Name: Determinazione del microbica extracellulare Enzyme Activity in Acque, Suoli e sedimenti utilizzando High Throughput micropiastre saggi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 23 s
Description: Impara a misurare l'attività enzimatica microbica in acque, suoli e sedimenti con saggi a microplacca. Questo metodo colorimetrico e fluorometrico consente analisi ad alto rendimento per studi di ecologia microbica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

I finanziamenti per gli aspetti di questo lavoro è stato fornito da varie fonti tra cui il Dipartimento dell&#39;Agricoltura degli Stati Uniti specifico Accordo Cooperativo 58-6408-1-595 e la National Science Foundation (premio 1.049.911).

L&#39;analisi colorimetrica di extracellulare Enzyme Activity in terreni e sedimenti 1. Preparazione del substrato e Soluzioni tampone per analisi colorimetriche di Enzyme Activity <ol><li> Preparare H 50 mM tampone acetato (pH 5,0-5,5) mescolando 50 ml di 0,1 M di acido acetico (2,87 ml di acido acetico glaciale in 500 ml di acqua), 150 ml di acetato di sodio 0,1 M, e 200 ml di acqua distillata 2 O. Regolare il pH a 5,0-5,5 con 0.1 M di acido acetico, se necessario. </li><li> Preparare una soluzione di 1 M di idrossido di sodio (NaOH) in H 2 O distillata O. </li><li> Preparare le soluzioni di substrato NP-linked p in 50 mM tampone acetato. Per eseguire il test della fosfatasi preparare 5 mM p NP-fosfato in 50 mM tampone acetato, per saggiare β-glucosidasi preparare 5 mM p NP-β-glucopiranoside, per saggiare NAGase preparare 2 mM pNP-β-N-acetylglucosaminide. Preparare tutte le soluzioni del substrato in sterili da 15 ml o 50 ml provette da centrifuga. Le soluzioni possono essere conservati a 4 ° C per 2-3 settimane. </li></ol> 2. Determinazione di una standard per convertire assorbanza a p NP Concentrazione <ol><li> Preparare soluzioni standard di p-nitrofenolo in 50 mM tampone acetato. Le concentrazioni dovrebbero spaziare 0,025-1 mm. </li><li> Trasferimento tre repliche di 100 ml di ciascuna concentrazione ad una chiara micropiastra a 96 pozzetti. Aggiungere 10 ml di NaOH 1 M e 190 microlitri distillata H 2 O a ciascun pozzetto. </li><li> Record assorbanza a 410 nm usando un lettore di micropiastre. </li><li> Concentrazioni di moltiplicarsi in curva standard di 0.3 per ottenere μmoles p NP 300 per volume di reazione microlitri. Tracciare una curva di assorbanza vs micromol di p NP. La pendenza della curva serve come fattore di conversione (C) che si riferiranno assorbanza a micromol di p NP in ciascuna reazione enzimatica. </li></ol> 3. Condurre il Enzyme Assay <ol><li> Per il suolo, preparare un impasto di ogni campione da dosare in una sterile provetta da centrifuga da 15 ml a Concentrazionezione di circa 1 g / ml -1 usando 50 mM di tampone acetato. Per i sedimenti, aggiungere tampone acetato sufficiente a rendere l&#39;impasto facilmente pipettable. L&#39;esatto volume di slurry necessaria varierà a seconda del numero di enzimi dosati, ma è consigliato un minimo di 5 ml. Vortex ogni impasto fino a quando tutte zolle di terreno o nel sedimento sono dispersi e notare il volume finale. </li><li> Re-vortice ogni slurry e pipettare immediatamente 150 ml in ciascuna delle sei pozzetti su un blocco 96 pozzetti Deepwell (Figura 1). È importante vortice accuratamente e frequentemente per mantenere in sospensione le particelle del terreno. Lasciare almeno due pozzetti per blocco vuoto per servire come controllo substrato. Nota: ritagliare il fine di punte per pipette con le forbici prima di dispensare come fanghi suolo tendono a intasare punte. Preparare un blocco a 96 pozzetti per ciascun enzima da dosare. </li><li> Versare circa 5 ml di tampone acetato in un serbatoio pipetta e usare una pipetta a 8 canali per aggiungere 150 ml di buffer alla last due pozzetti di ciascun campione (questi saranno i controlli tampone campione) e le due pozzetti di controllo substrato (Figura 1) </li><li> Versare circa 10 ml della soluzione di NP-substrato p appropriato in un serbatoio pipetta e usare una pipetta a 8 canali per aggiungere 150 microlitri della soluzione di substrato per i primi quattro pozzetti di ciascun campione e le due pozzetti di controllo substrato (Figura 1). Notare il tempo come la reazione inizia non appena viene aggiunta la soluzione di substrato. </li><li> Incubare le piastre a temperatura ambiente (22 ° C) per 0,5-4 ore. Tempo di incubazione può variare a seconda del livello di attività in campioni e l&#39;enzima da dosare. Per la maggior parte dei terreni e sedimenti, fosfatasi e β-glucosidasi richiedono tempi di incubazione di 0,5-1,5 ore, mentre NAGase e di altri enzimi richiedono tempi di incubazione di&gt; 2 ore. </li><li> Mentre i test sono incubando preparare chiari 96 pozzetti per leggere l&#39;assorbanza. Preparare una micropiastra per ogni blocco Deepwell (vale a dire per ogni enzyme analizzati). Pipettare 10 ml 1 M NaOH e 190 ml di acqua distillata in ciascun pozzetto della micropiastra. Nota: NaOH rallenta la reazione enzimatica e solleva il pH che esalta il colore della NP p rilasciato durante la reazione. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, centrifugare i blocchi da 96 pozzetti a 2,000-5,000 xg per 5 minuti per far sedimentare particelle di terreno. </li><li> Utilizzare una pipetta multicanale a ritirare 100 microlitri di ogni bene, facendo attenzione ad evitare il pellet, e trasferirlo al corrispondente bene preparata chiaro micropiastra a 96 pozzetti. </li><li> Accendere il lettore per micropiastre e configurare il software necessario. Record assorbanza a 410 nm. Se l&#39;assorbanza di un particolare bene è superiore al limite di rilevazione lineare del lettore di piastre, che ben diluire 1:1 con acqua e ri-misura. Se assorbanza è ancora troppo elevato, il test deve essere ripetuto con un tempo di incubazione più breve. </li></ol> 4. Determinazione della massa a vuoto dei Campioni <ol><li> Pipettare 1 ml di ciascuna sampl<html> e impasto in una teglia di alluminio pre-pesate. </li><li> Secco in un forno di essiccazione a 75 ° C per 48 ore e pesare. Sottrarre il peso della vaschetta da questo valore per ottenere la massa secca di terreno o nel sedimento in 1 ml di slurry. Moltiplicare per un fattore di 0,15 per determinare la massa secca del campione nei 150 microlitri aggiunti a ciascun pozzetto nel saggio enzimatico. </li></ol> 5. Calcolo del Enzyme Activity per lavaggio di massa di terreno o nel sedimento <ol><li> Calcola assorbanza finale di ogni campione sottraendo l&#39;assorbanza di controllo campione dalla assorbanza analisi del campione. Se i controlli substrato hanno un elevato assorbimento (circa&gt; 0.060) quindi sottrarre anche quelli. </li><li> Calcola attività enzimatica in μmoles hr -1 g massa secca -1 dall&#39;equazione: </li></ol> L&#39;attività enzimatica = assorbanza finale / (C x tempo di incubazione x campione secco di massa) Analisi fluorescente di extracellulare Enzyme Activity in acque naturali tle &quot;&gt; 1. Preparazione del substrato, Standard e Soluzioni tampone per le analisi fluorimetrica di Enzyme Activity <ol><li> Preparare 200 pM soluzioni di substrati MUB-collegati (ad esempio 4-MUB-β-glucopiranoside, 4-MUB-fosfato, 4-MUB-N-acetil-β-D-glucosaminide) disciogliendo il substrato adatto in sterile (autoclave) distillata H 2 O in sterili da 15 ml o 50 ml provette da centrifuga. Avvolgere i tubi in alluminio per escludere la luce e conservare in frigorifero prima dell&#39;uso. Substrati devono essere stabili per almeno 1 settimana se conservato in questo modo. </li><li> Preparare uno standard MUB facendo una soluzione stock di 100 micron 4 metilumbelliferone in sterile distillata H 2 O. Conservare in frigorifero in ambra o bottiglia stagnola avvolto. Immediatamente prima dell&#39;uso, diluire la soluzione 100 mM stock di 1/10 in H 2 O sterile per ottenere una soluzione di lavoro di 10 pM per saggi enzimatici. </li><li> Preparare una soluzione stock di 100 mM tampone bicarbonato sciogliendo 8,4 g di NaHCO &lt;sub&gt; 3 in 1 LH 2 O e autoclave. Diluire questa soluzione a 1/20 in H 2 O sterile come necessario per ottenere una soluzione di lavoro di 5 mm per saggi enzimatici. </li></ol> 2. Organizzazione di campioni di acqua su un 96-Well Nero micropiastre <ol><li> Organizzare una micropiastra per ciascun enzima seguendo l&#39;esempio illustrato nella Figura 2. Si noti che consenta replica adeguata, standard e controlli, questa procedura può saggiare l&#39;attività di un singolo enzima fino a nove campioni di acqua su una micropiastra a 96 pozzetti nero. </li><li> Versare circa 5 ml del primo campione in un serbatoio pipetta e usare una pipetta a 8 canali per pipette200 microlitri in tutti i pozzetti nella colonna 1 della micropiastra (s). Eliminare i puntali delle pipette usate e ripetere se necessario per ogni campione di acqua per riempire le colonne 1-9. </li></ol> 3. Impostazione di Campione, standard, spegnere, e controlli substrato <ol><li> Impostare i controlli per tenere conto di campioni, standards, substrato e tempra sulla stessa micropiastra nero come i campioni (Figura 2). </li><li> Controlli a campione contengono acqua campione e tampone bicarbonato, e non vengono utilizzati nei calcoli di attività, ma dimostreranno la lettura coerenza in tutto il corso dell&#39;esperimento. I controlli quench consistono di acqua campione e una quantità standard del tag fluorescente e sono utilizzati per misurare la diffrazione di fluorescenza in acqua campione. Substrato e controlli standard sono costituiti da tampone o-substrato collegato o l&#39;etichetta fluorescente norma, rispettivamente, e bicarbonato. </li><li> Versare circa 5 ml di 5 mM tampone bicarbonato in un serbatoio pipetta pulita. Pipettare 50 ml di tampone nei pozzetti da 1 a 9 nelle righe D ed E per formare due replicare pozzetti di controlli a campione per campione. Ha Cambia pipette poi trasferire 200 ml di tampone bicarbonato per pozzi da 10 a 12 nelle righe A e H. </li><li> Ridurre l&#39;illuminazione ambiente attenuando o spegnendo lillum na come standard fluorescente è sensibile alla luce. </li><li> Versare circa 5 ml di 10 mM 4-metilumbelliferone in un serbatoio pipetta pulita. Dispensare 50 ml nei pozzetti da 1 a 12 in fila H, e in pozzi da 1 a 9 in righe G e F per formare tre repliche di controlli tempra per campione e controlli generali standard. O mettere la micropiastra al buio o coprire con un coperchio opaco per ridurre il degrado luce del MUB. </li><li> Accendere il fluorimetro e set-up tutti i software necessari per essere pronto a leggere prima di aggiungere il substrato. Nota: alcuni bulbi fluorometro possono richiedere un tempo di warm-up di 3 minuti o più. </li><li> Versare circa 5 ml di substrato appropriato MUB-linked (ad esempio 4-MUB-fosfato) in un serbatoio pipetta pulita. Utilizzare una pipetta a 12 canali per pipettare 50 ml in pozzetti da 1 a 12 nella riga A, e in pozzi da 1 a 9 nelle righe B e C per formare tre test ripetuti per ogni campione e tre controlli substrato. IMMEDIATAMENTEy passare al punto 4.1, fluorescenza registrazione. </li></ol> 4. Fluorescenza di registrazione <ol><li> Leggere la fluorescenza iniziale subito dopo l&#39;aggiunta del substrato alla micropiastra. Dopo la lettura di fluorescenza, incubare la micropiastra a temperatura ambiente (22 ° C) o al buio o coperto con un coperchio opaco per ridurre il degrado luce di MUB. </li><li> Il tempo di incubazione richiesta per misurare il potenziale massima dell&#39;attività enzimatica in un campione di acqua dipenderà dalla concentrazione dell&#39;enzima all&#39;interno del campione. Poiché questo è sconosciuto prima della analisi è stata completata, la micropiastra dovrà essere letto a diversi intervalli di tempo. Tipicamente, lettura a intervalli di 10-15 minuti nel corso di 1 ora è accettabile per molti enzimi, anche se i campioni con attività molto alta per alcuni enzimi possono picco prima 10 min. </li><li> Continua a leggere la fluorescenza nella micropiastra agli intervalli indicati per almeno 1 ora. Essere sicuri di mantenere la micropiastra coperto o al buio tra la letturas. </li></ol> 5. Calcolo del Enzyme Activity per volume di acqua <ol><li> Per ogni campione in ciascun intervallo di tempo calcolare i: significa fluorescenza campione iniziale (pozzetti D ed E), la fluorescenza del campione finale medio (pozzi AC), la fluorescenza media standard (pozzetti H10-11), e la media estinto controllo fluorescenza (pozzi FG). </li><li> Per ogni intervallo di tempo, calcolare l&#39;attività enzimatica in nmoli hr -1 ml -1 dall&#39;equazione: </li></ol> L&#39;attività enzimatica = (media del campione fluorescenza - media di fluorescenza del campione iniziale) / ((media fluorescenza / 0,5 mol) x forfettari (media placare il controllo di fluorescenza / dire fluorescenza) x forfettari (0,2 ml) x (tempo in ore)) <ol start="3"><li> Esaminare i valori di attività calcolati per ogni passo temporale. Determinare l&#39;attività potenziale finale dal passo temporale con la più alta attività. Se i valori delle attività continuano ad aumentare poi successive fasi temporali possono essere richiesti, se i valori di attività rientrano througHout il corso della corsa, quindi eseguire nuovamente con intervalli di tempo più brevi. Attività Finale è in nmoli di substrato consumato hr -1 ml -1, ma può essere scalata fino a esprimere come μmoles hr -1 L -1. </li></ol>

<ol><li>Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+microbial+cellulose+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Ecology of microbial cellulose degradation.</a> Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+decomposition+over+a+first-order+watershed%3A+mass+loss+as+a+function+of+lignocellulase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).</li>
<li>Dalal, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+organic+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+agronomy%22%5BJournal%5D)">Soil organic phosphorus.</a> Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+allocation+to+extracellular+enzyme+production%3A+a+model+for+nitrogen+and+phosphorus+control+of+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).</li>
<li>Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+p-nitrophenyl+phosphate+for+assay+of+soil+phosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity.</a> Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).</li>
<li>Parham, J. A., Deng, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+quantification+and+characterization+of+%CE%B2-glucosaminidase+activity+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil.</a> Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).</li>
<li>Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soil+heavy+metal+concentrations%2C+microbial+biomass+and+enzyme+activities+in+a+contaminated+grassland+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem.</a> Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).</li>
<li>Olander, L. P., Vitousek, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+soil+phosphatase+and+chitinase+activity+by+N+and+P+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability.</a> Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+salinity+and+nutrient+enrichment+on+microbial+assemblages+in+Louisiana+wetland+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Wetlands%22%5BJournal%5D)">Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments.</a> Wetlands. 29, 277-287 (2009).</li>
<li>Hoppe, H. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+exoenzymatic+activities+in+the+ecology+of+brackish+water%3A+measurements+by+means+of+methylumbelliferyl-substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+ecology+progress+series%22%5BJournal%5D)">Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates.</a> Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).</li>
<li>Somville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+study+of+substrate+specificity+of+exoglucosidase+activity+in+eutrophic+water%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water.</a> Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).</li>
<li>Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorogenic+substrates+for+measuring+enzyme+activity+in+peatlands%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+soil%22%5BJournal%5D)">The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands.</a> Plant and soil. 175, 147-152 (1995).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+analysis+of+riverine+bacterioplankton+production%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+oceanography%22%5BJournal%5D)">Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production.</a> Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).</li>
<li>Marx, M. -C., Wood, M., Jarvis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microplate+fluorometric+assay+for+the+study+of+enzyme+diversity+in+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils.</a> Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).</li>
<li>Jackson, C. R., Weeks, A. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+bacterial+community+structure+in+aquatic+sediments+as+revealed+by+16S+rRNA+gene+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis.</a> Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).</li>
<li>Canion, A. K., Ochs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+population+dynamics+of+freshwater+armored+dinoflagellates+in+a+small+lake+in+Mississippi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+freshwater+ecology%22%5BJournal%5D)">The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi.</a> Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).</li>
<li>Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+soil+enzyme+activity+at+global+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+letters%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale.</a> Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).</li>
<li>Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+enzyme+activities+as+indicators+of+organic+matter+processing+rates+in+a+Lake+Erie+coastal+wetland%5BTitle%5D)+AND+%22Freshwater+biology%22%5BJournal%5D)">Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland.</a> Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).</li>
<li>Jackson, C. R., Vallaire, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+activity+and+decomposition+of+fine+particulate+organic+matter+in+a+Louisiana+cypress+swamp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+north+american+benthological+society%22%5BJournal%5D)">Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp.</a> Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).</li>
<li>Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+changes+with+depth+in+microbial+communities+in+a+tropical+Malaysian+peat+swamp+forest%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest.</a> Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).</li>
<li>Rietl, A. J., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+ecological+restoration+practices+of+prescribed+burning+and+mechanical+thinning+on+soil+microbial+enzyme+activities+and+leaf+litter+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+biology+and+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition.</a> Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).</li>
<li>Smart, K. A., Jackson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+scale+patterns+in+microbial+extracellular+enzyme+activity+during+leaf+litter+decomposition+in+a+stream+and+its+floodplain%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain.</a> Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Determinazione delle attività di una varietà di enzimi extracellulari microbiche in suoli e sedimenti può fornire indicazioni utili in tassi di mineralizzazione dei nutrienti e trasformazione di materia organica 17. Tuttavia, i suoli possono variare nei loro livelli di umidità, quindi è importante standardizzare l&#39;attività di suolo peso secco. Ciò richiede una fase di asciugatura addizionale (tipicamente di due giorni) oltre la semplice misurazione dell&#39;attività enzimatica. Pertanto, a differenza di s...

Microrganismi come batteri e funghi ottengono nutrienti e il carbonio di composti organici complessi attraverso la produzione di enzimi extracellulari. Questi enzimi idrolizzano tipicamente polimeri in subunità più piccole che possono essere presi in cella. Pertanto, a livello ecologico, questi enzimi extracellulari microbici sono responsabili di gran parte della mineralizzazione dei nutrienti e la decomposizione della materia organica che si verifica in ambienti naturali. Enzimi come cellobioidrolasi (CBH) e β-glucosidasi sono importanti per la degradazione della cellulosa e lavorare all&#39;unisono per catalizzare l&#39;idrolisi di cellulosa in glucosio 1,2, che fornisce un substrato di carbonio utilizzabile per l&#39;assorbimento e l&#39;assimilazione microbica. L&#39;enzima fosfatasi rilascia gruppi fosfati inorganici solubili da organofosfati, essenzialmente mineralizzanti fosfato e renderlo disponibile per l&#39;uso da maggior parte degli organismi 3. Altri enzimi, come N-acetilglucosaminidasi (NAGase), sono important in degrado chitina e può fare sia il carbonio e l&#39;azoto disponibile per acquisizione microbica 4. Una delle procedure per il saggio di attività enzimatica extracellulare microbica in ambienti naturali è l&#39;uso di p-nitrofenil artificiale (p NP) substrati collegati, un approccio che è stato originariamente sviluppato per rilevare l&#39;attività della fosfatasi terreno 5. Questo approccio si basa sul rilevamento di un prodotto finale colorato, p-nitrofenolo, che viene rilasciato quando il substrato artificiale viene idrolizzato dall&#39;enzima appropriato. Il p-nitrofenolo può essere successivamente quantificato colorimetro misurando la sua assorbanza a circa 400-410 nm. Questo metodo è stato poi applicato a rilevare altri enzimi come NAGase 6, ed è stato utilizzato in vari studi guardando microbica attività enzimatica extracellulare in terreni e sedimenti 7-9. Un approccio alternativo che era originally sviluppato per valutare l&#39;attività glucosidasi extracellulare in ambienti acquatici 10,11 fa uso di 4-metilumbelliferone (MUB) substrati collegati. Il prodotto finale rilasciato (4-metilumbelliferone) è altamente fluorescente e può essere rilevato utilizzando un fluorimetro con un&#39;impostazione eccitazione / emissione intorno a 360/460 nm. Una varietà di substrati artificiali MUB-legati sono disponibili, permettendo la misurazione fluorimetrica dell&#39;attività di almeno tanti enzimi (ad esempio β-glucosidasi, cellobioidrolasi, Nagase, fosfatasi) come può essere dosati utilizzando la procedura colorimetrica p NP-substrato. Altri enzimi extracellulari microbici, quali la leucina aminopeptidasi proteina-degradanti, possono essere dosati fluorometrically usando 7-ammino-4-metil (COU) substrati collegati. Sia MUB-e substrati COU-legati sono stati utilizzati per determinare l&#39;attività enzimatica in vari campioni terrestri e acquatici 12,13. Mentre gli studi precedenti hanno described micropiastra fluorometrico o colorimetrico approcci per determinare l&#39;attività enzimatica extracellulare 14, c&#39;è la necessità di una chiara presentazione di come condurre tali analisi. Qui mostriamo le procedure per lo svolgimento di tecniche ad alta velocità micropiastra per l&#39;analisi dell&#39;attività enzimatica extracellulare in suoli e sedimenti che utilizzano l&#39;approccio substrati NP-linked p colorimetrica e nelle acque naturali, utilizzando la tecnica di fluorescenza substrati MUB-linked. Ci concentriamo sulla misurazione delle attività di β-glucosidasi, NAGase, e fosfatasi come questi enzimi possono essere legati al carbonio, azoto, fosforo e ciclismo, rispettivamente. Tuttavia, le procedure qui descritte possono essere applicate alla misurazione di altri enzimi extracellulari usando differenti substrati artificiali.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTI E MATERIALI</td></tr><tr><td>Acido</td><td></td><td></td> acetico glaciale <td>Fornitori vari Acetato</td></tr><tr><td></td><td></td> di<td>sodio</td><td>Fornitori vari</td></tr><tr><td>Idrossido</td><td></td><td></td> di sodio <td>Fornitori vari</td></tr><tr><td>p-Nitrofenolo</td><td>Fisher</td><td>BP612-1</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>p-Nitrofenile (pNP)-fosfato</td><td>Sigma</td><td>N3234</td><td>pNP-substrato</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-glucopiranoside</td><td>Sigma</td><td>N7006</td><td>pNP-substrato</td></tr><tr><td>pNP-&#946;-N-acetilglucosaminide</td><td>Sigma</td><td>N9376</td><td>p Substrato NP</td></tr><tr><td>Micropiastre trasparenti a 96 pozzetti</td><td>Fisher</td><td>12-563-301</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Blocchi di pozzetti profondi a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3958</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Piatti di</td><td></td><td></td> pesata in alluminio <td>Fornitori vari</td></tr><tr><td>Provette</td><td></td><td></td> da centrifuga sterili da 15 ml <td>Fornitori vari</td></tr><tr><td>Provette</td><td></td><td></td> <td>da centrifuga sterili da 50 mlFornitori vari</td></tr><tr><td>4-Metilumbelliferone</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilumbelliferil (MUB)-fosfato</td><td>Sigma</td><td>M8883</td><td>substrato MUB</td></tr><tr><td>4-MUB-glucopiranoside</td><td>Sigma</td><td>M3633</td><td>substrato MUB</td></tr><tr><td>4-MUB-N-acetilglucosaminide</td><td>Sigma</td><td>M2133</td><td>substrato MUB</td></tr><tr><td>Bicarbonato</td><td></td> di sodio<td></td><td>Fornitori vari</td></tr><tr><td>Micropiastra nera a 96 pozzetti</td><td>Costar</td><td>3792</td><td></td></tr><tr>Serbatoio <td></td><td></td><td>per pipette</td><td>Fornitori</td></tr><tr> vari<td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Rotore per centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>A-4-81</td><td>Per micropiastre/blocchi</td></tr> <tr><td>a pozzetti profondiLettore di micropiastre</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>Alternative disponibili Fluorimetro</td></tr><tr><td>per micropiastre</td><td>BioTek</td><td>FLx 800</td><td>Alternative disponibili</td></tr><tr><td>Pipettatore</td><td></td><td></td> a 8 canali <td>Vari fornitori</td></tr></tbody></table>

determinazione del microbica extracellulare enzyme activity in acque, suoli e sedimenti utilizzando high throughput micropiastre saggi

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Gran parte del ciclo dei nutrienti e lavorazione del carbonio in ambienti naturali avviene attraverso l&#39;attività degli enzimi extracellulari rilasciati da microrganismi. Così, misurazione dell&#39;attività di questi enzimi extracellulari può dare intuizioni aliquote di processi livello dell&#39;ecosistema, quali la decomposizione della materia organica o azoto e fosforo mineralizzazione. I saggi di attività enzimatica extracellulare nei campioni ambientali tipicamente coinvolgono esponendo i campioni a substrati colorimetrici o fluorimetrici artificiali e il monitoraggio del tasso di idrolisi del substrato. Qui si descrivono i metodi su micropiastra per queste procedure che consentano l&#39;analisi di un gran numero di campioni in un breve lasso di tempo. I campioni vengono lasciati reagire con substrati artificiali entro 96 pozzetti o pozzo profondo blocchi micropiastre, e l&#39;attività enzimatica viene successivamente determinati mediante assorbimento o fluorescenza del prodotto finale risultante utilizzando un tipico Reade micropiastrar o fluorimetro. Tali procedure ad alto rendimento facilitare non solo i confronti tra siti o ecosistemi spazialmente separati, ma anche di ridurre sostanzialmente il costo di tali dosaggi, riducendo i volumi complessivi dei reagenti necessari per campione.

Suoli e sedimenti acquatici in genere hanno apprezzabili livelli di attività enzimatica extracellulare come risultato di comunità microbiche allegate (biofilm) cresce sulla superficie delle particelle. Figura 3 mostra come questa attività cambia a seconda delle dimensioni delle particelle ottenute dal sedimento superficie di un terzo Flusso ordine nel nord del Mississippi, USA. Un precedente studio ha dimostrato che le comunità batteriche sulle particelle di sedimenti da questo flusso possono essere sud...

Procedure su micropiastra sono descritte per l&#39;analisi colorimetrica o fluorimetrica dell&#39;attività enzimatica extracellulare. Tali procedure consentono la rapida saggio di tale attività in un gran numero di campioni ambientali in tempi gestibile.

Determinazione del microbica extracellulare Enzyme Activity in Acque, Suoli e sedimenti utilizzando High Throughput micropiastre saggi

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

L'obiettivo generale della procedura seguente è analizzare rapidamente l'attività enzimatica microbica extracellulare in una varietà di ambienti naturali. Questo viene ottenuto aggiungendo campioni di acqua o sospensioni di suolo in una piastra microtitolazione per ottenere un'adeguata replicazione. Come secondo passaggio, viene aggiunto alle pozzette della piastra microtitolazione un substrato artificiale cromogenico o fluorogenico, che permette lo svolgimento di reazioni enzimatiche. Successivamente, viene misurata l'assorbanza o la fluorescenza al fine di determinare la quantità di prodotto finale rilasciata durante la reazione.I risultati mostrano differenze nell'attività enzimatica extracellulare tra i campioni in base all'assorbanza o alla fluorescenza della reazione finale. Oggi dimostreremo come misurare l'attività enzimatica extracellulare in ambienti naturali. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nell'ecologia microbica, come i tassi di trasformazione della materia organica e la mineralizzazione dei nutrienti in suoli, sedimenti e acque. In generale, le persone alle prime esperienze con questo metodo possono incontrare difficoltà nella separaz

determination-microbial-extracellular-enzyme-activity-waters-soils

Research

Ricerca

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Questo protocollo descrive uno schermo ad alta velocità per l'attività cellulosolitici da una libreria metagenomica espressa in Escherichia coli. Lo schermo è soluzione basata e altamente automatizzata, ed utilizza una pentola chimica nel 384 micropiastre bene con la lettura finale come una misura di assorbanza.

Una schermata di High Throughput per Biomining attività Cellulase da librerie metagenomiche

Descriviamo un basso costo, metodo elevato throughput per lo screening per l'attività endoglucanase fungine...

Throughput Screening elevati di attività Endoglucanase fungine in Escherichia coli</em

Questo video mostra un test per lo screening di composti antimicrobici che eliminano efficacemente i biofilm utilizzando una piastra a pioli. La metodologia monitora lo stato metabolico del biofilm dopo il trattamento con composti antimicrobici, facilitando la determinazione della concentrazione minima di eradicazione del biofilm.

Un saggio del biofilm su piastra a pioli per lo screening di agenti antibatterici

Per misurare i potenziali tassi di suolo attività enzimatiche extracellulari, supporti sintetici che sono destinate a un colorante fluorescente sono aggiunte a campioni di terreno. L'attività enzimatica è misurata come il colorante fluorescente viene rilasciato dal substrato mediante una reazione enzimatica catalizzata, se superiore fluorescenza indica più la degradazione del substrato.

High-throughput fluorometrica misura del potenziale di suolo extracellulari enzimi Attività

Qui descriviamo un saggio fenotipico applicabile agli schermi ad alta produttività /alto contenuto di RNA sintetico (siRNA), composto chimico e librerie mutanti Mycobacterium tuberculosis. Questo metodo si basa sul rilevamento di Mycobacterium tuberculosis con etichetta fluorescente all'interno di una cellula ospite etichettata fluorescentmente utilizzando la microscopia confocale automatizzata.

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Qui, presentiamo protocolli per selezionare e caratterizzare rapidamente gli enzimi per l'attività antimicrobica. Il saggio di diffusione su microvetrini e il saggio di rilascio del colorante utilizzano substrati batterici target per la valutazione qualitativa e quantitativa dell'attività enzimatica.

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

Questo lavoro presenta un metodo di screening ad alto rendimento utilizzando un sistema di screening enzimatico genetico universale che può essere teoricamente applicato a oltre 200 enzimi. Qui, il singolo sistema di screening identifica tre diversi enzimi (lipasi, cellulasi e fosfatasi alcalina) semplicemente cambiando il substrato utilizzato (p-nitrofenil acetato, p-nitrofenil-β-D-cellobioside e fenil fosfato).

Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

Viene descritto un test ad alto rendimento per lo screening enzimatico. Questo kit di saggi multiplexato e pronto all'uso comprende substrati prescelti diC hromogenic Polymer Hydrogel (CPH) e substrati di C insolubileC iomogenico Biomass (ICB). Gli enzimi bersaglio sono gli endoenzimi che degradano i polisaccaridi e le proteasi.

High-throughput screening degli enzimi carboidrati di degradazione Utilizzando Novel insolubile Chromogenic Substrate Assay Kit

Vi presentiamo un protocollo per lo screening rapido di campioni ambientali per sideroforo potenziale che contribuiscono alla biodisponibilità di micronutrienti e fatturato nei sistemi terrestri.

Sideroforo high-throughput Screening da campioni ambientali: tessuti, Bulk terreni e suoli rizosfera della pianta

I saggi di interazione co-cultura presentati in questo protocollo sono economici, ad alta produttività e semplici. Questi saggi possono essere utilizzati per osservare le interazioni microbiche in co-cultura, identificare i modelli di interazione e caratterizzare il potenziale inibitorio di un ceppo microbico di interesse contro i patogeni umani e ambientali.

Analisi di cocultura ad alta produttività per l'analisi delle interazioni microbiche

Impara a misurare l'attività enzimatica microbica in acque, suoli e sedimenti con saggi a microplacca. Questo metodo colorimetrico e fluorometrico consente analisi ad alto rendimento per studi di ecologia microbica.

Determinazione del microbica extracellulare Enzyme Activity in Acque, Suoli e sedimenti utilizzando High Throughput micropiastre saggi (Video) | JoVE Journal

Determinazione del microbica extracellulare Enzyme Activity in Acque, Suoli e sedimenti utilizzando High Throughput micropiastre saggi

Esplora altri video