Question 1

Perché è necessaria la fissazione dei tessuti nella preparazione del campione istologico?

Accepted Answer

La fissazione dei tessuti preserva la struttura cellulare e tissutale prevenendo il degrado causato dagli enzimi naturalmente presenti rilasciati dopo la morte cellulare. La fissazione inibisce l'attività enzimatica e rende i siti di scivolamento delle proteine non riconoscibili. I due meccanismi principali sono la reticolazione, che forma legami covalenti per irrigidire il tessuto, e la coagulazione, che disidrata le proteine utilizzando alcoli o acetone per deformare la loro struttura.

Question 2

Quali sono i due principali meccanismi di fissazione dei tessuti?

Accepted Answer

L'incrocio covalente comporta la formazione di legami covalenti all'interno e tra le proteine, facendo sì che i tessuti si induriscano e resistano alla degradazione. La coagulazione disidrata le proteine attraverso alcoli o acetone, deformando la loro struttura terziaria in modo che le regioni idrofobiche si spostino sulla superficie della proteina. La fissazione coagulativa aiuta i mezzi di inclusione come la cera di paraffina a penetrare più efficacemente nel tessuto.

Question 3

Come funziona la formalina come fissativo nella preparazione dei tessuti?

Accepted Answer

La formalina, formaldeide disciolta in acqua, si lega alle ammine primarie sulle catene laterali degli amminoacidi come la lisina e la glutammina, formando legami crociati stabili chiamati ponti metilenici. Questo processo di reticolazione è intrinsecamente lento, richiedendo 1-2 giorni per il completamento. La formalina funziona meglio se tamponata con fosfato per mantenere un pH neutro e prevenire artefatti tissutali.

Question 4

Quali fattori dovrebbero essere considerati prima di iniziare la fissazione dei tessuti?

Accepted Answer

Considerare la diffusività del campione: i fissativi penetrano nel tessuto a velocità correlate al coefficiente di diffusione e al tempo, quindi i campioni dovrebbero essere limitati a uno spessore di 4 mm per una fissazione completa. Considerare anche il volume del fissativo e il pH. Il rapporto fissativo-campione dovrebbe essere almeno 40:1 per prevenire l'esaurimento del reagente. La formalina dovrebbe essere tamponata con fosfato per mantenere il pH neutro ed evitare artefatti del tessuto.

Question 5

Qual è lo scopo dell'incorporazione di media nella preparazione istologica?

Accepted Answer

L'incorporamento dei media supporta i campioni con rigidità meccanica simile al tessuto stesso. La cera di paraffina è il mezzo di incorporamento più comune. La scelta di mezzi di incorporamento appropriati è fondamentale perché i media troppo rigidi o troppo deboli causano difetti di sezione. Prima dell'incorporamento in paraffina, i campioni devono essere disidratati sostituendo l'acqua con etanolo, poi con xilene e infine con cera di paraffina riscaldata.

Question 6

Come differisce la criosezionamento dalla sezione tradizionale incorporata in paraffina?

Accepted Answer

La criosezionalizzazione evita la fissazione congelando rapidamente il tessuto in mezzo OCT (temperatura ottimale di taglio) e poi sezionando con un criostato mantenuto a -20°C. A differenza delle sezioni in paraffina che richiedono il trattamento in bagno d'acqua, le sezioni congelate vengono direttamente sollevate su vetrini di vetro a carica positiva immediatamente dopo la sezione. Questo metodo preserva meglio la struttura proteica per la marcatura degli anticorpi poiché non si verifica il cross-linking.

Question 7

Quali sono i metodi alternativi di incorporazione alla cera di paraffina?

Accepted Answer

L'incorporamento di agar copre i campioni con agarosio liquido appena preparato che fissa il tessuto in posizione mentre si raffredda. I vibrotomi con lame vibranti tagliano sezioni spesse di 50-1000 µm dai campioni incorporati in agar. I campioni vengono tipicamente rimossi dall'agar prima della colorazione e montati su vetrini con grasso per vuoto. Le sezioni spesse di agar sono meglio visualizzate utilizzando la luce principio di microscopia strumentazione e applicazioni per immagini ad alta risoluzione.

Preparazione del campione istologico per microscopia ottica - Quiz di valutazione