Progettazione di un biassiale Carico meccanico bioreattore per l'ingegneria tissutale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di fabbricare biocompositi funzionali di ingegneria tissutale per il trapianto. Ciò si ottiene applicando una precisa deformazione meccanica uniassiale o bioassiale per fornire stimoli biofisici alle cellule in compositi tridimensionali di biomateriali. Come seconda fase, il bioreattore è dotato di una cella di carico, che fornisce un feedback di forza e test meccanici dei biocompositi durante il caricamento.

Successivamente, i biocompositi vengono coltivati per un periodo di settimane al fine di indurre cambiamenti su macroscala nel contenuto biochimico del costrutto e nella resistenza, si ottengono risultati che mostrano l'effetto di diversi tipi di carico in base alle differenze significative nel contenuto di glicosaminoglicani e collagene, nell'impalcatura, nello spessore e nel modulo di equilibrio. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sugli effetti del carico biassiale sul tessuto cartilagineo ingegnerizzato, può essere applicato anche ad altri tessuti a bassa portanza come ossa e tendini, a dimostrazione della procedura saranno Amy May e Rob Stefani del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, impostare un bioreattore bioassiale come mostrato qui.

La base del bioreattore è composta da una piastra di alluminio che misura 25 centimetri per 30 centimetri per 12,5 millimetri. Le opzioni di posizionamento variabili disponibili consentono un montaggio flessibile di piastre per colture tissutali di diverse forme e dimensioni. Quindi, assicurarsi che gli stadi siano montati sulla base in modo che lo stadio orizzontale fornisca un taglio dinamico oscillando solo lungo l'asse x.

E lo stadio verticale fornisce una compressione dinamica oscillando solo lungo l'asse Z. Il prossimo passo è fabbricare una piastra di caricamento in polisulfone personalizzata. Il materiale in polisulfone è ideale per la sua biocompatibilità, facilità di lavorazione e facilità di sterilizzazione.

Accoppiare la piastra, la piattaforma mobile biassiale tramite una staffa angolare ad angolo retto lavorata con precisione. I fermi cinematici fissati alla piastra di base, hanno viti di regolazione fine per consentire un allineamento preciso delle piastre di coltura non realizzabile a mano. Quindi, collegare l'attuatore del motore passo-passo a ciascuna piattaforma, che acquisirà un feedback di posizione per il software.

Gli attuatori per motori passo-passo mostrati qui hanno una ripetibilità bidirezionale di 0,1 micrometri e una risoluzione di 20 nanometri, che si traduce in una precisione inferiore a tre micrometri Oltre 50 millimetri di corsa controllano i movimenti degli stadi utilizzando il software avanzato della tecnologia di posizionamento di Thor Lab. Il software controlla il motore passo-passo per regolare i parametri di carico di frequenza e ampiezza sia di pura che di compressione in modo indipendente e simultaneo. Successivamente posizionare una cella di carico in miniatura da cinque libbre tra il platino di carico e la piattaforma mobile per fornire il feedback di forza necessario per rilevare il contatto tra il platino e i costrutti, nonché per valutare le risposte di carico.

Assicurarsi che la cella di carico abbia un'elevata precisione compresa tra lo 0,15% e lo 0,25% del fondo scala e che l'unità di visualizzazione della cella di carico disponga di una porta RS 2 32 per consentire la raccolta dei dati su un computer. Per immobilizzare i campioni all'interno dei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti, preparare uno stampo per un gel aros di 1,5 millimetri di spessore utilizzando un sistema di colata in gel con distanziatori da 1,5 millimetri. Una volta assemblato, versare una soluzione al 4% tra le due piastre di vetro e lasciare raffreddare il composto.

Quindi rimuovere la piastra superiore e forare un disco di 16 millimetri di diametro dalla lastra agro. Per ogni campione in ogni disco, praticare un foro in cui inserire il campione. Posizionare i dischi completati nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.

Quindi premere costrutti di tessuto di 2,25 millimetri di spessore e cinque millimetri di diametro in ciascuno dei supporti del gel. Il campione dovrebbe sporgere dalla parte superiore di ciascun supporto aerodinamico. Quindi, aggiungere 1,5 millilitri di terreno di coltura a ciascun pozzetto e riposizionare il coperchio.

Quindi riposizionare la piastra nell'incubatore fino al momento del caricamento del campione. Per iniziare il caricamento meccanico dei costrutti di tessuto, fissare la piastra di alluminio alla cella di carico e collegare sempre un gruppo di platino sterile al tavolino verticale. L'incubatrice deve essere fatta funzionare in condizioni di bassa umidità per evitare guasti allo strumento.

Quindi, accendi il controller del motore passo-passo e il pc. Aprire il programma utente della tecnologia di posizionamento avanzata e andare alla scheda di controllo grafico su entrambe le schermate. Premere il pulsante zero iniziale per inviare entrambi i motori passo-passo alla posizione zero, che è definita come la posizione superiore e quella più a destra.

Preparare i campioni per il caricamento rimuovendo alcuni terreni da ciascun pozzetto per evitare traboccamenti durante il caricamento meccanico. Quindi posizionare la piastra a 24 pozzetti nel bioreattore e allineare accuratamente la piastra con il platino utilizzando quattro localizzatori cinematici regolabili, assicurandosi di allineare la piastra. A filo con la parte anteriore della base del bioreattore nella scheda di controllo grafica.

Manualmente bene. Regola l'allineamento facendo clic sulla casella di posizione per spostarlo orizzontalmente. Quando la piastra è allineata con i pozzetti della piastra, iniziare ad abbassare la piastra fino a quando non entra in contatto con i campioni.

Una volta raggiunta la posizione di partenza, vai alla scheda del sequencer di mosse e carica la sequenza di mosse desiderata premendo load o crea il tuo programma come descritto nel protocollo di testo che accompagna questo video. Quindi premere run Per avviare il programma. Il software indirizzerà i motori ad applicare il regime di condizionamento desiderato ai campioni.

Al termine del programma, sollevare manualmente la piastra in modo che liberi la parte superiore della piastra di coltura tissutale. Quindi rimuovere la piastra a 24 ruote dal bioreattore e sostituire il fluido. Infine, rimuovere con cautela il platino dalla cella di carico e quindi spegnere gli strumenti.

L'uso del bioreattore biassiale descritto in questo video ha avuto un effetto significativo sulla quantità di glicosaminoglicani e collagene secreti dalle cellule all'interno di costrutti di ingegneria tissutale. Il condizionamento avveniva cinque giorni alla settimana per tre ore al giorno con il 10% di deformazione di compressione e il 5% di deformazione di taglio a un hertz. Dopo 30 giorni di coltura, la quantità di glico ammina, glicani e collagene secreti dai condrociti esposti dal carico, era significativamente superiore rispetto ai campioni di controllo Il carico uniassiale ha aumentato significativamente solo la quantità di glicani della glicosemia.

Inoltre, il carico biassiale ha creato costruzioni più spesse, ma non ha mostrato alcun effetto sull'elasticità delle costruzioni. Utilizzando questo protocollo di dosaggio, dopo 30 giorni di condizionamento e coltura, le sezioni trasversali dei costrutti tissutali sono state colorate con marcatori tipici della cartilagine, tra cui zafferano blu e collagene di tipo due. I tre diversi gruppi includono l'assenza di condizionamento, il carico uniassiale e il carico biassiale.

Mentre tutti i gruppi mostrano una colorazione positiva per alium Blue e Saffron e O, i campioni caricati con bixi mostrano una maggiore quantità di collagene di tipo due rispetto ai campioni senza carico e con caricamento assiale uni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare carichi uniassiali o biassiali sullo sviluppo di costrutti di ingegneria tissutale.