Progettazione di un biassiale Carico meccanico bioreattore per l'ingegneria tissutale

L'obiettivo generale del seguente esperimento è la fabbricazione di compositi biologici ingegnerizzati funzionali per il trapianto. Questo risultato si ottiene applicando una deformazione meccanica uniassiale o biaxiale precisa per fornire stimoli biofisici alle cellule all'interno di compositi biomaterici tridimensionali. Come secondo passaggio, il bioreattore viene dotato di una cella di carico, che fornisce un feedback sulla forza e consente il test meccanico dei compositi biologici durante il carico.

I successivi compositi biologici vengono coltivati per un periodo di settimane al fine di indurre cambiamenti su scala macroscopica nel contenuto biochimico e nella resistenza del costrutto; i risultati ottenuti mostrano l'effetto di diversi tipi di carico in base alle differenze significative nel contenuto di glicosaminoglicani e collagene, nello scaffold, nello spessore e nel modulo di equilibrio. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sugli effetti del carico biaxiale sui tessuti cartilaginei ingegnerizzati, può essere applicato anche ad altri tessuti a basso carico come l'osso e il tendine, dimostrando che la procedura sarà eseguita da Amy May e Rob Stefani del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, configurare un bioreattore biaxiale come mostrato qui.

La base del biorreattore è composta da una piastra in alluminio che misura 25 centimetri per 30 centimetri per 12,5 millimetri. Le diverse opzioni di posizionamento disponibili consentono un montaggio flessibile di piastre per colture cellulari di diverse forme e dimensioni. Successivamente, assicurarsi che le piattaforme siano montate sulla base in modo che la piattaforma orizzontale generi una forza di taglio dinamica oscillando esclusivamente lungo l'asse x.

La piattaforma verticale fornisce una compressione dinamica oscillando esclusivamente lungo l'asse Z. Il passo successivo consiste nella fabbricazione di una piastra di carico personalizzata in polisulfone. Il materiale in polisulfone è ideale grazie alla sua biocompatibilità, facilità di lavorazione e facilità di sterilizzazione.

Collegare la piastra alla piattaforma mobile biaxiale tramite un morsetto ad angolo retto realizzato con precisione. I fermi cinematici fissati alla piastra di base sono dotati di viti di regolazione fine che consentono un allineamento preciso delle piastre di coltura, impossibile da ottenere manualmente. Successivamente, collegare l'attuatore a motore passo-passo a ciascuna piattaforma, il quale fornirà un feedback di posizione al software.

Gli attuatori a motore passo mostrati in figura hanno una ripetibilità bidirezionale di 0,1 micrometro e una risoluzione di 20 nanometri, corrispondente a un'accuratezza inferiore a tre micrometri su un cursore di 50 millimetri. Controllare i movimenti delle piattaforme mediante il software avanzato per la posizionatura di Thor Lab. Il software controlla il motore passo per regolare in modo indipendente e simultaneo i parametri di carico di frequenza e ampiezza sia a taglio sia a compressione. Successivamente, posizionare una cella di carico miniaturizzata da cinque libbre tra la punta di carico e la piattaforma mobile per fornire il feedback di forza necessario a rilevare il contatto tra la punta di platino e le strutture, nonché a valutare le risposte al carico.

Assicurarsi che l'estensimetro abbia un'elevata precisione compresa tra lo 0,15% e lo 0,25% della portata massima e che l'unità di visualizzazione per l'estensimetro sia dotata di una porta RS 232 per consentire la raccolta dei dati su un computer. Per immobilizzare i campioni all'interno delle pozzette di una piastra a 24 pozzette, preparare un modello per un gel di agarosio spesso 1,5 millimetri utilizzando un sistema di polimerizzazione con distanziali da 1,5 millimetri. Una volta assemblato, versare una soluzione al 4% di agarosio tra le due lastre di vetro e lasciare raffreddare la miscela.

Quindi rimuovere la piastra superiore e ricavare un disco di diametro di 16 millimetri dal blocco di agar. Per ogni pozzetto del campione, praticare un foro nel disco in cui inserire il campione. Posizionare i dischi completati nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.

Quindi premere costrutti di tessuto di 2,25 millimetri di spessore e cinque millimetri di diametro in ciascun supporto per gel. Il campione deve sporgere dalla parte superiore di ogni supporto aeros. Successivamente, aggiungere 1,5 millilitri di mezzo di coltura in ogni pozzetto e sostituire il coperchio.

Quindi riposizionare la piastra nell'incubatore fino al momento del caricamento del campione. Per iniziare il caricamento meccanico dei costrutti tessutali, fissare la piastra di alluminio al trasduttore di forza e collegare un'assemblaggio di platino sterile alla fase verticale in ogni momento. L'incubatore deve essere mantenuto in condizioni di bassa umidità per prevenire malfunzionamenti dello strumento.

Successivamente, accendere il controller del motore passo-passo e il pc. Aprire il programma utente di Advanced Positioning Technology e passare alla scheda di controllo grafico su entrambi gli schermi. Premere il pulsante di azzeramento home per portare entrambi i motori passo-passo alla posizione zero, definita come la posizione superiore e più a destra.

Preparare i campioni per il caricamento rimuovendo parte del mezzo da ogni pozzetto per evitare traboccamenti durante il caricamento meccanico. Successivamente, posizionare la piastra a 24 pozzetti nel bioreattore e allineare con attenzione la piastra al platino utilizzando quattro locatori cinematici regolabili, assicurandosi di allineare correttamente la piastra. Allineare a filo con il bordo anteriore della base del bioreattore nella scheda di controllo grafico.

Regolazione manuale fine. Sintonizzare l'allineamento facendo clic sulla casella di posizione per spostarla orizzontalmente. Quando la piastra è allineata con i pozzetti della piastra, iniziare ad abbassare la piastra fino al primo contatto con i campioni.

Una volta raggiunta la posizione iniziale, passare alla scheda del sequenziale movimenti e caricare la sequenza di movimento desiderata premendo "load" oppure creare un proprio programma come descritto nel protocollo testuale accompagnatorio di questo video. Successivamente premere "run" per avviare il programma. Il software indirizzerà i motori ad applicare il regime di condizionamento desiderato ai campioni.

Al termine del programma, sollevare manualmente la piastra in modo che superi la parte superiore della piastra per colture cellulari. Quindi rimuovere la piastra a 24 ruote dal biorreattore e sostituire il mezzo. Infine, rimuovere con attenzione il platino dalla cella di carico e spegnere gli strumenti.

L'utilizzo del bioreattore biaxiale descritto in questo video ha avuto un effetto significativo sulla quantità di glicosaminoglicani e collagene secreta dalle cellule all'interno di costrutti ingegnerizzati di tessuto. Il condizionamento è avvenuto cinque giorni alla settimana per tre ore al giorno, con una deformazione da compressione del 10% e una deformazione da taglio del 5% a un hertz. Dopo 30 giorni di coltura, la quantità di glicosaminoglicani e collagene secreta dai condrociti sottoposti a carico meccanico era significativamente maggiore rispetto ai campioni di controllo. Il carico uniaxiale ha aumentato significativamente soltanto la quantità di glicosaminoglicani.

Inoltre, il carico biaxiale ha prodotto costrutti più spessi, ma non ha mostrato alcun effetto sull'elasticità dei costrutti. Utilizzando questo protocollo di somministrazione, dopo 30 giorni di condizionamento e coltura, sezioni trasversali dei costrutti tessutali sono state colorate con marcatori tipici della cartilagine, tra cui safranina O e collagene di tipo II. I tre gruppi diversi comprendono assenza di condizionamento, carico uniaxiale e carico biaxiale.

Sebbene tutti i gruppi mostrino una colorazione positiva per Alcian Blue e Safranina O, i campioni caricati con sollecitazione biaxiale presentano quantità aumentate di collagene di tipo II rispetto ai campioni non caricati e a quelli sottoposti a carico uniaxiale. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come applicare carichi uniaxiali o biaxiali su costrutti ingegnerizzati in via di sviluppo.