Name: Rapid High Throughput amilosio Determinazione in liofilizzati campioni dei tuberi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-14T21:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Scopri un metodo colorimetrico ad alto rendimento per determinare le proporzioni di amilosio e amilopectina nell'amido di patata. Questa tecnica supporta i programmi di miglioramento genetico per varietà più nutrizionali.

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Finanziamento per questa ricerca è stato fornito in parte dal Programma di Ricerca Associate USDA-ARS e il Comitato Crop Germoplasma USDA.

1. Determinazione amilosio da Potato Starch Tuber <ol><li> Sbucciare e tagliare tuberi freschi a dadini. </li><li> Mettere cubetti di patate in piccoli sacchetti marroni e conservare tutta la notte a -80 ° C. </li><li> Trasferimento cubetti di patate alle borse di nylon e per liofilizzazione. </li><li> Dopo liofilizzato, macinare il campione di patate in polvere usando mortaio e pestello o un Wiley Mill. </li><li> In una provetta da 50 ml, aggiungere 20-30 mg dell &#39;, campione di tubero terra liofilizzato. </li><li> Preparare una soluzione al 45% (w / v) di acido perclorico (24.4 ml della miscela del 60% di acido perclorico e 25,6 ml di acqua ultra-pura. </li><li> Aggiungere 500 ml di 45% (w / v) di acido perclorico e scuotere o agitare per disperdere i granuli di amido. </li><li> Dopo un periodo di quattro minuti di incubazione a temperatura ambiente, aggiungere 16 ml di acqua ultra-pura alla soluzione e mescolare nel vortex. </li><li> Dopo materiale non solubile è depositata sul fondo della provetta (7-10 min dopo), trasferire 40 microlitri della soluzione di micropiastra (evitando il pipettaggio di eventuali particelle). </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione di iodio (2 g di KI + 1 g I 2 in 900 ml di acqua ultra-pura) e mescolare il campione con una pipetta. </li><li> Leggere l&#39;assorbanza a 550 nm e 620 nm immediatamente. </li><li> Determinare la percentuale di amilosio dopo Confrontando il rapporto amilosio / amilopectina di ciascun campione (620 nm nm/550 assorbanza) con una curva standard generata da soluzioni amilosio e amilopectina in un intervallo di concentrazioni. Tale procedura verrà descritto successivamente. Leggi il vuoto (soluzione di iodio e acido perclorico) insieme con i campioni di prova. Usa oscurato i dati per le analisi. </li></ol> 2. Curve amilosio / amilopectina <ol><li> In tubi separati pesano 12,5 mg di amilosio e 12,5 mg di amilopectina. </li><li> Aggiungere a ciascuna provetta 5 ml di 45% (w / v) di acido perclorico e sciogliere completamente. </li><li> Per ciascuna delle soluzioni (amilosio e amilopectina), portare a volume finale di 50 ml con acqua ultra-pura. </li><li> Mescolare 6.25ml di amilosio stock a partire dal passaggio precedente con 18,75 ml di acqua ultra-pura. Questo farà una soluzione amilosio 6,25 mg / ml. </li><li> Ripetere la procedura per la soluzione amilopectina. </li><li> Utilizzando il amilosio e amilopectina soluzioni standard da passi 2.4 e 2.5, preparare la percentuale standard amilosio che sono 0-100% amilosio (100-0% amilopectina) ad un volume finale di 5 ml per creare la curva standard in intervalli di 10%. Ad esempio, per preparare: L&#39;amilosio / 100% Standard amilopectina 0%, pipetta da 5 ml di soluzione amilopectina. L&#39;amilosio / 90% standard di amilopectina del 10%, si combinano 0,5 ml di amilosio e amilopectina 4,5 ml di soluzioni. L&#39;amilosio / 80% standard di amilopectina 20%, si combinano 1,0 ml di amilosio e amilopectina 4,0 ml di soluzioni. L&#39;amilosio / 70% standard di amilopectina 30%, si combinano 1,5 ml di amilosio e amilopectina 3,5 ml di soluzioni. L&#39;amilosio / 60% standard di amilopectina del 40%, si combinano 2,0 ml di amilosio e amilopectina 2,0 ml di soluzioni. L&#39;amilosio 50%/ 50% standard di amilopectina, combinare 2.5 amilosio ml e 2,5 ml di soluzioni di amilopectina. L&#39;amilosio / amilopectina 40% Standard 60%, combinano 3,0 ml di amilosio e amilopectina 2,0 ml, e così via). </li><li> Trasferire 40 ml di ciascuna miscela standard per micropiastra. Includere un pozzo con 40 microlitri 45% (w / v) di acido perclorico come il vuoto. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione di iodio (2 g di KI + 1 g I 2 in 900 ml di acqua ultra-pura) e mescolare ogni campione (compreso il bianco) pipettando. </li><li> Per saperne di assorbanza a 550 nm e 620 nm immediatamente e calcolare il rapporto amilosio / amilopectina per ciascuna concentrazione. </li></ol>

<ol><li>Composition Hoover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((molecular+structure%2C+and+physicochemical+properties+of+tuber+and+root+starches%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr%22%5BJournal%5D)">molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review.</a> Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).</li>
<li>Bertoft, E., Blennow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Potato+Starch%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Potato+Chemistry+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Structure of Potato Starch.</a> Advances in Potato Chemistry and Technology. , 1st ed, Elsevier Ltd. 83-98 (2009).</li>
<li>Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+amylose+screening+in+maize+starches+from+exotic+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds.</a> Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).</li>
<li>Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+amylose+determination+methods+and+the+development+of+a+dual+wavelength+iodine+binding+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique.</a> Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).</li>
<li>Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+estimation+of+the+amylose+amylopectin+ratio+in+small+amounts+of+tuber+and+leaf+tissue+of+the+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Potato+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato.</a> Potato Res. 31, 241-246 (1988).</li>
<li>Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShannon%2C+JC+%22Starch%22">Starch</a>. , 3rd ed, Elsevier Inc. 23-82 (2009).</li>
<li>Haase, N. U., Plate, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+potato+starch+in+relation+to+varieties+and+environmental+factors%5BTitle%5D)+AND+%22St%C3%A4rke%22%5BJournal%5D)">Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors.</a> Stärke. 48 (5), 167-171 (1996).</li>
<li>Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+on+the+size+distribution+and+amylose%2Famylopectin+ratio+in+potato+starch+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Pot.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules.</a> Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).</li>
<li>Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+to+measure+amylose+in+cereal+starches+and+flours+with+concanavalin+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereal+Sci%22%5BJournal%5D)">A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A.</a> J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).</li>
<li>Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+amylose+content+of+starches+after+precipitation+of+amylopectin+by+concanavalin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Starch%22%5BJournal%5D)">Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A.</a> Starch. 42, 302-305 (1990).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Contenuto di amilosio nei tuberi di patata varia tipicamente 20-35% 7,8. Se la maggior parte dei valori sono fuori di questo intervallo, considerare questi possibili errori: 1) i dati grezzi sono stati usati al posto dei dati blanking per la costruzione della curva standard amilosio / amilopectina; 2) i dati grezzi sono stati usati al posto dei dati blanking per la determinazione del amilosio / rapporti di amilopectina dai campioni di patate, oppure 3) l&#39;acqua utilizzata per l&#39;analisi non era abbastan...

Circa il 80% del peso fresco di un tubero di patata è acqua, quasi tutta la materia secca restante è amido 1. La maggior parte dell&#39;amido (70%) è costituito da amilopectina, mentre il resto è amilosio. Il rapporto tra amilosio e amilopectina è la proprietà più importante che influenza le proprietà fisiche di amido. Amilosio è una catena alfa 1-4 glucosio lineare, mentre l&#39;amilopectina è un lineare alfa 1-4 catena con alfa 1-6 rami 2. Metodi quali iodio vincolante, calorimetria a scansione differenziale (DSC), dimensioni elevate prestazioni esclusione cromatografia (HPSEC) e interazioni concanavalina A sono stati sviluppati per la determinazione dell&#39;amido in diverse specie coltivate 3,4. Ogni protocollo richiede competenze e attrezzature speciali, rendendo difficile scalare fino a quantificare i numerosi campioni alla volta. Il metodo che presentiamo qui è un protocollo modificato da Hovenkamp-Hermelink et al. 5 che è una lunghezza d&#39;onda dual vincolante iodiometodo basato sulla granuli di amido colorati. I vantaggi di questo metodo rispetto altri includono la determinazione amilosio da amido greggio purificandolo e l&#39;utilizzo del sistema doppia lunghezza d&#39;onda per aumentare la precisione del metodo 4,6.

<table><tbody><tr><td colspan="4"> Reagenti</td></tr><tr><td>Amilosio </td><td>Sigma</td><td>859656</td><td></td></tr><tr><td>Amilopectina </td><td>Sigma</td><td>A8515</td><td></td></tr><tr><td>Acido perclorico 60%</td><td>Sigma</td><td>311413</td><td>Molto pericoloso per la pelle e gli occhi</td></tr><tr><td>Iodio</td><td>Sigma</td><td>23214TD</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di potassio</td><td>Sigma</td><td>08625JE</td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>Bio Tek</td><td>ELx800</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid high throughput amilosio determinazione in liofilizzati campioni dei tuberi

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

Questo protocollo descrive un alto attraverso mettere metodo colorimetrico che si basa sulla formazione di un complesso tra iodio e catene di molecole di glucosio in amido. Iodio forma complessi sia con amilosio e amilopectina all&#39;interno di lunghe catene. Dopo l&#39;aggiunta di iodio ad un campione di amido, il massimo assorbimento di amilosio e amilopectina avviene a 620 e 550 nm, rispettivamente. Il rapporto amilosio / amilopectina può essere stimato dal rapporto tra i valori di assorbanza 620 e 550 nm e confrontandoli con una curva standard in cui specifici noto concentrazioni sono tracciati rispetto ai valori di assorbimento. Questo alto rendimento, metodo economico è affidabile e riproducibile, permettendo la valutazione di grandi popolazioni di cloni di patata.

La curva standard costruita dati tranciati di diverse soluzioni di concentrazione di amilosio / amilopectina mostra rapporti di assorbanza approssimativi nell&#39;intervallo da 0,7 1.6 (Tabella 1). Una linea di tendenza di regressione lineare da questi dati viene poi utilizzata per dedurre contenuto di amilosio in liofilizzati campioni di patate (Figura 1). L&#39;ambiente di produzione vegetale ha qualche effetto sul contenuto di amilosio del tubero di patat...

Rapid High Throughput amilosio Determinazione in liofilizzati campioni dei tuberi

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare in modo ad alto rendimento le proporzioni relative di AMLO e amilopectina. Nell'amido dei tuberi di patata, un amido ricco di AMLO è desiderabile a causa della sua minore digeribilità. Le patate con un contenuto elevato di amido AMLO presentano un indice glicemico più basso e un contenuto di fibre più alto.Questa tecnica viene dimostrata da Philip Smith, uno studente universitario presso l'Università del Wisconsin di Madison. Nel nostro laboratorio, siamo interessati all'ibridazione di varietà di patate più nutrienti. Un modo per farlo è aumentare il contenuto di AMLO nell'amido di patata.L'amido ad alto contenuto di AMLO è più nutriente perché ha un indice glicemico più basso e, in questo saggio, abbiamo sviluppato una procedura che ci permette di analizzare un elevato numero di campioni in modo relativamente rapido; si tratta di un saggio ripetibile, ad alto rendimento e poco costoso. Questo saggio è una modifica di una procedura di colorazione con iodio. È un saggio colorimetrico e può essere eseguito utilizzando una piastra a 96 pozzetti; per questo metodo si utilizzano tuberi di patata freschi, tagliati in cubetti di circa un centimetro di lato, scartando le parti contenenti la buccia.Un taglia patatine fritte permette di eseguire questo passaggio in modo efficiente. I cubetti vengono collocati in un sacchetto etichettato. Utilizziamo calzini di nylon simili a quelli usati nei negozi di scarpe.Sono economici e permettono ai campioni di asciugarsi rapidamente e in modo uniforme nel liofilizzatore. I sacchetti di nylon contenenti i campioni vengono inseriti in un sacchetto di carta e congelati durante la notte a meno 80 gradi C. I campioni congelati vengono rimossi dal sacchetto di carta e collocati nel liofilizzatore. Con il nostro liofilizzatore.Sono necessari circa cinque giorni per asciugare completamente i campioni. Una volta asciutti i cubetti, sono pronti per essere lavorati. I cubetti di patata essiccati vengono finemente macinati utilizzando un mulino Wiley o un motore con pestello.I cubi o la polvere possono essere conservati fino al momento della lavorazione. Tuttavia, assicurarsi di sigillarli in sacchetti di plastica o contenitori per impedire che assorbano umidità. La polvere viene posta in un sacchetto di plastica per la conservazione, in attesa di eseguire i saggi AMLO.Una bilancia analitica viene utilizzata per pesare circa 20 milligrammi di polvere di patata, che vengono quindi posti in un tubo di plastica da 50 ml. Campioni con peso inferiore a 20 milligrammi o superiore a 30 milligrammi non forniscono risultati affidabili per rendere l'amido solubile. A ciascun tubo viene aggiunto 500 microlitri di acido perclorico al 45%.Attenzione quando si lavora con acido perclorico: lavorare in una cappa aspirante e utilizzare dispositivi di protezione individuale. Dopo un periodo di incubazione di quattro minuti, il campione viene diluito con 16 millilitri di acqua Milli Q mescolando su un vortex. Signore, dopo che il materiale non solubile si è depositato sul fondo del tubo, trasferire 40 microlitri del liquido nella piastra microtitolatrice.Attenzione a non trasferire alcun materiale non solubile. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di iodio al campione e mescolare delicatamente mediante pipetta. Assicurarsi che non rimangano bolle d'aria nel campione o sulle pareti della pozzetta.Se si formano bolle d'aria, battere leggermente la piastra sul banco per eliminarle. Posizionare la piastra micrometrica sul lettore di piastre e misurare l'assorbanza di ogni campione a 550 nanometri e 620 nanometri. Una volta ottenuti i risultati dal lettore di piastre, possiamo confrontare i dati con la curva standard e determinare il rapporto AMLO/amilopeptina nel campione di amido, come indicato nella tabella uno.Questo è un output tipico della curva standard come spiegato nel protocollo. Nella figura uno, i rapporti di assorbanza sono riportati in grafico e viene calcolata una retta di regressione per la determinazione dell'AMLO nei campioni di patata. Durante la costruzione della curva standard, ogni punto della curva deve corrispondere al valore di assorbanza del campione con concentrazione nota di AMLO.Dopo aver sottratto il valore di assorbanza del bianco. Quando si calcola il valore di un campione sconosciuto, sottrarre anche il valore di assorbanza della tabella del bianco. Due. Questo è un tipico risultato del contenuto di AMLO nei tuberi di patata.Utilizzando questo metodo COLORIMETRICO, abbiamo impiegato questo saggio nel nostro laboratorio per determinare i contributi relativi del genotipo e dell'ambiente al rapporto AMLO amilopectina nell'amido di patata. Speriamo infine di sviluppare marcatori molecolari associati all'amido e alla patata con elevato contenuto di AMLO, nonché di sviluppare germoplasma che gli allevatori possano utilizzare per ottenere varietà di patate ad alto contenuto di amilosio.

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