Introduzione allo spettrofotometro
Lo spettrofotometro è uno strumento abitualmente utilizzato nella ricerca scientifica. La spettrofotometria è la misura quantitativa di quanto una sos…
Lo spettrofotometro è uno strumento utilizzato ovunque nella ricerca biologica, chimica, clinica e ambientale.
La spettrofotometria è la misura quantitativa di quanto una sostanza chimica assorbe la luce facendo passare un fascio di luce attraverso il campione utilizzando uno spettrofotometro.
Misurando l'intensità della luce rilevata, questo metodo può essere utilizzato per determinare la concentrazione di soluto nel campione.
Il fascio di luce che viene irradiato verso il campione è costituito da un flusso di fotoni.
Quando i fotoni incontrano molecole nel campione, le molecole possono assorbirne alcune, riducendo il numero di fotoni nel fascio di luce e diminuendo l'intensità del segnale rilevato.
La trasmittanza è la frazione di luce che passa attraverso il campione ed è definita come l'intensità della luce che passa attraverso il campione rispetto all'intensità della luce incidente. L'assorbanza è il logaritmo inverso della trasmittanza ed è la quantità che lo spettrofotometro misurerà.
Dall'assorbanza, la concentrazione della soluzione campione può essere determinata dalla legge di Beer-Lambert, che afferma che esiste una relazione lineare tra l'assorbanza e la concentrazione di un campione. Secondo la legge di Beer-Lambert, l'assorbanza è il prodotto del coefficiente di estinzione, una misura di quanto fortemente un soluto assorbe la luce a una data lunghezza d'onda, la lunghezza che la luce passa attraverso il campione, o lunghezza del percorso, e la concentrazione di soluto. Spesso, l'obiettivo di effettuare misurazioni di assorbanza è misurare la concentrazione di un campione.
Ogni spettrofotometro include una sorgente luminosa, un collimatore, che è una lente o un dispositivo di messa a fuoco che trasmette un intenso fascio di luce dritto, un monocromatore per separare il fascio di luce nelle lunghezze d'onda componenti e un selettore di lunghezza d'onda, o fessura, per selezionare la lunghezza d'onda desiderata. Le lunghezze d'onda della luce utilizzate negli spettrofotometri discussi in questo video sono nella gamma ultravioletta e visibile. Lo spettrofotometro include anche una sorta di porta campioni, un rilevatore fotoelettrico, che rileva la quantità di fotoni che vengono assorbiti e uno schermo per visualizzare l'uscita del rilevatore.
Gli spettrofotometri più recenti sono direttamente accoppiati a un computer, dove i parametri dell'esperimento possono essere controllati e i risultati vengono visualizzati.
Quando si esegue la spettrofotometria, assicurarsi di prendere le precauzioni appropriate, come indossare i guanti, a seconda del tipo di soluzioni biologiche o chimiche con cui si sta lavorando.
Prima di misurare lo spettro visibile ai raggi UV di un campione, accendere la macchina e lasciare che le lampade e l'elettronica si riscaldino.
Preparare un bianco della stessa soluzione ma senza l'analita, avente lo stesso pH e una forza ionica simile; un passo necessario in quanto la cellula e il solvente possono disperdere un po 'di luce.
I tradizionali porta campioni dello spettrofotometro sono progettati per contenere cuvette di plastica e quarzo. Procedere alla pipetta della soluzione vuota nella cuvetta.
Dopo aver asciugato le impronte digitali e fuoriuscito l'esterno della cuvetta, inserire correttamente la cuvetta nel portasempi e chiudere la porta del compartimento della cuvetta.
Non dimenticare mai di chiudere la porta poiché le radiazioni UV emesse da uno spettrofotometro aperto possono danneggiare gli occhi e la pelle.
Impostare la lunghezza d'onda desiderata o l'intervallo di lunghezze d'onda da trasmettere al campione, che dipende dalla lunghezza d'onda ottimale della luce che l'analita assorbe. Quindi, azzerare lo strumento prendendo una lettura dello spazio vuoto, che sottrarrà lo sfondo dal buffer del campione.
A seconda del tipo di esperimento spettrofotometrico che si sta eseguendo, potrebbe essere necessario generare una curva standard prima della misurazione del campione, da cui è possibile determinare la concentrazione dell'analita campione.
Lasciare che il campione raggiunga la temperatura appropriata e mescolarlo delicatamente, in modo che le bolle non vengano introdotte. Il campione può essere aggiunto direttamente alla cuvetta, all'interno dello strumento, e una lettura presa.
Dopo aver eseguito la misurazione dell'assorbanza sul campione, procedere al calcolo appropriato per l'esperimento; ad esempio la determinazione della concentrazione o del tasso di attività enzimatica.
Lo spettrofotometro viene utilizzato quotidianamente in molti laboratori di ricerca biologica.
Un'applicazione comune dello spettrofotometro è la misurazione della densità cellulare. La misurazione della densità cellulare è utile per generare curve di crescita logaritmica per i batteri, da cui è possibile determinare il momento ottimale per l'induzione della proteina ricombinante.
Lo spettrofotometro può anche essere utilizzato per misurare le velocità di reazione chimica. In questo esempio, l'assorbanza viene utilizzata per monitorare una reazione enzimatica mediante la scomparsa di un intermedio di reazione a 452 nm nel tempo. La velocità di questo passaggio enzimatico può essere calcolata adattando i dati all'equazione appropriata.
Recentemente, l'introduzione di spettrofotometri a micro-volume ha eliminato la necessità di supporti per campioni. Tali spettrofotometri utilizzano la tensione superficiale per contenere il campione.
Gli spettrometri a microvolumo sono ottimali per misurare la qualità e la concentrazione di campioni costosi di volume limitato, come le biomolecole, comprese le proteine e gli acidi nucleici.
L'assorbanza di una proteina a 280 nm dipende dal contenuto di catene laterali aromatiche presenti in triptofano, tirosina e fenilalanina, nonché dall'esistenza di legami cisteina-cisteina disolfuro.
La concentrazione proteica può essere determinata dalla sua assorbanza a 280 nm e dal suo coefficiente di estinzione, che si basa sulla composizione aminoacidica.
Sia il DNA che l'RNA hanno un massimo di assorbanza a 260 nm da cui è possibile determinare la loro concentrazione. La purezza dell'acido nucleico può anche essere valutata dal rapporto tra letture di assorbanza a specifiche lunghezze d'onda.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE allo spettrofotometro.
In questo video abbiamo esaminato alcuni principi di base, tra cui i concetti di spettrofotometria e i componenti dello spettrofotometro. Abbiamo anche dimostrato passo dopo passo il funzionamento dello spettrofotometro e discusso il suo utilizzo nella ricerca biologica. Grazie per l'attenzione.
Lo spettrofotometro è uno strumento utilizzato ovunque nella ricerca biologica, chimica, clinica e ambientale.
La spettrofotometria è la misura quantitativa di quanto una sostanza chimica assorbe la luce facendo passare un fascio di luce attraverso il campione utilizzando uno spettrofotometro.
Misurando l'intensità della luce rilevata, questo metodo può essere utilizzato per determinare la concentrazione di soluto nel campione.
Il fascio di luce che viene irradiato verso il campione è costituito da un flusso di fotoni.
Quando i fotoni incontrano molecole nel campione, le molecole possono assorbirne alcune, riducendo il numero di fotoni nel fascio di luce e diminuendo l'intensità del segnale rilevato.
La trasmittanza è la frazione di luce che passa attraverso il campione ed è definita come l'intensità della luce che passa attraverso il campione rispetto all'intensità della luce incidente. L'assorbanza è il logaritmo inverso della trasmittanza ed è la quantità che lo spettrofotometro misurerà.
Dall'assorbanza, la concentrazione della soluzione campione può essere determinata dalla legge di Beer-Lambert, che afferma che esiste una relazione lineare tra l'assorbanza e la concentrazione di un campione. Secondo la legge di Beer-Lambert, l'assorbanza è il prodotto del coefficiente di estinzione, una misura di quanto fortemente un soluto assorbe la luce a una data lunghezza d'onda, la lunghezza che la luce passa attraverso il campione, o lunghezza del percorso, e la concentrazione di soluto. Spesso, l'obiettivo di effettuare misurazioni di assorbanza è misurare la concentrazione di un campione.
Ogni spettrofotometro include una sorgente luminosa, un collimatore, che è una lente o un dispositivo di messa a fuoco che trasmette un intenso fascio di luce dritto, un monocromatore per separare il fascio di luce nelle lunghezze d'onda componenti e un selettore di lunghezza d'onda, o fessura, per selezionare la lunghezza d'onda desiderata. Le lunghezze d'onda della luce utilizzate negli spettrofotometri discussi in questo video sono nella gamma ultravioletta e visibile. Lo spettrofotometro include anche una sorta di porta campioni, un rilevatore fotoelettrico, che rileva la quantità di fotoni che vengono assorbiti e uno schermo per visualizzare l'uscita del rilevatore.
Gli spettrofotometri più recenti sono direttamente accoppiati a un computer, dove i parametri dell'esperimento possono essere controllati e i risultati vengono visualizzati.
Quando si esegue la spettrofotometria, assicurarsi di prendere le precauzioni appropriate, come indossare i guanti, a seconda del tipo di soluzioni biologiche o chimiche con cui si sta lavorando.
Prima di misurare lo spettro visibile ai raggi UV di un campione, accendere la macchina e lasciare che le lampade e l'elettronica si riscaldino.
Preparare un bianco della stessa soluzione ma senza l'analita, avente lo stesso pH e una forza ionica simile; un passo necessario in quanto la cellula e il solvente possono disperdere un po 'di luce.
I tradizionali porta campioni dello spettrofotometro sono progettati per contenere cuvette di plastica e quarzo. Procedere alla pipetta della soluzione vuota nella cuvetta.
Dopo aver asciugato le impronte digitali e fuoriuscito l'esterno della cuvetta, inserire correttamente la cuvetta nel portasempi e chiudere la porta del compartimento della cuvetta.
Non dimenticare mai di chiudere la porta poiché le radiazioni UV emesse da uno spettrofotometro aperto possono danneggiare gli occhi e la pelle.
Impostare la lunghezza d'onda desiderata o l'intervallo di lunghezze d'onda da trasmettere al campione, che dipende dalla lunghezza d'onda ottimale della luce che l'analita assorbe. Quindi, azzerare lo strumento prendendo una lettura dello spazio vuoto, che sottrarrà lo sfondo dal buffer del campione.
A seconda del tipo di esperimento spettrofotometrico che si sta eseguendo, potrebbe essere necessario generare una curva standard prima della misurazione del campione, da cui è possibile determinare la concentrazione dell'analita campione.
Lasciare che il campione raggiunga la temperatura appropriata e mescolarlo delicatamente, in modo che le bolle non vengano introdotte. Il campione può essere aggiunto direttamente alla cuvetta, all'interno dello strumento, e una lettura presa.
Dopo aver eseguito la misurazione dell'assorbanza sul campione, procedere al calcolo appropriato per l'esperimento; ad esempio la determinazione della concentrazione o del tasso di attività enzimatica.
Lo spettrofotometro viene utilizzato quotidianamente in molti laboratori di ricerca biologica.
Un'applicazione comune dello spettrofotometro è la misurazione della densità cellulare. La misurazione della densità cellulare è utile per generare curve di crescita logaritmica per i batteri, da cui è possibile determinare il momento ottimale per l'induzione della proteina ricombinante.
Lo spettrofotometro può anche essere utilizzato per misurare le velocità di reazione chimica. In questo esempio, l'assorbanza viene utilizzata per monitorare una reazione enzimatica mediante la scomparsa di un intermedio di reazione a 452 nm nel tempo. La velocità di questo passaggio enzimatico può essere calcolata adattando i dati all'equazione appropriata.
Recentemente, l'introduzione di spettrofotometri a micro-volume ha eliminato la necessità di supporti per campioni. Tali spettrofotometri utilizzano la tensione superficiale per contenere il campione.
Gli spettrometri a microvolumo sono ottimali per misurare la qualità e la concentrazione di campioni costosi di volume limitato, come le biomolecole, comprese le proteine e gli acidi nucleici.
L'assorbanza di una proteina a 280 nm dipende dal contenuto di catene laterali aromatiche presenti in triptofano, tirosina e fenilalanina, nonché dall'esistenza di legami cisteina-cisteina disolfuro.
La concentrazione proteica può essere determinata dalla sua assorbanza a 280 nm e dal suo coefficiente di estinzione, che si basa sulla composizione aminoacidica.
Sia il DNA che l'RNA hanno un massimo di assorbanza a 260 nm da cui è possibile determinare la loro concentrazione. La purezza dell'acido nucleico può anche essere valutata dal rapporto tra letture di assorbanza a specifiche lunghezze d'onda.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE allo spettrofotometro.
In questo video abbiamo esaminato alcuni principi di base, tra cui i concetti di spettrofotometria e i componenti dello spettrofotometro. Abbiamo anche dimostrato passo dopo passo il funzionamento dello spettrofotometro e discusso il suo utilizzo nella ricerca biologica. Grazie per l'attenzione.
Q1: How does a spectrophotometer measure the concentration of a solute in a solution?
A spectrophotometer measures concentration by quantifying how much light a sample absorbs. When a beam of light passes through the sample, molecules absorb photons, reducing light intensity. The instrument measures absorbance, which relates directly to solute concentration through the Beer-Lambert Law. This linear relationship between absorbance and concentration allows researchers to determine unknown concentrations from measured absorbance values.
Q2: What is the difference between transmittance and absorbance in spectrophotometry?
Transmittance is the fraction of light that passes through a sample, calculated as the intensity of transmitted light divided by incident light intensity. Absorbance is the inverse logarithm of transmittance and represents how much light the sample absorbs. Spectrophotometers directly measure absorbance, which is the more useful parameter for determining solute concentration using the Beer-Lambert Law.
Q3: What are the main components of a spectrophotometer and what does each do?
A spectrophotometer contains a light source, collimator that focuses light into a straight beam, monochromator that separates light into component wavelengths, and a wavelength selector or slit for choosing the desired wavelength. It also includes a sample holder for cuvettes, a photoelectric detector that measures absorbed photons, and a display screen. Newer models connect directly to computers for experiment control and data display.
Q4: Why is it important to prepare a blank solution before measuring a sample?
A blank solution contains the same solvent and buffer as the sample but without the analyte. The cell and solvent can scatter light, creating background absorbance. By zeroing the instrument with the blank, this background is subtracted from your sample measurement, ensuring accurate absorbance readings. The blank must have the same pH and similar ionic strength as your sample for proper calibration.
Q5: How can spectrophotometry be used to monitor enzyme activity in real time?
Spectrophotometry monitors enzyme activity by tracking changes in absorbance over time. For example, if an enzymatic reaction produces or consumes a compound with a specific absorbance maximum, researchers can measure absorbance at that wavelength repeatedly. The rate of absorbance change reflects the reaction rate, allowing calculation of enzyme kinetics. This method is particularly useful for monitoring disappearance of reaction intermediates at specific wavelengths like 452 nanometers.
Q6: What are the advantages of microvolume spectrophotometers for measuring biomolecules?
Microvolume spectrophotometers use surface tension to hold samples, eliminating the need for traditional cuvette holders. They are optimal for measuring expensive, limited-volume samples such as proteins and nucleic acids. These instruments can determine protein concentration from absorbance at 280 nanometers based on aromatic amino acid content, and assess nucleic acid concentration and purity from absorbance readings at 260 nanometers.
Q7: What precautions should be taken when operating a spectrophotometer?
Always wear appropriate gloves when handling biological or chemical solutions. Allow the instrument to warm up before use. Never leave the cuvette compartment door open, as UV radiation can damage eyes and skin. Before inserting the cuvette, wipe away fingerprints and spills from the outside. Allow samples to reach the appropriate temperature and mix gently to avoid introducing bubbles that could affect measurements.