1.10: Introduzione allo spettrofotometro

Lo spettrofotometro è uno strumento onnipresente nella ricerca biologica, chimica, clinica e ambientale.

La spettrofotometria è la misura quantitativa di quanto una sostanza chimica assorbe la luce facendo passare un raggio di luce attraverso il campione utilizzando uno spettrofotometro.

Misurando l'intensità della luce rilevata, questo metodo può essere utilizzato per determinare la concentrazione di soluto nel campione.

Il fascio di luce che viene irradiato verso il campione è costituito da un flusso di fotoni.

Quando i fotoni incontrano molecole nel campione, le molecole possono assorbirne alcune, riducendo il numero di fotoni nel fascio di luce e diminuendo l'intensità del segnale rilevato.

La trasmittanza è la frazione di luce che passa attraverso il campione ed è definita come l'intensità della luce che passa attraverso il campione rispetto all'intensità della luce incidente. L'assorbanza è il logaritmo inverso della trasmittanza ed è la quantità misurata dallo spettrofotometro.

Dall'assorbanza, la concentrazione della soluzione del campione può essere determinata dalla legge di Beer-Lambert, che afferma che esiste una relazione lineare tra l'assorbanza e la concentrazione di un campione. Secondo la legge di Beer-Lambert, l'assorbanza è il prodotto del coefficiente di estinzione, una misura della forza con cui un soluto assorbe la luce a una data lunghezza d'onda, della lunghezza con cui la luce passa attraverso il campione, o lunghezza del percorso, e della concentrazione di soluto. Spesso, l'obiettivo delle misurazioni dell'assorbanza è misurare la concentrazione di un campione.

Ogni spettrofotometro include una sorgente luminosa, un collimatore, che è una lente o un dispositivo di messa a fuoco che trasmette un intenso raggio di luce rettilineo, un monocromatore per separare il raggio di luce nelle sue lunghezze d'onda componenti e un selettore di lunghezza d'onda, o fessura, per selezionare la lunghezza d'onda desiderata. Le lunghezze d'onda della luce utilizzate negli spettrofotometri discusse in questo video sono nell'intervallo ultravioletto e visibile. Lo spettrofotometro include anche una sorta di portacampioni, un rivelatore fotoelettrico, che rileva la quantità di fotoni assorbiti, e uno schermo per visualizzare l'uscita del rivelatore.

Gli spettrofotometri più recenti sono direttamente accoppiati a un computer, dove è possibile controllare i parametri dell'esperimento e visualizzare i risultati.

Quando si esegue la spettrofotometria, assicurarsi di prendere le dovute precauzioni, come indossare i guanti, a seconda del tipo di soluzioni biologiche o chimiche con cui si sta lavorando.

Prima di misurare lo spettro UV-visibile di un campione, accendere la macchina e lasciare che le lampade e l'elettronica si riscaldino.

Preparare un bianco della stessa soluzione ma senza l'analita, avente lo stesso pH e forza ionica simile; Un passaggio necessario in quanto la cella e il solvente possono disperdere un po' di luce.

I portacampioni per spettrofotometri tradizionali sono progettati per contenere cuvette di plastica e quarzo. Procedere con la pipettatura della soluzione in bianco nella cuvetta.

Dopo aver rimosso eventuali impronte digitali e fuoriuscite dall'esterno della cuvetta, inserire correttamente la cuvetta nel portacampioni e chiudere lo sportello dello scomparto della cuvetta.

Non dimenticare mai di chiudere la porta poiché le radiazioni UV emesse da uno spettrofotometro aperto possono danneggiare gli occhi e la pelle.

Impostare la lunghezza d'onda o l'intervallo di lunghezze d'onda desiderato da trasmettere al campione, che dipende dalla lunghezza d'onda ottimale della luce assorbita dall'analita. Quindi, azzerare lo strumento effettuando una lettura del bianco, che sottrarrà lo sfondo dal buffer di campionamento.

A seconda del tipo di esperimento spettrofotometrico che si sta eseguendo, potrebbe essere necessario generare una curva standard prima della misurazione del campione, da cui è possibile determinare la concentrazione dell'analita del campione.

Lasciare che il campione raggiunga la temperatura appropriata e mescolarlo delicatamente, in modo che non vengano introdotte bolle. Il campione può essere aggiunto direttamente alla cuvetta, all'interno dello strumento, e viene effettuata una lettura.

Dopo aver eseguito la misurazione dell'assorbanza sul campione, procedere al calcolo appropriato per l'esperimento; ad esempio la determinazione della concentrazione o del tasso di attività enzimatica.

Lo spettrofotometro viene utilizzato quotidianamente in molti laboratori di ricerca biologica.

Un'applicazione comune dello spettrofotometro è la misurazione della densità cellulare. La misurazione della densità cellulare è utile per generare curve di crescita logaritmiche per i batteri, da cui è possibile determinare il momento ottimale per l'induzione della proteina ricombinante.

Lo spettrofotometro può essere utilizzato anche per misurare le velocità di reazione chimica. In questo esempio, l'assorbanza viene utilizzata per monitorare una reazione enzimatica mediante la scomparsa di un intermedio di reazione a 452 nm nel tempo. La velocità di questo passaggio enzimatico può essere calcolata adattando i dati all'equazione appropriata.

Recentemente, l'introduzione di spettrofotometri per microvolumi ha eliminato la necessità di portare campioni. Tali spettrofotometri utilizzano la tensione superficiale per trattenere il campione.

Gli spettrofometri per microvolumi sono ottimali per misurare la qualità e la concentrazione di campioni costosi di volume limitato, come le biomolecole, comprese le proteine e gli acidi nucleici.

L'assorbanza di una proteina a 280 nm dipende dal contenuto di catene laterali aromatiche presenti nel triptofano, nella tirosina e nella fenilalanina, nonché dall'esistenza di legami disolfuro cisteina-cisteina.

La concentrazione della proteina può essere determinata dalla sua assorbanza a 280 nm e dal suo coefficiente di estinzione, che si basa sulla composizione degli amminoacidi.

Sia il DNA che l'RNA hanno un'assorbanza massima a 260 nm da cui è possibile determinare la loro concentrazione. La purezza dell'acido nucleico può essere valutata anche dal rapporto tra le letture dell'assorbanza a lunghezze d'onda specifiche.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE allo spettrofotometro.

In questo video abbiamo esaminato alcuni principi di base, inclusi i concetti di spettrofotometria e i componenti dello spettrofotometro. Abbiamo anche dimostrato passo dopo passo il funzionamento dello spettrofotometro e discusso il suo utilizzo nella ricerca biologica. Grazie per l'attenzione.