Quantitative Analysis multispettrali Dopo tessuto fluorescente Trapianto per la visualizzazione delle origini cellulari, tipi e interazioni

L'obiettivo della seguente procedura è quello di utilizzare l'interrogazione multispettrale delle composizioni cellulari multiplex o mimica per determinare i contributi di varie popolazioni residenti nel midollo osseo allo sviluppo dello stroma tumorale. Ciò si ottiene trapiantando prima un topo ricevente transgenico marcato con GFP con cellule staminali del midollo osseo che esprimono RFP. Nella seconda fase, le cellule tumorali di interesse vengono iniettate nello stesso ricevente e quindi, dopo l'attecchimento, il tumore sottoposto ad assoluzione viene sezionato, incorporato in paraffina e marcato con anticorpi immunofluorescenti.

Successivamente, una volta completata la libreria spettrale, viene creata una libreria spettrale di tutte le lunghezze d'onda utilizzate per l'acquisizione delle immagini delle sezioni tumorali. I vetrini vengono ripresi nella fase finale, viene eseguita l'analisi dei dati per consentire l'identificazione e l'associazione dei pattern di colorazione dei marcatori cellulari di interesse. In definitiva, è possibile identificare nuove entità o fenotipi cellulari sulla base della marcatura multiplex di marcatori extracellulari e cellulari per comprendere meglio la composizione di tessuti complessi come il microambiente tumorale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche standard di immunofluorescenza è che l'analisi multispettrale consente di multiplexare sette o più fluoro quattro sullo stesso vetrino, consentendo un'interrogazione molto più precisa e dettagliata della composizione cellulare del microambiente tumorale o di un tessuto rigenerativo. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'origine e la composizione del microambiente tumorale, può essere applicato ad altri sistemi come la medicina rigenerativa, la biologia dello sviluppo e la biologia immunitaria. A dimostrare questa procedura insieme al Dr.Spa è Chris Booth, un assistente di ricerca nel mio laboratorio A causa delle restrizioni IU Cook in questa istituzione, discuteremo ma non mostreremo alcuna manipolazione diretta del mouse sui topi.

Queste procedure del midollo osseo e le nostre tecniche di attecchimento tumorale possono essere trovate nel nostro lavoro precedente, come il capretto e altre cellule staminali. 2009 per iniziare dopo aver isolato le cellule del midollo osseo dagli arti posteriori speculari, resus sospendere le cellule a 2 milioni di cellule per 100 microlitri di PBS per topo. Utilizzare una lampada termica per dilatare i vasi di un topo GFP ricevente irradiato e posizionare il topo in un sistema di ritenuta per iniezione della vena caudale.

Utilizzando un ago da 29 gauge, con il lato smussato rivolto verso l'alto, iniettare sistematicamente le sospensioni cellulari nella coda o nella vena retroorbitale. Utilizzare una garza sterile per applicare una leggera pressione sulla coda dopo l'iniezione. Iniettare in un topo 100 microlitri di PBS solo come controllo dell'attecchimento il giorno dell'iniezione.

Risospendere le cellule tumorali di interesse nella PBS a 1 milione di cellule per 100 microlitri. Dopo aver sterilizzato l'addome con etanolo al 70%. Usa una mano per trattenere il topo per la collottola e la coda, quindi con l'altra mano tieni l'ago con il lato smussato rivolto verso l'alto e inietta le cellule tumorali nella cavità interperitoneale del topo ricevente.

Dopo 15-30 giorni, sopprimere i topi e asportare il tumore dall'addome. Quindi fissare i tumori in formina al 10% per 24 ore. Quindi sezionare il tessuto fissato in fette da cinque a 10 micrometri per le successive procedure di colorazione.

Dopo aver fissato le sezioni di tessuto in paraffina, cuocere i campioni per un'ora a 56 gradi Celsius. Quindi lavare i vetrini secondo la seguente sequenza Dopo l'ultimo lavaggio con etanolo, sciacquare i vetrini in acqua per due minuti. Immergere lentamente e sollevare la rastrelliera per la colorazione dentro e fuori dall'acqua 10 volte.

Quindi, metti il tampone citrato di sodio nel microonde per riscaldarlo. Dopo aver fatto bollire i vetrini per 20 minuti in tampone citrato di sodio, lasciare raffreddare i campioni nel tampone per 30 minuti. Quindi lavare con acqua ionizzata per altri cinque minuti.

Quindi picchiettare il vetrino per far scivolare via grosse gocce d'acqua, fare attenzione a non asciugare la sezione di tessuto. Utilizzare una penna barriera idrofobica per contrassegnare le sezioni attorno alle sezioni tumorali e quindi posizionare immediatamente il tampone bloccante sul campione per evitare che la sezione di tessuto si secchi. Dopo un'ora, incubare i vetrini con l'anticorpo primario di interesse in una camera di umidità su un agitatore a rotazione lenta a quattro gradi durante la notte.

La mattina successiva, lavare i vetrini due volte in PBST per 10 minuti ogni volta agitando delicatamente mentre le sezioni vengono lavate. Diluire gli anticorpi secondari con un rapporto da uno a 1000 anticorpi rispetto al tampone bloccante. Quindi incubare le sezioni negli anticorpi secondari appropriati nella scatola della camera di umidità coperta con un foglio di alluminio su un agitatore a rotazione lenta a temperatura ambiente Dopo due ore.

Lavare i vetrini due volte in PBST per cinque minuti agitando delicatamente e proteggerli dalla luce. Quindi colorare il vetrino solo dappy e i vetrini di analisi con DPI per un minuto, mantenendo i vetrini coperti durante l'incubazione. Posizionando un vetrino coprioggetti su ogni campione, sigillare i bordi di ogni vetrino coprioggetto con un indurente per unghie.

Ora per eseguire l'imaging multispettrale, utilizzare un obiettivo a olio per acquisire un'immagine iniziale del vetrino di analisi per ottenere i tempi di esposizione corretti per ciascuno degli intervalli spettrali nella libreria spettrale. Ad esempio, questa tabella suggerisce protocolli di libreria spettrale basati sul numero di piani quattro utilizzati nell'esperimento. Quindi immagina la diapositiva non colorata per la diapositiva di sfondo nella libreria spettrale per questo esperimento.

L'immagine successiva, il vetrino non colorato per ottenere l'immagine di sfondo per la libreria spettrale. Ora visualizza ogni vetrino di controllo a pavimento singolo colorato, salvando le immagini con il nome dell'anticorpo secondario utilizzato per ogni vetrino. Una volta completata la libreria Suspectable, raccogliere le immagini delle regioni di interesse sul vetrino di analisi per analizzare le immagini dei tessuti tumorali.

Innanzitutto, importa un assortimento rappresentativo delle immagini di nuance acquisite utilizzando il software Inform. Quindi aprire la libreria spettrale sicura come indicato dal programma. Successivamente, identificare le regioni tissutali di interesse da analizzare.

Identificare le singole cellule in base alla colorazione DAPI. Il citoplasma verrà identificato automaticamente in base alla forma del nucleo. Ora scegli la lettura dell'intensità fluorescente scelta per ciascun parametro fluorescente, quindi abbina le immagini acquisite, lasciando che il software elabori i dati utilizzando l'algoritmo proposto.

Al termine dell'elaborazione dell'immagine, unire i file risultanti. Successivamente, utilizzando questa tecnica di imaging multispettrale per analizzare e rappresentare graficamente i tumori in questo modello murino transgenico di trapianto di midollo osseo, i componenti del tumore stromale di origine midollare sono stati individuati mediante citometria a flusso tre settimane dopo il trapianto di midollo osseo. Quindi, sei settimane dopo l'iniezione iniziale, sono state analizzate le sezioni dei tumori ovarici iniettati non marcati dopo aver creato una libreria spettrale con vetrini di controllo a colore singolo, sono state analizzate le immagini della sezione del tumore ovarico colorata con GFP DPI e altri due marcatori.

È possibile l'aggiunta di più marcatori. Ad esempio, qui, la libreria spettrale e l'immagine di accompagnamento di una sezione tumorale con sei marcatori più una colorazione nucleare vengono mostrate utilizzando il software informato. Le regioni tissutali di interesse all'interno della sezione tumorale sono classificabili come mostrato nelle immagini rappresentative mostrate qui.

Ad esempio, questa immagine mostra la classificazione dei segmenti di tessuto seguita dalla segmentazione delle cellule. Basato su colorante nucleare dpi. La quantificazione delle etichette fluorescenti può quindi essere misurata nel nucleo e nel citoplasma di ciascuna cellula ed esportata per ulteriori analisi.

L'algoritmo di segmentazione tissutale è in grado di identificare ulteriormente i sottotipi di tessuto in base all'architettura tissutale e non solo all'identificazione del fluorocromo, fornendo uno strumento analitico più robusto per classificare la colorazione in regioni tissutali distinte. In questa immagine, il computer è stato addestrato a identificare cinque sottoregioni in base ai modelli architettonici all'interno del tessuto. Lo sfondo è definito da uno spazio vuoto.

Il tumore emolitico è definito dall'abbondanza di globuli rossi all'interno del tessuto. Il tumore è definito dalle cellule densamente popolate. Il grasso è definito dai grandi compartimenti cellulari vuoti simmetrici e dai muscoli definiti da un motivo striato.

Utilizzando questo metodo, una popolazione cellulare doppia positiva può essere analizzata in base a una determinata soglia di intensità fluorescente. Ad esempio, per le cellule positive alla GFP e all'actina alfa della muscolatura liscia, come mostrato qui per un'ulteriore rilevazione spettrale oltre i quattro colori, consultare i documenti di suggerimenti e trucchi collegati per il multiplexing di cinque o più sonde. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la qualità delle immagini dipende molto dalle diapositive di controllo a colore singolo utilizzate.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'ibridazione in situ a fluorescenza per rispondere a ulteriori domande come i compartimenti cellulari e il tessuto del microambiente tumorale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della nostra tecnica mimica, l'interrogazione multispettrale di componenti multicellulari e, una volta completato, dovresti avere una conoscenza approfondita di come identificare più bersagli cellulari su un vetrino. Come calcolare Unix quei bersagli cellulari e avere una buona comprensione dell'evoluzione dello stroma tumorale o del tessuto rigenerativo, o del tessuto di interesse.