

Con una pipetta da pascolo, richiudere ermeticamente ogni tubo e posizionarli orizzontalmente nel bagnomaria agitato, sotto la superficie dell'acqua. A partire dal sesto minuto, agitare i tubi a 220-250 giri al minuto per 20 secondi ogni due minuti, per un massimo di 16 minuti. Dopo l'agitazione, centrifugare immediatamente i tubi a 400-500 G a temperatura ambiente, spegnendo subito la centrifuga non appena ha raggiunto la velocità massima.

Successivamente, senza disturbare il pellet, utilizzare un trappola a vuoto per aspirare circa 22,5 millilitri della soluzione di collaghenasi da ogni provetta. Quindi risospendere i pellet in 12,5 millilitri di HBSS e vorticare delicatamente le provette per disperdere i pellet. Dopo aver lavato e vorticosato le cellule con ulteriore HBSS, versare ciascuna sospensione cellulare attraverso un filtro da 1000 micron in nuove provette coniche singole da 50 millilitri.

Quindi, dopo aver centrifugato nuovamente le sospensioni cellulari, utilizzare un trappola a vuoto per aspirare con attenzione tutto l'HBSS senza disturbare il pellet. Una volta rimosso tutto l'HBSS, aggiungere 4,8 millilitri di soluzione 25%F call in ogni provetta. Dopo aver agitato con un vortex per disperdere il pellet, distribuire con attenzione 2,4 millilitri di soluzione 23%20.5%e 11%fial lungo la parete della provetta ruotando la provetta conica da 50 millilitri.

Per garantire un'omogenea stratificazione dopo la centrifugazione della soluzione di FI call, versare tutta la FI call in un nuovo tubo conico da 50 millilitri, avendo cura di lasciare indietro il pellet di tessuto esocrino. Aggiungere HBSS freddo di ghiaccio nel nuovo tubo fino al segno dei 50 millilitri. Quindi chiudere con il tappo e capovolgere il tubo da quattro a sei volte.

Per mescolare la soluzione FI e l'HBSS. Utilizzare il trappola a vuoto per aspirare con attenzione la maggior parte della miscela di HBSS senza disturbare il pellet lento. Quindi trasferire il pellet in un nuovo tubo.

Utilizzare una pipetta da pastore per trasferire gli anellini in una piastra di Petri contenente il mezzo di coltura per anellini, avendo cura di evitare il trasferimento di detriti di tessuto retinico. Posizionare la piastra di Petri su un microscopio stereoscopico dotato di retroilluminazione.

I borini sani avranno forma sferica e un centro che varia dal marrone dorato al marrone scuro. Tutti i borini collegati ad ASIN o tessuto, che appariranno opachi e grigi, non devono essere utilizzati e devono essere scartati. Inoltre, i borini più grandi che sviluppano un centro necrotico scuro dopo un'incubazione notturna devono essere scartati poiché non funzionano correttamente.

Se la preparazione degli anellini contiene una grande quantità di detriti, selezionare manualmente gli anellini due volte in mezzo fresco e aggiungere DNA al buffer di digestione per aiutare a limitare l'aggregazione degli anellini. Iniziare questo passaggio facendo ruotare gli anellini al centro della piastra di Petri. Utilizzando una pipetta P20, trasferire gli anellini in una nuova piastra di Petri in polistirene di 15 millimetri per 60 millimetri contenente cinque millilitri della soluzione di pre-incubazione, per lavare dagli anellini il mezzo di coltura contenente glucosio.

Quindi utilizzare la pipetta P 20 per trasferire almeno 13 anelli in singole provette microcentrifuga contenenti un millilitro di soluzione tampone di Krebs-Ringer bicarbonato appena gassata, mantenendo una dimensione uniforme degli anelli tra le provette. Dopo l'incubazione dei campioni a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per 45 minuti, vortexare rapidamente e centrifugare le provette in una centrifuga da banco a temperatura ambiente fino a 7.000-7.500 G. Se si desidera un'applicazione a valle con insulina o un altro metabolita, utilizzare una pipetta P 1000 per prelevare un'aliquote di mezzo in una provetta microcentrifuga. Se il mezzo di stimolazione non viene raccolto, può essere scartato.

Utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere la maggior parte del Krebs in ogni provetta microcentrifuga, lasciando circa da 10 a 15 microlitri di Krebs sul pellet dell'occhiello. Successivamente, utilizzare una pipetta P20 per rimuovere la porzione più vicina al pellet. Infine, quando rimangono meno di da 10 a 15 microlitri di Krebs sull'occhiello, congelare rapidamente i pellet degli occhielli in azoto liquido.

Quindi conservare i pellet congelati rapidamente a meno 80 gradi Celsius fino alla misurazione dell'AMP ciclico. Tipicamente, l'effetto di un agente sulla produzione di AMP ciclico è direttamente correlato al suo effetto sulla secrezione di insulina. In questo esperimento, isole isolate da topi wildtype o knockout per il gene sono state stimolate con glucosio 11,1 millimolare e AMP ciclico intracellulare.

La produzione di AMP ciclico è stata misurata e normalizzata rispetto alla proteina cellulare totale. L'insulina secreta è stata misurata mediante un saggio standard per l'insulina, ELISA, e anch'essa normalizzata rispetto alla proteina cellulare totale. Come previsto, la variazione nella produzione di AMP ciclico ha mostrato una correlazione diretta con l'aumento della secrezione di insulina stimolata dal glucosio Petrol.

Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe essere in grado di isolare, coltivare e misurare i livelli di AMP ciclico e di GMP ciclico negli occhi sani di topo.