Name: Applicazione di un In vitro DNA Protection Assay per visualizzare stress Mediazione Proprietà del Dps Protein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Impara a purificare la proteina Dps da E. coli e valutarne l'effetto protettivo sul DNA contro i danni ossidativi tramite elettroforesi. Questo metodo fornisce un protocollo affidabile per studiare i meccanismi di sopravvivenza batterica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Siamo grati a Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, e Kourosh Honarmand Ebrahimi per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti di avviamento dalla Delft University of Technology.

1. Dps espressione e purificazione Ottenimento di proteine ​​di elevata purezza è un primo passo essenziale per il saggio di DNA-protezione. Purificazione di proteine ​​Dps può essere eseguita in 4 o 5 giorni. <ol><li> Trasformare un ceppo proteasi carente di E. coli (come BL21 (DE3) pLysS) con un vettore pET (come pET17) in cui è stato clonato la sequenza codificante proteina-PS. </li><li> Streak l&#39;trasformato cellule affaccia Luria Broth (LB) piastre di agar contenenti antibiotici appropriati (come l&#39;ampicillina e cloramfenicolo per gli esempi forniti in 1.1). Incubare le piastre notte a 37 ° C. </li><li> Inoculare una singola colonia dalla piastra in 30 ml di terreno LB contenente antibiotici appropriati. Incubare per una notte a 37 ° C agitando a 200-250 rpm. </li><li> Inoculare 2 x 1 L terreno LB contenente antibiotici appropriati con 10 ml ciascuna di coltura durante la notte. Crescere a 37 ° C, agitando, a OD 600 </sub&gt; di circa 0,6. (Crescente celle a maggiori aumenti OD resa di proteine, senza compromettere sensibilmente la purezza del prodotto finale.) Indurre l&#39;espressione di Dps aggiungendo IPTG ad una concentrazione di 0,3 mM, e incubare a 37 ° C per 3-4 ore agitando. </li><li> Celle di raccolta per centrifugazione a 6000 xg per 15 min. Risospendere il pellet di cellule in 7,5 ml di DEAE tampone A (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) per L di coltura cellulare indotta. Campioni possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C, se desiderato. La procedura può essere continuato dalle scongelamento dei campioni in un bagno di acqua a 4 ° C. </li><li> Aggiungere una miscela di inibitori delle proteasi (come Calbiochem III set inibitori della proteasi, a 0,167 ml per ml di sospensione cellulare) alla sospensione cellulare impedire il degrado del Dps overexpressed. </li><li> Preparare l&#39;estratto privo di cellule utilizzando una stampa francese. Primo la stampa francese con 20 ml DEAE tampone A (se si utilizza un modello a flusso continuo), quindi alcuna interruzione,t il campione due volte a 20 kpsi. Centrifugare il lisato a 30.000 xg per 35 min a 4 ° C per chiarire particelle insolubili, e salvare il surnatante. Il supernatante può allora essere congelato con azoto liquido e conservato a -80 ° C, se desiderato. </li><li> Equilibrare un ml DEAE Sepharose colonna 30 CL-6B con DEAE tampone A, utilizzando un FPLC. Esegui tampone attraverso la colonna a 1-2 ml / min con una pressione massima di 0,2 MPa su sfondo. Caricare l&#39;estratto cellulare sulla colonna, e cominciare a raccogliere il flusso attraverso una volta che il segnale OD 280 comincia ad aumentare sopra del basale. Lavare la colonna con DEAE tampone A fino a quando il valore di OD 280 ritorna al basale, mentre continua la raccolta del flusso passante. Il passaggio di flusso dovrebbe contenere la maggior parte della proteina Dps, libera da DNA legato. Lavare la colonna con il 100% tampone B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M di NaCl, 0,1 mM EDTA). Questo eluato contiene complessi Dps-DNA così come altre proteine ​​e può essere scartato. </li><li> Rimuovere annunciozionale proteine ​​contaminanti attraverso ammonio solfato di precipitazione. Determinare il volume del pool di flusso continuo. Lentamente (in un periodo di 10-20 min) aggiungere secco solfato di ammonio a paglia al 62% di saturazione (390 mg per ml di soluzione) a 4 ° C agitando bene. Lavorare l&#39;impasto per un ulteriore 20-30 minuti dopo aver aggiunto l&#39;ultima parte del solfato di ammonio per garantire la completa equilibrio. DPS rimarranno solubile, mentre le proteine ​​contaminanti saranno precipitare dalla soluzione. </li><li> Rimuovere proteine ​​precipitate mediante centrifugazione a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C e salvare il supernatante. </li><li> Lentamente aggiungere un supplemento di 227 mg di solfato di ammonio per ml di surnatante di raggiungere il 94% di saturazione e mescolare per 20-30 minuti per garantire la completa equilibrio. DPS precipitati a questa concentrazione di sale e possono essere raccolti per centrifugazione a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C. DPS saranno nel pellet, il supernatante può essere scartato. Il pellet può essere conservato a -80 ° C se desIred. </li><li> Risospendere il Dps contenenti pellet in Resuspension Buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Regolare il volume del campione di 2,5 ml. </li><li> Scambio di tamponi per allontanare il solfato di ammonio, utilizzando una colonna di filtrazione PD-10 gel. Equilibrare il letto con gel 25 ml Resuspension Buffer. Applicare il ml 2,5 di Dps campione alla parte superiore della colonna PD-10 e lasciare in ammollo dentro Eliminare il flusso continuo. Raccogliere Dps eluendo con 3,5 ml Resuspension Buffer. </li><li> Centrifugare il buffer a scambio campione a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C per rimuovere i componenti insolubili, e diluire con 6-10 ml di tampone di diluizione (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 0,1 mM EDTA) per garantire che la concentrazione di sale è abbastanza basso per il Dps di legare alla colonna SP Sepharose. Campioni particolarmente concentrate di DPS può diventare meno solubili su di diluizione in un tampone inferiore-sale, come evidenziato da nebulosità del liquido, ma possono essere completamente resolubilized con l&#39;aggiunta di un piccolo Amount 5 M NaCl (un ulteriore 10-20 mm). </li><li> Equilibrare un ml SP Sepharose colonna flusso veloce con 30 SP tampone A (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Esegui tampone attraverso la colonna a 1,5-2 ml / min, con un limite di pressione di 0,3 MPa su sfondo. Caricare il campione attraverso la colonna. Lavare con SP tampone A fino a quando le OD 280 traccia ritorna alla linea di base, e scartare il flow-through. Eseguire un gradiente lineare da 150 ml da 0 al 100% Tampone B, mentre la raccolta 2 frazioni ml. DPS eluiscano in un forte picco intorno al 50% B, sebbene variazione del 10% è possibile. </li><li> Eseguire le frazioni di eluizione su un gel SDS-PAGE 15%, e verificare la presenza di contaminazione da DNA misurando il rapporto di 280 OD 260 / OD utilizzando uno spettrofotometro. Il gel deve mostrare solo una banda di circa 19 kDa, e la OD 260 / OD 280 è in genere intorno a 0.7. La piscina per i più puri Dps frazioni. Utilizzare un gruppo filtro centrifugo (come il Amicon Ultra Filtration Unit) con un10K peso molecolare di cut-off per concentrare il DPS e scambiarli in un buffer di memoria (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM di NaCl). Aliquota della Dps purificati, e congelare in azoto liquido per la conservazione a -80 ° C. </li></ol> 2. Protezione DNA Assay Il saggio coinvolge più passaggi sensibili al tempo e dovrebbe essere cronometrato al secondo per ottenere risultati riproducibili. Molti ingredienti e le fasi di pipettaggio sono coinvolti, in modo da un tavolo di pipettaggio (vedi tabella 1) Si consiglia di tenere traccia dei passaggi e dei volumi. Il tempo totale richiesto per il dosaggio è non più di 3 ore. <ol><li> Misurare 30 ml di acqua in un flacone ermetico; lavare l&#39;acqua con N 2 per 10 min (usando due aghi siringa, una nel fluido, uno sopra di esso) per rimuovere l&#39;ossigeno dalla soluzione. Aggiungi 0,0168 g FeSO4 • 7H 2 O per l&#39;acqua per ottenere una soluzione madre di 2 mm. Si chiude la fiala e lavare con azoto per 5 minuti di più, poi mescolare. La soluzione deve esserechiaro, se ogni accenno di giallo è rilevabile, preparare una nuova soluzione di ferro. </li><li> Fare un 100 mm H 2 O la soluzione 2 (10,87 ml di 9.2MH 2 O 2 in 1 ml di acqua); tenere in ghiaccio e al riparo dalla luce avvolgendolo in un foglio di alluminio. Utilizzare solo per circa 1-2 ore dopo la preparazione a causa di decadimento spontaneo. Il perossido di idrogeno è disponibile similmente soggetta a guasti, che possono essere parzialmente alleviate corretta conservazione (al buio a 4 ° C). Sono consigliati controlli regolari della concentrazione stock di misurare i 240 OD. </li><li> Scongelare una aliquota di purificata Dps rapidamente in un bagno d&#39;acqua a temperatura ambiente, e tenere in ghiaccio. Centrifugare per 10 secondi a 4000 xg in un tavolo picocentrifuge ad aggregati precipitato. Misurare la concentrazione dopo centrifugazione utilizzando uno spettrofotometro (OD 280 = 1,547 indica una concentrazione di 100 mM Div. monomero). </li><li> Diluire il DNA lineare da alta concentrazione di magazzino utilizzando 12x tampone di reazione (1M MOPS-KOH pH 7,0, NaCl 1 M) ad una concentrazione di 100 ng / mL. DNA lineare è usata per rendere più facile quantificazione, ma il DNA plasmidico può essere utilizzato come bene. </li><li> Pipettare 1 ml di miscela di DNA-buffer in un tubo di PCR. Aggiungere abbastanza acqua nella reazione in modo che il volume di reazione finale (meno SDS) sarà di 12 microlitri. Tale importo deve essere calcolato in anticipo utilizzando la tabella di pipettaggio. Aggiungi Dps ad una concentrazione finale dodecamero di 3 micron. Incubare per 15 min a temperatura ambiente per permettere Div. di legarsi al DNA. </li><li> Aggiungere abbastanza 2 mM soluzione FeSO 4 per raggiungere la concentrazione desiderata. Un tipico esperimento utilizza un intervallo di concentrazioni da 0 a 1 mM FeSO4. Concentrazioni maggiori causerà più ampio degradazione del DNA, ma può anche portare alla formazione di precipitati ferrico nella miscela di reazione. Aggiungere rapidamente 1 mM microlitri della soluzione di H 2 O 2 100 (a concentrazione finale 10 mM), e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire la FentonMediata reazione di degradazione di prendere posto. </li><li> Aggiungere 0,8 ml di 20% SDS (sodio dodecil solfato). Mescolare ed incubare a 85 ° C per 5 minuti per distruggere i complessi Dps-DNA. La SDS destabilizza il complesso Dps-DNA e impedisce spostamenti indesiderati gel per il DNA, che migliora la facilità di quantificazione. Un passo opzionale è fermare la reazione catalitica degradando il perossido di idrogeno in prodotti non tossici. Per le condizioni descritte in questo protocollo, questa fase non è necessaria per ottenere una vasta gamma di degradazione del DNA. </li><li> Incubare in ghiaccio per 1 min, aggiungere colorante di caricamento, e caricare su un gel di agarosio. Esegui il gel, e colorare per DNA usando bromuro di etidio. Il gel deve essere colorato post-elettroforesi anziché prima dell&#39;elettroforesi, per evitare che la SDS di interferire con la distribuzione bromuro di etidio nel gel. </li></ol>

<ol><li>Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+DNA-binding+protein+with+regulatory+and+protective+roles+in+starved+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli.</a> Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).</li>
<li>Chiancone, E., Ceci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+capacity+of+Dps+proteins+to+combat+bacterial+stress+conditions%3A+Detoxification+of+iron+and+hydrogen+peroxide+and+DNA+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding.</a> Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).</li>
<li>Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase-dependent+variation+in+protein+composition+of+the+Escherichia+coli+nucleoid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid.</a> J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).</li>
<li>Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+repression+by+Fis+and+H-NS+at+the+Escherichia+coli+dps+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter.</a> Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).</li>
<li>Martinez, A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+DNA+during+oxidative+stress+by+the+nonspecific+DNA-binding+protein+Dps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps.</a> J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).</li>
<li>Nair, S., Finkel, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dps+protects+cells+against+multiple+stresses+during+stationary+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase.</a> J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).</li>
<li>Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+Dps%2C+a+ferritin+homolog+that+binds+and+protects+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA.</a> Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).</li>
<li>Zhao, G., Ceci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+hydrogen+peroxide+detoxification+properties+of+DNA-binding+protein+from+starved+cells.+A+ferritin-like+DNA-binding+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).</li>
<li>Ceci, P., Cellai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+condensation+and+self-aggregation+of+Escherichia+coli+Dps+are+coupled+phenomena+related+to+the+properties+of+the+N-terminus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus.</a> Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).</li>
<li>Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+incorporation+into+Escherichia+coli+Dps+gives+rise+to+a+ferritin-like+microcrystalline+core%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core.</a> J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).</li>
<li>Swift, J., Wehbi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+functional+ferritin-like+proteins+with+hydrophobic+cavities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).</li>
<li>Ceci, P., Chiancone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+iron+oxide+nanoparticles+in+Listeria+innocua+Dps+%28DNA-binding+protein+from+starved+cells%29%3A+a+study+with+the+wild-type+protein+and+a+catalytic+centre+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant.</a> Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).</li>
<li>Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dps+protein+of+Agrobacterium+tumefaciens+does+not+bind+to+DNA+but+protects+it+toward+oxidative+cleavage%3A+x-ray+crystal+structure%2C+iron+binding%2C+and+hydroxyl-radical+scavenging+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).</li>
<li>Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+so-called+Listeria+innocua+ferritin+is+a+Dps+protein.+Iron+incorporation%2C+detoxification%2C+and+DNA+protection+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties.</a> Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).</li>
<li>Kumar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+Koelreuteria+paniculata+Laxm.+on+oxidative+stress+and+hydrogen+peroxide-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopharmacology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage.</a> Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).</li>
<li>Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radical+scavenging%2C+DNA+protection%2C+and+inhibition+of+lipid+peroxidation+mediated+by+uric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).</li>
<li>Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+role+of+Fur+proteins%3A+FurB+%28All2473%29+from+Anabaena+protects+DNA+and+increases+cell+survival+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress.</a> The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).</li>
<li>Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+and+stimulation+of+formation+of+the+ferroxidase+center+and+the+iron+core+in+Pyrococcus+furiosus+ferritin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).</li>
<li>Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+iron+determination+using+ferene+triazine%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Serum iron determination using ferene triazine.</a> Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Il processo di purificazione Div. come descritto in questo articolo è molto robusto. La purezza è stata assai alta (&gt; 99%); altre proteine ​​appaiono su SDS-PAGE gel come bande visibili. Nonostante questo, alcuni lotti di Dps purificati sembrano avere attività nucleasi, come dimostra la degradazione del DNA parziale quando incubate con concentrazioni molto elevate di Dps. Ciò potrebbe indicare la presenza di DNasi altamente attivi a bassa concentrazione che non siamo riusciti a rimuovere attraverso la purificazione. ...

Organismi aerobici devono lottare costantemente con le specie reattive dell&#39;ossigeno che possono danneggiare il DNA e altre macromolecole biologiche cruciali. Uno strumento potente per contrastare gli effetti tossici del danno ossidativo è la proteina legante il DNA dalle cellule affamate (DPS). Fin dalla sua scoperta nel 1992 da fame E. coli cultura 1, Div. è stata identificata in più di 300 specie di batteri e archeobatteri 2. Upregulation massiccia di Dps durante la fase stazionaria lo rende il più altamente espresso proteina nucleoide-associato di E. coli in condizioni di fame 3, 4. Inoltre, Dps ha mostrato di preservare sia la vitalità batterica e l&#39;integrità del DNA durante molte diverse sollecitazioni, tra cui la fame, ad alta concentrazione di ferro, l&#39;esposizione alla luce UV, shock termico, e lo stress ossidativo 5, 6. Strutturalmente, Dps auto-soci in un complesso stabile omo-oligomeri di 12 monomeri, which assemblare in un guscio vuoto sferico. Il ~ 4.5 nm-wide cavità interna è accessibile al solvente esterno attraverso pori che permettono il passaggio di piccole molecole 7, e può sequestrare metalli come ferro mineralizzati 8. L&#39;effetto protettivo del Dps deriva dalle sue molteplici attività biochimiche, che comprendono non specifico DNA binding 1, l&#39;attività ferrossidasica e deposito di ferro 8. Studio dettagliato delle benefiche attività biochimiche del Dps richiede prima la sua purificazione. DPS purificazione è una procedura complessa, come PS devono essere separati non solo da altre proteine, ma anche da qualsiasi DNA legato 7. Nostro processo di purificazione ottimizzato utilizza molte tecniche comuni, costituito da due colonne di scambio ionico e di un passo precipitazione di solfato di ammonio. Sono necessari molti scambi di buffer, come Dps alta concentrazione possono precipitare dalla soluzione in condizioni di basso contenuto di sale. Una volta Dps proteina è stata purificata, Esso può essere applicato a saggi che misurano direttamente la sua attività ferrossidasica 8, stechiometria DNA-binding 9, e meccanismi di ferro vincolante 10. Dps purificate ha anche altre applicazioni potenziali. La struttura sferica cava stabile di DPS è stato utilizzato come impalcatura per la memorizzazione di particelle idrofobe all&#39;interno della cavità proteina 11 e anche come camera di reazione per sintetizzare nuove nanoparticelle magnetiche 12. La capacità protettiva del Dps di mediare i danni derivanti da specie reattive dell&#39;ossigeno può essere chiaramente e direttamente dimostrato utilizzando il saggio di protezione del DNA 13, 14. In questa procedura in vitro, specie radicali sono prodotti quando ferro catalizza H 2 O 2 degradazione attraverso la chimica Fenton. Questi radicali danneggiare direttamente DNA presente nella reazione e possono degradare completamente a concentrazioni elevate. Due principali attività DPS può sia contrastare direttamente gli effetti di Fentproduzione di radicali on-mediata. Dps abbassa la concentrazione di ferro catalitico mediante mineralizzazione, consumando il perossido di idrogeno disponibile nel processo. Inoltre, Dps legame al DNA possono potenzialmente proteggerlo fisicamente dai danni dei radicali e lo condensa in un volume più piccolo con superficie meno reattivo. La combinazione di queste due proprietà rende il saggio di protezione DNA adatto per lo scopo di misurare l&#39;attività protettiva Div.. Il saggio di protezione Il DNA è molto versatile e può essere utilizzato per una varietà di applicazioni oltre caratterizzazione Div.. I danni dei radicali è una comune forma di stress nelle cellule, e molte proteine ​​e sostanze chimiche diverse sono utilizzati per contrastarla. Il principio generale del saggio, l&#39;integrità del DNA utilizzando come marker per danni radicale, può essere utilizzato in combinazione con qualsiasi reazione producono radicali o un agente di contrasto. Tra gli altri, il saggio è stato usato con successo per determinare le proprietà anti-ossidantidi K. Estratto paniculata per l&#39;industria alimentare 15, per caratterizzare gli effetti di acido urico a danno idrossile mediazione 16, e di acquisire nuove informazioni sulla funzione delle proteine ​​Fur regolatore trascrizionale 17. Nonostante i numerosi usi del saggio in articoli pubblicati, abbiamo scoperto che molti di ottimizzazione e risoluzione dei problemi sono stati richiesti, il che rende l&#39;impostazione del test per la prima volta un processo inutilmente faticoso per molti ricercatori. Il protocollo che presentiamo in questo articolo si propone di rimuovere questa barriera per l&#39;ingresso.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3)pLysS cellule competenti</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>pET-17b DNA</td><td>EMD-Millipore</td><td>69663-3</td><td></td></tr><tr><td>LB brodo in polvere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di potassio</td><td>Merck</td><td>105033</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>VWR</td><td>443824T</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Iniettore della proteasi Cocktail Set III</td><td>EMD-Millipore</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>DEAE-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DFF100</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Colonne di desalinizzazione</td><td>GE Healthcare LS</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>SP-Sepharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1799</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centr. Filtro (10K MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Solfato ferroso eptaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8048</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Calbiochem</td><td>475898</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice statica</td><td>Hettich</td><td>INE500</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice ad agitazione </td><td>New Brunswick Sc.</td><td>Inova 44</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga raffreddata</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-E</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Disgregatore di celle</td><td>Constant Systems Ltd.</td><td>TS2/40/AA/AA</td><td></td></tr><tr><td>FPLC Purificatore</td><td>General Electric</td><td>AKTA</td><td></td></tr><tr><td>Fiale ermetiche</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-08918-85</td><td></td></tr><tr><td>Aghi per siringa</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>Z683779-1EA, Z683795-1EA</td><td></td></tr></tbody></table>

applicazione di un<em&gt; in vitro</em&gt; dna protection assay per visualizzare stress mediazione proprietà del dps protein

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Lo stress ossidativo è un sottoprodotto inevitabile della vita aerobica. L&#39;ossigeno molecolare è essenziale per il metabolismo terrestre, ma partecipa anche a molte reazioni dannose all&#39;interno di organismi viventi. La combinazione di metabolismo aerobico e di ferro, che è un altro composto essenziale per la vita, è sufficiente a produrre radicali attraverso la chimica di Fenton e degradare componenti cellulari. Degradazione del DNA è probabilmente il processo più dannosa che coinvolgono radicali intracellulari, come la riparazione del DNA è tutt&#39;altro che banale. Il saggio presentato in questo articolo offre una tecnica quantitativa per misurare e visualizzare l&#39;effetto delle molecole ed enzimi sui danni al DNA radicale-mediata. Il saggio di protezione del DNA è un semplice, rapido, e robusto strumento per la caratterizzazione in vitro delle proprietà protettive delle proteine ​​o prodotti chimici. Esso consiste nell&#39;esporre DNA ad una reazione ossidativa dannosa e aggiungendo concentrazioni varianti del composto di interesse. La riduzione o l&#39;aumento di danno al DNA in funzione della concentrazione del composto è quindi visualizzato mediante elettroforesi su gel. In questo articolo si dimostra la tecnica del saggio di protezione del DNA misurando le proprietà protettive della proteina legante il DNA dalle cellule affamate (DPS). DPS è un mini-ferritina che è utilizzato da più di 300 specie di batteri per combattere con forza di stress ambientale. Qui vi presentiamo il protocollo di purificazione Dps e le condizioni di analisi ottimizzate per valutare la protezione del DNA dal Dps.

Il processo di purificazione per il Dps qui descritto è molto riproducibile. Dps purificazione secondo il protocollo descritto, utilizzando 2 L di E. cultura coli come punto di partenza, sarà tipicamente resa 2,5 ml di proteina contenente Div. 12 a concentrazioni comprese tra 5 e 12 mM. Tempi di induzione più lunghi (4 ore) sembrano ridurre questa variabilità. Purezza proteina è costantemente al di sopra del 99%, come evidenziato da SDS-PAGE gel (Figura 1). Il livello di con...

La proteina di legame al DNA dalle cellule affamate (DPS) gioca un ruolo cruciale nella lotta contro lo stress batterica. Questo articolo discute la purificazione<em&gt; E. coli</em&gt; PS e il protocollo per un<em&gt; In vitro</em&gt; Test dimostrando protezione Dps-mediata di DNA dalla degradazione dalle specie reattive dell&#39;ossigeno.

Applicazione di un<em&gt; In vitro</em&gt; DNA Protection Assay per visualizzare stress Mediazione Proprietà del Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare in vitro l'effetto protettivo della proteina DPS, visualizzando la riduzione del danno al DNA mediato dai radicali risultante dall'attività della DPS. Questo viene ottenuto innanzitutto purificando la DPS da cellule di e coli, utilizzando diverse colonne a scambio ionico e una precipitazione con solfato di ammonio. In un secondo passaggio, la DPS purificata viene aggiunta al DNA, permettendo la formazione di un complesso A-D-P-S-D-N-A grazie alle proprietà di legame non specifico della proteina al DNA. Successivamente, vengono aggiunte al reazione soluzioni di ferro ferroso e perossido di idrogeno per generare radicali idrossilici attraverso la chimica di Fenton e provocare così il danno al DNA.I risultati ottenuti mostrano una riduzione del danno al DNA grazie alla presenza della DPS, in base alla quantificazione delle bande di DNA non danneggiato su gel di agarosio dopo elettroforesi. In generale, le persone nuove a questo metodo avranno difficoltà nella preparazione dei reagenti. Ciò provoca reazioni indesiderate, come la formazione di precipitati di ferro ferrico o il decadimento spontaneo del perossido di idrogeno.Sebbene questo metodo fornisca informazioni sull'attività protettiva della DPS contro lo stress ossidativo, può anche essere applicato per quantificare gli effetti di altre proteine e sostanze chimiche sulla degradazione del DNA. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della chimica ossidativa, ad esempio determinando le proprietà antiossidanti di estratti cellulari per l'uso nell'industria alimentare. Un passaggio essenziale iniziale per il saggio di protezione del DNA è ottenere una proteina DPS di elevata purezza.Per iniziare la procedura di espressione e purificazione della DPS, trasformare un ceppo di E. coli carente di proteasi con un vettore pet in cui è stata clonata la sequenza codificante per la proteina DPS. Inoculare due beute da un litro di terreno LB contenente antibiotici appropriati con 10 millilitri ciascuna di una coltura notturna ottenuta da una singola colonia di cellule trasformate, coltivandole a 37 gradi Celsius sotto agitazione fino a un OD 600 di circa 0,6.Quando le cellule hanno raggiunto l'OD desiderato, indurre l'espressione di DPS aggiungendo IPTG a una concentrazione di 0,3 millimolare e incubare a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore sotto agitazione. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 6.000 ×g per 15 minuti. Sospendere i pellet cellulari in 7,5 millilitri di buffer DEAE per litro di coltura cellulare indotta e aggiungere una miscela di inibitori della proteasi alla sospensione cellulare combinata. Per prevenire la degradazione della TPS sovraespressa, preparare un estratto privo di cellule utilizzando un pressa francese.Utilizzare la pressa francese con 20 millilitri di tampone DEAE A e quindi disgregare il campione due volte a 20 KPSI; centrifugare il lisato a 30.000 ×g per 35 minuti a 4 gradi Celsius. Per rimuovere le particelle insolubili, conservare il soprannatante e caricare l'estratto privo di cellule su una colonna DEAE SRO SEAL 6B da 30 millilitri, precedentemente equilibrata con tampone DEAE A, iniziando a raccogliere il flusso iniziale. Una volta che il segnale di OD a 280 nm inizia ad aumentare rispetto al valore di base, lavare la colonna con tampone DEAE A finché il valore di OD a 280 nm non ritorna al livello di base, raccogliendo continuamente il flusso iniziale.Il flusso in uscita dovrebbe contenere la maggior parte della proteina DPS priva di DNA legato; lavare la colonna con il 100% di tampone B. L'eluito contiene complessi D-P-S-D-N-A così come altre proteine e può essere scartato. Il passaggio successivo consiste nell'eliminare ulteriori proteine contaminanti mediante precipitazione con solfato di ammonio, che di solito viene eseguita in camera fredda.Dopo aver determinato il volume del flusso raccolto, aggiungere lentamente il solfato di ammonio in granuli fini fino a raggiungere una saturazione del 62% nell'arco di 10-20 minuti a quattro gradi Celsius, sotto costante agitazione. Rimuovere accuratamente le proteine precipitate mediante centrifugazione a 20.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Conservare con cura il soprannatante.Aggiungere ulteriori 227 milligrammi di solfato di ammonio per millilitro di sopranatante per raggiungere una saturazione del 94% e mescolare da 20 a 30 minuti. Per garantire un completo equilibrio dei precipitati TPS a questa elevata concentrazione di sale, raccogliere il DPS mediante centrifugazione a 20.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet contenente il DPS nel buffer di risospensione Resus e portare il volume del campione a 2,5 millilitri.Rimuovere il solfato di ammonio mediante scambio di tampone utilizzando una colonna di filtrazione su gel PD 10 il cui letto di gel è stato equilibrato con 25 millilitri di tampone per sospensione Resus. Applicare i 2,5 millilitri del campione DPS sulla sommità della colonna PD 10 e lasciarlo assorbire, scartando il flusso iniziale. Raccogliere il DPS eluendo con 3,5 millilitri di tampone per sospensione Resus, quindi centrifugare.Il campione sottoposto a scambio di tampone è stato centrifugato a 16.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Per rimuovere eventuali componenti insolubili, diluire il campione con sei-dieci millilitri di tampone di diluizione, in modo da garantire una concentrazione di sale sufficientemente bassa per la DPS. Per consentire il legame alla colonna SP SPHEROS, caricare il campione su una colonna da 30 millilitri di SP spheros fast flow precedentemente equilibrata con tampone SP.Eseguire un lavaggio con tampone SP A fino a quando la traccia dell'OD a 280 ritorna alla linea di base e scartare il flusso in eccesso. Eseguire un gradiente lineare di 150 millilitri da 0 a 100% di tampone B raccogliendo frazioni di due millilitri. Il DPS eluirà in un picco stretto intorno al 50% di B, anche se è possibile una variazione del 10%.Verificare le frazioni di elucian per la contaminazione da DNA misurando il rapporto tra OD a 60 e OD a 80. Utilizzando uno spettrofotometro, il rapporto dovrebbe essere tipicamente di circa 0,7 quando le frazioni di elucian vengono analizzate su un gel SDS-PAGE al 15%. Il gel dovrebbe mostrare una sola banda a circa 19 chilodalton.Raccogliere insieme le frazioni di DPS dopo aver concentrato e sostituito il DPS in un buffer di conservazione. Utilizzando un filtro centrifugo, aliquotare il DPS purificato e congelare in azoto liquido per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Il saggio di protezione genetica comprende diversi reagenti e schemi complessi di patogeni.Una preparazione accurata dei reagenti e una temporizzazione precisa sono un requisito assoluto per la riproducibilità. Si consiglia l'uso di un tavolo per pipettare per tenere traccia dei passaggi e dei volumi durante questa procedura. Misurare 30 millilitri di acqua in un vial ermetico per rimuovere l'ossigeno dalla soluzione.Spurgare l'acqua con azoto per 10 minuti utilizzando due aghi da siringa, uno immerso nel liquido e uno al di sopra. Aggiungere 0,0168 grammi di solfato ferroso eptaidrato all'acqua per ottenere una soluzione madre di due millimoli. Sigillare il flaconcino e spurgare con azoto per altri cinque minuti.Quindi mescolare. La soluzione deve essere limpida; se è percettibile anche solo una leggera tinta gialla, preparare una nuova soluzione di ferro. Preparare una soluzione di perossido di idrogeno 100 millimolare e mantenerla sul ghiaccio, proteggendola dalla luce a causa del decadimento spontaneo.Utilizzare questa soluzione di perossido di idrogeno solo per circa una o due ore dopo la preparazione. Seguire un eloqua di DPS purificato rapidamente in un bagno d'acqua a temperatura ambiente e mantenere in ghiaccio la centrifuga per 10 secondi a 4.000 GS in una centrifuga da banco pico per precipitare gli aggregati dopo la centrifugazione. Misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro, quindi diluire il DNA lineare da una soluzione madre ad alta concentrazione utilizzando il buffer di reazione 12x per ottenere una concentrazione di 100 nanogrammi per microlitro; pipettare una quantità sufficiente di acqua nei tubi PCR in modo che il volume finale della reazione sia di 12 microlitri.Successivamente, preparare un campione stock di DNA mescolato con DPS in modo che la concentrazione finale di DPS sia di tre micromolari. Pipettare la miscela di DNA-DPS nei tubi PCR. I tubi di controllo ricevono solo DNA; incubare per 15 minuti a temperatura ambiente per consentire al DPS di legarsi al DNA. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di solfato ferroso 2 millimolare per raggiungere la concentrazione desiderata, quindi aggiungere rapidamente un microlitro di soluzione di perossido di idrogeno 100 millimolare per ottenere una concentrazione finale di 10 millimolare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.Per consentire la reazione di degradazione mediata dal Fenton, aggiungere un microlitro di una miscela di SDS al 20% e incubare a 85 gradi Celsius per cinque minuti al fine di interrompere i complessi D-P-S-D-N-A; l'SDS destabilizza il complesso DPS-DNA e previene spostamenti indesiderati del DNA in gel, migliorando così la facilità di quantificazione. Successivamente, incubare sul ghiaccio per un minuto, quindi aggiungere il colorante di carico e caricare su un gel di agarosio per elettroforesi. Colorare il DNA con bromuro di aterio dopo l'elettroforesi, invece che prima. Questo passaggio impedisce all'SDS di interferire con la distribuzione del bromuro di aterio all'interno del gel.I passaggi intermedi della purificazione di DPS analizzati mediante elettroforesi SDS-PAGE sono mostrati qui. La corsia uno è l'estratto privo di cellule. La corsia due è il flusso iniziale della colonna DEAE SPHEROS.La corsia tre è l'EIT della colonna DEAE. La corsia quattro è il surnatante della precipitazione con solfato di ammonio al 60%. La corsia cinque è il campione DPS dopo la precipitazione con solfato di ammonio al 90% e lo scambio di tampone mediante colonna PD 10.La corsia sei contiene le frazioni pure di DPS raggruppate. Dopo la proteina della colonna SP spheros. I marcatori di peso molecolare si trovano nella corsia sette.Le percentuali in fondo a ciascuna corsia indicano la purezza del DPS determinata mediante software di quantificazione delle immagini. Il processo di purificazione del DPS qui mostrato è altamente riproducibile e la purezza proteica è costantemente superiore al 99%. Nessun'altra proteina appare sui gel SDS-PAGE come bande visibili. Il DPS purificato può essere utilizzato in un saggio di protezione del DNA in cui il ferro catalizza la degradazione del perossido di idrogeno attraverso la chimica di Fenton, generando specie radicaliche che danneggiano direttamente il DNA presente nella reazione; risultati rappresentativi sono mostrati in questa figura.Tutte le corsie contengono 100 nanogrammi di DNA lineare di cinque chilobasi; la corsia uno contiene solo DNA, la corsia due contiene DNA con un millimolare di perossido di idrogeno, e la corsia tre contiene DNA con un millimolare di perossido di idrogeno e 166 micromolari di solfato ferroso. Tuttavia, il DNA è stato degradato. Le corsie da quattro a otto contengono DNA con tre micromolari di DPSD demer, un millimolare di perossido di idrogeno e concentrazioni crescenti di ferro da sinistra a destra.È evidente che DPS media la protezione del DNA dalla degradazione ossidativa confrontando le corsie tre e cinque. È inoltre evidente un aumento complessivo della degradazione del DNA con l'aumentare della concentrazione di ferro. I risultati ottenuti tramite il saggio di protezione del DNA possono essere quantificati mediante l'utilizzo di software di elaborazione delle immagini come Image Quant.Questo grafico mostra il risultato di questa quantificazione, mediato su tre saggi. Le barre di errore indicano il complessivo elevato livello di riproducibilità ottenuto. Una volta acquisita la padronanza.Questa tecnica può essere eseguita in circa quattro ore per un numero di campioni pari a 40, consentendo di caratterizzare molte condizioni diverse in parallelo. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di preparare con precisione i reagenti e di cronometrare ogni passaggio nel modo più accurato possibile. Poiché il saggio è molto sensibile ai tempi di incubazione, dopo aver visto questo video si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre una proteina DPS ad alta purezza e caratterizzarla in un saggio in vitro al fine di determinarne l'attività nella protezione del DNA dalla degradazione indotta da specie ossidanti reattive.

application-an-vitro-dna-protection-assay-to-visualize-stress

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

La cellula permeabile reticolante DSP [dithiobis-(succinimidile propionato)] stabilizza le interazioni transienti e...

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

Questo protocollo descrive un metodo per la visualizzazione di un DNA a doppio filamento proteina pausa segnalazione attivato in risposta al danno del DNA e la sua localizzazione durante la mitosi.

Due-e tridimensionale Live Cell Imaging di proteine ​​danno al DNA di risposta

Resistenza allo stress è uno dei tratti distintivi per la longevità ed è conosciuto per essere geneticamente governati. Qui, abbiamo sviluppato un metodo high-throughput imparziale per lo screening di mutazioni che conferiscono resistenza allo stress in cellule ES con cui sviluppare modelli murini per gli studi di longevità.

Approccio genetico in avanti per scoprire la resistenza allo stress geni nei topi - Uno Schermo high-throughput in cellule ES

Presentiamo un piano strategico e un protocollo per identificare le varianti genetiche non codificanti che influenzano il legame del DNA con il fattore di trascrizione (TF). Viene fornito un protocollo sperimentale dettagliato per il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA) e il saggio di precipitazione di affinità del DNA (DAPA) del legame del DNA TF genotipo-dipendente.

Screening per Funzionale non codificante Varianti genetiche Utilizzando Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) e DNA-affinità precipitazioni Assay (DAPA)

Descriviamo qui un protocollo ottimizzato di saggi fluorescenti elettroforetiche Mobility Shift (Femsa) utilizzando purificati SOX-2 proteine ​​insieme con colorante fluorescente marcato sonde di DNA a infrarossi come un caso di studio per affrontare un'importante questione biologica.

Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

I laser sono spesso utilizzati in studi di risposta cellulare al danno del DNA. Tuttavia, essi generano lesioni la cui spaziatura, frequenza, e collisioni con forcine di replicazione sono raramente caratterizzati. Qui, descriviamo un approccio che consente la determinazione di questi parametri con laser localizzato legami crociati interstrand.

Singolo Analisi Molecola di laser localizzati psoraleni addotti

L'obiettivo del presente protocollo è quello di quantificare la riparazione di definiti legami incrociati della DNA-proteina il DNA del plasmide. Lesi plasmidi sono transfected nelle linee cellulari di mammifero destinatario e basso peso molecolare raccolte a più punti di tempo post-transfezione. Cinetica di riparazione del DNA sono quantificati utilizzando primer specifici strand estensione seguita da qPCR.

Un'analisi semplice, rapida e quantitativa per riparazione di misura di legami incrociati della DNA-proteina su plasmidi Transfected nelle cellule di mammifero

Qui, caratterizziamo le risposte di stress proteotossico cellulare nel nematode C. elegans misurando l'attivazione di reporter trascrizionali fluorescenti e analizzando la sensibilità allo stress fisiologico.

Misurazioni delle risposte allo stress fisiologico in C. Elegans

Il presente protocollo evidenzia un metodo modificato per rilevare e quantificare i legami incrociati DNA-proteina (DPC) e le loro modificazioni post-traduzionali (PTM), tra cui l'ubiquitilazione, la SUMOilazione e l'ADP-ribosilazione indotte da inibitori della topoisomerasi e dalla formaldeide, consentendo così lo studio della formazione e della riparazione delle DPC e dei loro PTM.

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

MSH2-MSH6 è responsabile per l'avvio di riparazione di errori di replicazione del DNA. Qui vi presentiamo un approccio transitorio cinetica verso la comprensione di come lavora questa proteina critica. Il rapporto illustra stopped-flow esperimenti per misurare il legame del DNA accoppiati e cinetica ATPasi sottostante MSH2-MSH6 meccanismo d'azione nella riparazione del DNA.

Applicazione di metodi Stopped-flow Cinetica per Indagare sulla Meccanismo d&#39;azione di una proteina di riparazione del DNA

Impara a purificare la proteina Dps da E. coli e valutarne l'effetto protettivo sul DNA contro i danni ossidativi tramite elettroforesi. Questo metodo fornisce un protocollo affidabile per studiare i meccanismi di sopravvivenza batterica.

Applicazione di un

Esplora altri video