Isolamento, elaborazione ed analisi dei murini gengivali

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare ed elaborare con precisione la gengiva murina per successive analisi mediante citometria a flusso. Questo viene ottenuto innanzitutto isolando chirurgicamente la gengiva in maniera meticolosa. Successivamente, il tessuto escisso viene processato per generare una sospensione monocellulare.

Successivamente, vengono eseguite le colorazioni extracellulare e intracellulare con anticorpi. Infine, il campione viene analizzato mediante citometria a flusso. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano diverse popolazioni cellulari nella gengiva e i cambiamenti cellulari che avvengono nel tessuto in seguito a un insulto immunologico, analizzati mediante citometria a flusso.

Il principale vantaggio di questa tecnica, rispetto ad altri metodi come quelli in chimica OC o in fluorescenza monocromatica, è che si tratta di un metodo rapido e semplice per analizzare un elevato numero di cellule, consentendo l'analisi simultanea di diverse variabili, nonché il sorting di vari tipi cellulari per ulteriori sperimentazioni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, come ad esempio in che modo i microrganismi influenzino l'omeostasi gengivale e come ciò sia correlato alla perdita ossea indotta da infiammazione in un modello sperimentale di parodontite. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato a studiare il ruolo delle cellule RI durante la parodontite. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la tecnica di accelerazione genica GVA è difficile da apprendere a causa delle piccole dimensioni e dell'accesso relativamente scomodo al MU one J gva.

Per iniziare, preparare le soluzioni di mezzo e gli strumenti chirurgici sterilizzati secondo il protocollo descritto nel testo. Dopo l'eutanasia di un topo, eseguita secondo i metodi approvati dal comitato per la cura e l'uso degli animali della vostra istituzione, utilizzare forbici taglienti dritte e smussate per effettuare un'incisione lungo entrambi i lati della cavità orale, comprese le guance e il processo della mandibola, quindi abbassare la mandibola orientando le forbici standard perpendicolarmente al piano dell'osso palatino. Tagliare i tessuti molli e quelli duri lungo una linea immaginaria, di un millimetro dietro i terzi molari.

Successivamente, effettuare un'incisione nei tessuti molli e duri, due millimetri dietro gli incisivi. Poi abbassare la parte anteriore della bocca per esporre la cavità nasale, tenendo le forbici parallele al palato. Inserire una punta nella cavità nasale e utilizzare l'altra per effettuare un'incisione al vestibolo, tagliando fino all'incisione posteriore.

Ripetere l'incisione sull'altro lato della mascella per staccarla dal cranio. Quindi tagliarla lungo la linea mediana e rimuovere il tessuto palatino da ciascuna emimascella per esporre l'osso alveolare utilizzando pinze e forbici. Rimuovere delicatamente i tessuti gengivali dal margine anteriore e porli in una piastra contenente PBS e 2% di siero fetale bovino (FCS) per il trattamento della gengiva; successivamente trasferirli in una piastra di coltura con un millilitro di PBS contenente due milligrammi per millilitro di collaghenasi di tipo due e un milligrammo per millilitro di DNAasi.

Tagliare con una lama chirurgica sterile numero 15. Triturare bene il tessuto prima di trasferirlo in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare le eventuali cellule tessutali residue dalla piastra con un millilitro di P-B-S-F-C-S e trasferirle nel tubo.

Incubare il tessuto in un incubatore agitato preriscaldato a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto per 20 minuti. Quindi aggiungere 20 microlitri di EDTA 0,5 moli e incubare per altri 10 minuti. Successivamente, aggiungere P-B-S-F-C-S fino a 12 millilitri e centrifugare il campione a quattro gradi Celsius, 400 volte G per otto minuti.

Dopo aver rimosso il surnatante, sospendere le cellule in due millilitri di P-B-S-F-C-S. Filtrare il campione attraverso un filtro cellulare da 70 micron dopo aver centrifugato il flusso passante a quattro gradi Celsius e 320 volte G per cinque minuti. Sospendere nuovamente le cellule in 300 microlitri di P-B-S-F-C-S.

Infine, contare le cellule operando sotto una cappa con temperatura fresca e luci spente in un volume totale di 100 microlitri, aggiungere da 0,2 a 0,5 microgrammi di ciascun anticorpo selezionato per un milione di cellule e vortexare brevemente. Dopo aver incubato i campioni a quattro gradi Celsius per 15 minuti al buio, aggiungere due millilitri di P-B-S-F-C-S e centrifugare a 320 ×g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Per fissare le cellule, aspirare il sopranatante, quindi, mentre si vortexa, risospendere aggiungendo goccia a goccia 500 microlitri di BD Cyto Perm freddo.

Gli effetti citoplasmatici prevedono l'incubazione dei tubi a quattro gradi Celsius al buio per 40 minuti dopo l'incubazione con vortex. Aggiungere quindi brevemente un millilitro di buffer BD Perm Wash e centrifugare a 800 × g a quattro gradi Celsius per sette minuti. Dopo aver ripetuto il lavaggio, aspirare tutto il liquido tranne 300 microlitri di buffer di lavaggio.

Quindi, per colorare le cellule in modo intracellulare in un volume totale di 100 microlitri, aggiungere un microgrammo di ciascun anticorpo selezionato per un milione di cellule. Eseguire un'agitazione breve con vortex e incubare al buio per 30 minuti. Dopo aver lavato le cellule due volte come in precedenza e aver rimosso tutto il soprannatante, risospendere le cellule in 300 microlitri di buffer BD Perm/Wash fresco e freddo.

Dopo un breve vortex, filtrare il sospensionato in provette fax. Mantenere le provette sul ghiaccio o in frigorifero al buio fino al momento dell'analisi fax. Cellule gengivali raccolte da due topi naïve.

Sono stati eseguiti su un citometro a flusso LSR due e analizzati mediante il software FlowJo. I grafici di scattering laterale e scattering anteriore mostrati qui dimostrano la distribuzione delle cellule. La strategia di gating per identificare linfociti, monociti, cellule dendritiche e granulociti è indicata a scopo comparativo.

Questa figura rappresenta un grafico FACS che illustra cellule gengivali purificate da topi infettati con P. gingivalis a 21 giorni dall'ingavvagio orale, in un modello sperimentale di parodontite. Un aumento delle diverse popolazioni di cellule immunitarie può essere facilmente rilevato nei topi infetti rispetto ai topi naïve mostrati qui. Le cellule immunitarie presenti nella gengiva processata vengono identificate mediante selezione (gating) delle cellule che esprimono il marcatore ematopoietico CD45.

Queste cellule sono state ulteriormente suddivise in linfociti T CD3 positivi, mostrati in questa figura. I neutrofili sono stati inoltre identificati in base all'espressione delle molecole LY6G e CD11B. Infine, le cellule di Langerhans e il sottogruppo epiteliale delle cellule dendritiche sono state identificate mediante selezione su cellule MHC di classe II positive e CD11C positive, nonché mediante espressione di EPAM e RIN CD207. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore e mezza fino a cinque ore, se effettuata correttamente seguendo questa procedura.

Altri metodi come la PCR in tempo reale possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, come l'espressione genica a livello di singola cellula, dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare la risposta locale nella G GVA contro qualsiasi aggressione nel campo della ricerca parodontale. Questa tecnica ci ha permesso di chiarire il ruolo delle cellule immunitarie e non immunitarie della G GVA nella patogenesi della parodontite sperimentale.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare e processare il GVA urinario al fine di ottenere una sospensione monocellulare, che verrà successivamente sottoposta a una colorazione vir per analisi citofluorimetrica extracellulare e intracellulare.