Determinazione del microbica extracellulare Enzyme Activity in Acque, Suoli e sedimenti utilizzando High Throughput micropiastre saggi

L'obiettivo generale della seguente procedura è quello di analizzare rapidamente l'attività degli enzimi extracellulari microbici in una varietà di ambienti naturali. Ciò si ottiene aggiungendo campioni di acqua o fanghi di terreno alla micropiastra per produrre un'adeguata replicazione Come seconda fase, viene aggiunto un substrato colorimetrico artificiale o fluorometrico ai pozzetti della micropiastra, che consente il verificarsi di reazioni enzimatiche. Successivamente, viene misurata l'assorbanza o la fluorescenza per determinare la quantità di prodotto finale rilasciata durante la reazione.

I risultati mostrano differenze nell'attività enzimatica extracellulare tra i campioni in base all'assorbanza o alla fluorescenza della reazione finale. Oggi dimostreremo come misurare l'attività degli enzimi extracellulari in ambienti naturali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'ecologia microbica, come i tassi di acqua nella lavorazione della materia organica e la mineralizzazione dei nutrienti nei suoli, nei sedimenti e nelle acque. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della difficoltà di separare le particelle dalla soluzione di reazione, soprattutto quando si analizzano un gran numero di campioni.

Una dimostrazione visiva di questa procedura è fondamentale in quanto il layout di una lastra può essere difficile da imparare e l'esecuzione di misurazioni in più fasi temporali può rendere questa procedura più impegnativa. L'analisi chole metrica dell'attività enzimatica extracellulare per terreni e sedimenti inizia con la preparazione del tampone del substrato e delle soluzioni standard come descritto nel protocollo di testo per il suolo, preparare un impasto di ciascun campione da analizzare in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri. Aggiungere una concentrazione di circa un grammo per millilitro utilizzando un tampone acetato da 50 millimolari per sedimenti.

Aggiungere abbastanza tampone di acetato per rendere il liquame facilmente pipee. Il volume esatto di liquame necessario varierà in base al numero di enzimi analizzati, ma si raccomanda un minimo di cinque millilitri. Agitare ogni liquame fino a quando tutti i grumi di terreno o sedimenti si sono dispersi.

E notate il volume finale. Agganciare l'estremità dei puntali delle pipette con le forbici prima del pipettaggio. Poiché i fanghi di terreno tendono a ostruire le punte, rimettere a vorticare ogni liquame e pipettare immediatamente 150 microlitri in ciascuno dei sei pozzetti.

Su un blocco di pozzi profondi 96 pozzi. È importante fare vortice accuratamente e frequentemente. Per mantenere le particelle di terreno in sospensione, lasciare vuoti almeno due pozzetti per blocco che fungano da controllo del substrato.

Preparare 1 96. Blocco del pozzo per ogni enzima da analizzare. Versare circa cinque millilitri di tampone acetato in un serbatoio per pipette e utilizzare un pipettatore a otto canali per aggiungere 150 microlitri di tampone agli ultimi due pozzetti di ciascun campione.

Per i controlli del tampone del campione e per i due pozzetti di controllo del substrato. Versare circa 10 millilitri della soluzione appropriata di p nitro finocchio o substrato PNP in un serbatoio per pipette e utilizzare un pipettatore a otto canali per aggiungere 150 microlitri della soluzione del substrato ai primi quattro pozzetti di ciascun campione e ai due pozzetti di controllo del substrato. Notare il tempo in cui inizia la reazione, non appena viene aggiunta la soluzione di substrato.

Incubare le piastre a temperatura ambiente per 0,5-4 ore. Il tempo esatto di incubazione varia a seconda del livello di attività nei campioni e dell'enzima da analizzare. Durante l'incubazione dei saggi, preparare una micropiastra trasparente a 96 pozzetti.

Per ogni blocco di pozzetti profondi per la lettura della pipetta di assorbanza, 190 microlitri di acqua distillata e 10 microlitri di idrossido di sodio molare in ciascun pozzetto della micropiastra. L'idrossido di sodio rallenta la reazione enzimatica e aumenta il pH, che migliora il colore del PNP rilasciato durante la reazione dopo l'incubazione. Centrifugare i 96 blocchi di pozzetti a una velocità compresa tra 2000 e 5.000 volte G per cinque minuti per pellettare le particelle di terreno.

La rimozione del liquido senza disturbare il pellet può essere una sfida. Inizialmente è necessario evitare di utilizzare troppo campione di terreno. Assicurati di centrifugare abbastanza a lungo e usa un movimento attento ma sicuro per prelevare il liquido.

Utilizzare una pipetta multicanale per prelevare 100 microlitri da ciascuna. Beh, facendo attenzione ad evitare il pellet. Trasferire il liquido nel pozzetto corrispondente su una micropiastra trasparente a 96 pozzetti preparata, accendere il lettore di micropiastre e impostare l'assorbanza di record software necessaria a 410 nanometri dopo aver determinato la massa secca dei campioni come descritto nel protocollo di testo, calcolare l'assorbanza finale di ciascun campione sottraendo l'assorbanza di controllo del campione dall'assorbanza del test del campione.

Se i controlli del substrato hanno un'elevata assorbanza superiore a 0,060, sottrarli. Procedi anche a calcolare l'attività enzimatica in micromoli all'ora per grammo di massa secca usando questa equazione. Dopo aver organizzato una micropiastra nera per ogni enzima seguendo l'esempio mostrato nel protocollo di testo, versare circa cinque millilitri del primo campione d'acqua in un serbatoio di pipetta e utilizzare un pipettatore a otto canali per pipettare 200 microlitri in tutti i pozzetti.

Nella prima colonna della micropiastra, scartare i puntali delle pipette usati e ripetere l'operazione secondo necessità per ciascun campione d'acqua per riempire le colonne da uno a nove. Impostare i controlli per tenere conto dei campioni, degli standard, del substrato e della tempra sulla stessa micropiastra nera dei campioni. I controlli del campione contengono acqua campione e tampone bicarbonato e non vengono utilizzati nei calcoli dell'attività, ma dimostreranno la coerenza della lettura nel corso dell'esperimento.

I controlli di quench sono costituiti da acqua campione e da una quantità standard di tag fluorescente e vengono utilizzati per misurare la diffrazione della fluorescenza. Nell'acqua campione, il substrato e i controlli standard sono costituiti rispettivamente dal substrato collegato o dal tag fluorescente standard e dal tampone bicarbonato. Versare circa cinque millilitri di tampone bicarbonato da cinque millimolari in un serbatoio della pipetta pulito.

Pipettare 50 microlitri di tampone nei pozzetti della micropiastra da uno a nove nelle file d ed e per formare due, replicare i pozzetti dei controlli del campione per cambiare i puntali della pipetta, quindi trasferire 200 microlitri di tampone bicarbonato nei pozzetti da 10 a 12 nelle file A e H.Sebbene la luce sia mantenuta brillante in questa dimostrazione per scopi di ripresa, L'illuminazione ambientale deve essere ridotta attenuando o spegnendo le luci, poiché lo standard fluorescente è sensibile alla luce. Versare circa cinque millilitri di 10 micromolari, quattro metilmone o MUB in un serbatoio di pipetta pulito, pipettare 50 microlitri nei pozzetti della micropiastra da uno a 12 in fila H.Quindi pipettare 50 microlitri in pozzetti da uno a nove nelle file G e F per formare tre repliche dei controlli di quench per campione e dei controlli standard complessivi. Posizionare la micropiastra al buio o coprirla con un coperchio opaco per ridurre la degradazione della luce MUB, accendere il fluorimetro e impostare il software necessario per essere pronti a leggere prima di aggiungere il substrato.

Per circa cinque millilitri del substrato rivestito di MUB appropriato in un serbatoio di pipetta pulito, utilizzare un pipettatore a 12 canali per pipettare 50 microlitri nei pozzetti per micropiastre da uno a 12 nella fila A e nei pozzetti da uno a nove nelle file B e C per formare tre, replicare i saggi per ciascun campione e tre controlli del substrato procedere immediatamente alla registrazione della fluorescenza. Leggere la fluorescenza iniziale immediatamente dopo l'aggiunta del substrato alla micropiastra dopo la lettura. Fluorescenza: incubare la micropiastra a temperatura ambiente, al buio o coperta con un coperchio opaco.

Per ridurre la degradazione della luce di MUB. Il tempo di incubazione necessario per misurare la massima attività potenziale dell'enzima dipenderà dalla concentrazione dell'enzima all'interno di un campione. Poiché questo non è noto, prima che il campione venga analizzato, una micropiastra dovrà essere letta in più fasi.

Per la maggior parte degli enzimi, sono appropriati intervalli di 10-15 minuti nel corso di un'ora, anche se alcuni campioni con alte concentrazioni raggiungeranno il picco prima di 10 minuti. Continua la lettura di fluorescenza nella micropiastra agli intervalli designati per almeno un'ora. Assicurati di tenere la micropiastra coperta o al buio tra una lettura e l'altra.

Per ciascun campione a ciascun intervallo di tempo, calcolare la fluorescenza iniziale media del campione, la fluorescenza finale media del campione, la fluorescenza standard media e la fluorescenza media di controllo del quench per ciascun intervallo di tempo. Calcola l'attività enzimatica in m all'ora per millilitro. Utilizzando l'equazione trovata nel protocollo di testo.

Esaminare i valori di attività calcolati per ogni fase temporale, determinare l'attività potenziale finale dalla fase temporale con l'attività più alta. Se i valori dell'attività continuano ad aumentare, potrebbero essere necessari passaggi temporali successivi. Se i valori dell'attività diminuiscono nel corso della corsa, eseguire nuovamente l'esecuzione con intervalli di tempo più brevi.

I suoli e i sedimenti acquatici hanno tipicamente livelli apprezzabili di attività enzimatica extracellulare a causa delle comunità microbiche attaccate che crescono sulla superficie delle particelle. Questa figura mostra come questa attività cambia a seconda della dimensione delle particelle ottenute dal sedimento superficiale di un corso d'acqua di terzo ordine nel Mississippi settentrionale. USAUNO studio precedente ha dimostrato che le comunità batteriche sulle particelle di sedimento di questo corso d'acqua possono essere separate in tre gruppi distinti sulla base dell'analisi molecolare della loro struttura comunitaria.

Quelli su particelle da 0,063 millimetri, quelli su particelle da 0,1, 2, 5, 0, 0,25 e 0,5 millimetri e quelli su particelle da un millimetro. L'analisi dei modelli nell'attività degli enzimi extracellulari supporta questa conclusione, con la fosfatasi che è simile su particelle di 0,1, 2, 5, 0,25 e 0,5 millimetri, ma molto più alta su frazioni di uno e 0,063 millimetri quando misurata utilizzando la tecnica del substrato legato al PNP. Altri enzimi come il beta glucco e l'n AGA, mostrano picchi simili sulle particelle più fini, ma non sono elevati su particelle di un millimetro.

Evidenziando il fatto che enzimi diversi possono mostrare diverse distribuzioni ambientali e queste possono essere chiarite utilizzando questo test. Le barre di errore relativamente basse mostrano che i saggi metrici dell'attività enzimatica sui sedimenti sono riproducibili e quindi suscettibili di analisi statistica. Quando si confrontano campioni diversi e ambientali, le acque naturali tendono ad avere un'attività enzimatica extracellulare inferiore per millilitro rispetto ai terreni o ai sedimenti per grammo.

Pertanto, dovrebbero essere analizzati metricamente la flora utilizzando substrati collegati a MUB. Questa figura mostra come l'attività degli enzimi, fosfatasi, beta, glucco e NGA varia con la profondità. In un lago poco profondo nel nord del Mississippi, negli Stati Uniti, il lago è noto per essere povero di nutrienti, il che è suggerito anche dall'attività relativamente alta della fosfatasi e degli enzimi che i microrganismi producono per acquisire fosfato dai composti organici.

Per tutti e tre gli enzimi, i campioni di analisi raccolti sulla superficie dell'acqua e a 50 centimetri di profondità hanno mostrato un'attività simile. Mentre l'attività era elevata nel campione di 100 centimetri, il campione è stato essenzialmente prelevato dall'interfaccia del sedimento d'acqua e la presenza di particelle di sedimento nel campione probabilmente spiega la maggiore attività osservata nel campione, in particolare per il beta glucco e gli n AGA. Come per i substrati PNP, le barre a basso errore mostrano che anche con solo tre letture replicate, la riproducibilità dei saggi fluorimetrici utilizzando substrati MUB è elevata.

Si noti che le unità di misura dell'attività enzimatica del campione d'acqua sono inali del substrato consumato, mentre quelle dell'attività enzimatica sulle particelle di sedimento sono espresse in micromoli di substrato consumato, anche se la dimensione per unità è comparabile. Ciò evidenzia il fatto che i suoli e i sedimenti tendono ad avere un'attività extracellulare molto più elevata rispetto alle acque naturali. Dimostra inoltre la maggiore sensibilità della tecnica del substrato collegato a MUB e la necessità di utilizzare questa tecnica per analizzare l'attività enzimatica extracellulare nei campioni d'acqua.

Questa tecnica può essere utilizzata per analizzare nove campioni d'acqua per un massimo di enzimi in poco più di un'ora, mentre si tenta questa procedura per terreni e sedimenti. È importante utilizzare un materiale massiccio noto in modo che l'attività possa essere espressa in base al peso secco. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare l'attività degli enzimi extracellulari e una varietà di ambienti naturali utilizzando tecniche metriche a colori o metriche inferiori.